Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo genético y neurológico, como durante el desarrollo postnatal. La principal ventaja de esta técnica es que es una técnica sencilla con un dispositivo casero. La demostración visual de este método es fundamental porque la realización de inyecciones dirigidas en el cerebro requiere una atención total a los detalles.

Para empezar, haga un soporte para usar cachorros neonatos en un aparato estereotáxico. Primero haz la bandeja de la cabeza. Corta aproximadamente 1/5 de la parte inferior de un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros para hacer una abertura para la cabeza de un cachorro neonatal.

A continuación, seleccione una caja de punta de pipeta vacía que se ajuste al pedestal del aparato estereotáxico. A continuación, utilice pegamento caliente para fijar la bandeja de la cabeza a la base de la caja de puntas. A continuación, pega un casete de papel en la caja donde pueda apoyar el torso del cachorro mientras se fija su cabeza.

Ahora prepare agujas de acero inoxidable de calibre 30 para la inyección. Primero, límpialos previamente sumergiéndolos en cloroformo durante tres días en un frasco de vidrio. Tres días después, retire cuidadosamente las agujas y lávelas con etanol absoluto durante 20 minutos y con 50 rpm de agitación.

A continuación, lavarlos tres veces en etanol al 70% durante 10 minutos por lavado también con agitación. Después de los lavados, deje que las agujas se sequen al aire y guárdelas en una caja limpia a temperatura ambiente hasta que las use. Para el conjunto de microinyección, use un segmento de cinco centímetros de tubo de polietileno PE20 para unir el tubo de PE10 a una jeringa de 10 microlitros de calibre 26.

Asegure la unión con cianocrilato. A continuación, monte la nueva aguja de inyección de calibre 30 en el otro extremo del tubo PE10. Ahora cargue la jeringa de microinyección de 10 microlitros.

Retire el émbolo y use otra jeringa de calibre 25 para cargar el conjunto con agua destilada esterilizada en autoclave para eliminar el aire del tubo. Luego vuelva a colocar el émbolo en la jeringa de microlitros y empuje el émbolo hasta que solo queden dos microlitros de agua destilada en el barril y no menos. A continuación, monte con cuidado la jeringa de microlitros en la bomba de jeringa de microflujo.

A continuación, pipetee pequeñas cantidades de colorante Fast Green filtrado al 0,1% en los líquidos del virus experimental sobre un trozo de parafilm. Ahora aspire una pequeña cantidad de aire en la jeringa hasta que se vea una burbuja de aire entre la aguja de inyección y el tubo. A continuación, cargue 0,7 microlitros de solución Fast Green filtrada para probar el flujo de fluidos en el tubo de microinyección.

Si el flujo es bueno, aspire otro pequeño volumen de aire para hacer una segunda burbuja de aire y luego cargue la solución de inyección en el tubo de microinyección. Coloque y asegure la aguja de microinyección al aparato estereotáxico y proceda a la microinyección de los ratones neonatos. En preparación para la cirugía, limpie a fondo el instrumento estereotáxico con etanol al 70% y esterilice los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%.

A continuación, anestesiar a un neonato mediante hipotermia. Coloca al cachorro en un guante de látex y sumérgelo en hielo picado hasta el cuello durante cinco minutos. Luego, pellizca las patas del cachorro con pinzas para asegurarte de que no haya reflejo pedal.

A continuación, coloque al cachorro con el guante en la bandeja de la cabeza y coloque un poco de hielo picado alrededor de la funda de látex para mantener la anestesia por hipotermia. A continuación, frote la cabeza del cachorro con etanol al 70% y localice el punto de referencia lambda. Márcalo con un rotulador.

A continuación, apunte la punta de la aguja a la lambda y ajuste las coordenadas anterior/posterior y medial/lateral a cero. A continuación, consultando un atlas cerebral, mueva el brazo de inyección al sitio objetivo. Por ejemplo, el cuerpo estriado de las crías de P2 es 2,4 milímetros anterior a la lambda, 1,0 milímetros a cada lado de la línea media y 1,7 milímetros ventral.

A continuación, marque la posición del tinte Fast Green en el tubo PE10 con un bolígrafo. Luego, comience a penetrar lentamente la aguja a través de la piel y el cráneo hasta que la punta de la aguja entre en contacto con la superficie del cráneo. Establezca la coordenada dorsal/ventral como cero.

A continuación, baje la aguja lentamente hasta el sitio objetivo. Una vez en posición, espere un minuto para permitir que el parénquima vuelva a su forma normal. A continuación, ejecute el programa de microinyección a 100 nanolitros por minuto.

Durante la inyección, observe cómo se mueve el tinte Fast Green en el tubo de PE. Es fundamental penetrar lentamente la aguja a través de la piel y el cráneo hasta que la punta de la aguja entre en contacto con la superficie del cráneo. Durante la inyección, es imperativo observar el movimiento del tinte Fast Green en el tubo de PE.

Una vez completada la inyección, espere un minuto y luego suba lentamente la aguja hasta la mitad de la profundidad DV penetrada. Luego espere otros 30 segundos antes de proceder con la retirada lenta de la aguja de la cabeza del cachorro. Una vez finalizada la inyección, es importante esperar un minuto antes de subir lentamente la aguja hasta la mitad de la profundidad DV penetrada.

Luego espere otros 30 segundos antes de retirar lentamente la aguja de la cabeza del cachorro. Después de que se hayan inyectado todos los sitios objetivo, caliente al cachorro durante 20 minutos en una incubadora a 33 grados centígrados. Revise al cachorro cada cinco minutos hasta que haya recuperado la decúbito esternal.

A continuación, devuelve el cachorro a su madre. Se inyectaron 200 nanolitros de virus que expresan ADN Cre recombinasa fusionado con GFP en el cuerpo estriado P2 de ratones Ai14. Estos ratones expresaron el gen reportero tdTomato tras la deleción mediada por Cre de un casete de parada flanqueado por loxP.

Los cerebros se recolectaron en P14 para inmunotinción de GFP y tdTomato. Muchas células positivas para GFP transducidas por AAV estaban presentes en todo el cuerpo estriado, lo que indica una infección extensa de las células estriadas por los virus AAV, EGFP Cre. También se encontró una expresión extensiva similar de tdTomato en el cuerpo estriado.

Tras el examen microscópico a gran aumento, se encontró claramente que todas las células estriatales positivas para GFP coexpresaban el gen reportero tdTomato. Además, se detectaron señales de tdTomato en los terminales de los axones del globo pálido, en la sustancia negra pars reticulata, las regiones diana de las neuronas de proyección estriatonigral y estriatopallidal. En conjunto, estos resultados sugieren una exitosa recombinación de ADN mediada por Cre loxP inducida por la expresión de la actividad de Cre mediada por AAV en las neuronas estriadas neonatales.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos para la inyección estriatal bilateral si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se trata de una delicada cirugía cerebral neonatal que requiere paciencia y cuidado. A partir de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la optogenética y la quimiogenética con el fin de analizar la maduración durante el desarrollo postnatal.