Name: Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende cirugía estereotáctica para manipulación genética en células estriatales de cerebro de ratón neonatal. Este método accesible con dispositivo casero permite inyecciones precisas para estudiar neurodesarrollo postnatal.

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Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología concede MOST104-2311-B-010-010-MY3, conceder MOST106-2321-B-010-012, los institutos nacionales de investigación de salud INDH-EX106-10429NI y las áreas de investigación centro Programa Beca de el Ministerio de educación a través del centro de investigación del cerebro, Universidad Nacional de Yang Ming en Taiwán, y Beca Postdoctoral becas MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.) y MOST105-2811-B-010-036 MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

Los protocolos animal aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso comités Universidad Nacional de Yang Ming.
1. preparación del titular de los cachorros neonatales en el aparato estereotáctica
<ol><li>Hacer la bandeja principal: cortar la parte inferior de un tubo de centrífuga de 1.5 mL (15 mm de largo) en la forma que se adapta a la cabeza de los cachorros neonatales quitando 1/5 de la pared del tubo.</li>
	<li>Tomar una caja de punta de pipeta con el tamaño correcto que encaja con el pedestal del aparato estereotáxicas y quite la cubierta superior. Pegue la cabeza bandeja preparada en el paso 1.1 y un cassette inclusión de tejido sobre la base de punta de bandeja con el pegamento de fusión en caliente. La altura del cassette inclusión de tejido es 7 m m, que se utiliza para apoyar el cuello y el cuerpo del cachorro en la posición fija de la cabeza.</li>
	<li>Lugar la configuración todo en un aparato estándar estereotáxicas.</li>
</ol>2. preparación de agujas de acero inoxidable de inyección de 30G
<ol><li>Limpieza previa de agujas de jeringa de 30 G por sumergiéndolas en cloroformo durante 3 días.</li>
	<li>Utilice pinzas para lenta y cuidadosamente saque la aguja desde el hub de polipropileno en una campana química.</li>
	<li>Lavar las agujas con etanol absoluto por 20 min seguido por enjuagues de etanol 70% por 3 × 10 min en un agitador a 50 rpm. Airee el agujas secas y almacenar las agujas limpias en una caja limpia a temperatura ambiente (RT) hasta su uso.</li>
</ol>3. prepare un adaptador para tubos de microinyección
<ol><li>Conecte la jeringa microliter una aguja 30G con un PE10 polietileno tubo (PE10). Preparar un adaptador de tubo (tubo PE20) PE20 polietileno para tender un puente sobre la aguja y la jeringa microliter. El uso del adaptador es necesario, porque el diámetro del tubo PE10 es mucho más pequeño que el de la aguja de la jeringa microliter de 26G.</li>
	<li>Preparar el tubo de la jeringa microliter: Conecte la aguja 30 G previamente limpiado con 5 cm de tubo PE20 y sellar la Unión con pegamento instantáneo. Este adaptador de tubería es reutilizable. Nota: Si la aguja de la jeringa de microinyección es 30G, la preparación (paso 3.1) y (paso 3.3) el uso de este adaptador no es necesario.</li>
	<li>Conecte el adaptador de tubo (preparado en el paso 3.1) con una jeringa microliter (10 μl).</li>
	<li>Conecte un extremo del PE10 el tubo (no más de 60 cm) en la aguja de 30G del adaptador de tubo PE20. Monte una nueva aguja 30G en el otro extremo del tubo PE10.</li>
</ol>4. Cargue el tubo de la microinyección con virus, colorante y agua destilada esterilizada
<ol><li>Retire el émbolo de la jeringa microliter. Utilizar una jeringa de 25G para cargar la jeringa microliter y su tubo de PE conectado con agua destilada esterilizada para remover el aire de la tubería.</li>
	<li>Coloque el émbolo de la jeringa microliter y empuje el émbolo hasta 2 μl de agua destilada se queda en el barril. No deje que el volumen de ser inferior a 2 μl de agua destilada.</li>
	<li>Montar con cuidado la jeringa microliter en la bomba de jeringa de tasa de flujo micro.</li>
	<li>Pipeta de pequeñas cantidades de tinte de 0,1% de verde rápido (preparado en solución salina 0.9% y filtrar con filtro de 0.22 μm) y los líquidos de virus a un trozo de parafilm.</li>
	<li>Retirar una pequeña cantidad de aire para hacer una burbuja de aire visible en el cruce entre la aguja 30G y tubo PE10 seguido de carga 0,7 μl del filtrado verde rápido en el tubo para probar el flujo de fluidos en la tubería de microinyección.</li>
	<li>Retirar otra pequeña cantidad de aire para hacer una segunda burbuja de aire seguida por la carga de los líquidos de virus en el tubo de microinyección.</li>
	<li>Coloque y fije la aguja de 30G microinyección en el brazo del aparato estereotáxicas.</li>
</ol>5. anestesia de ratones neonatales por hipotermia
<ol><li>Colocar el cachorro en una manga de guante de látex y sumergirlo en hielo hasta el cuello durante 5 minutos.</li>
	<li>El sujetador de pies de cría con pinzas para asegurarse de que no hay respuesta de retirada de sus pies.</li>
	<li>Pon el cachorro con la manga del guante de látex en la bandeja principal y algunos hielo picado alrededor de la manga de látex para mantener fría para la anestesia de la hipotermia.</li>
	<li>Aplique ungüento veterinario en los ojos del cachorro para prevenir sequedad mientras que bajo anestesia si es posible.</li>
</ol>6. microinyección
<ol><li>Preparan cirugía estéril frotando el instrumento estereotáxicas con etanol al 70%. Esterilizar el instrumental quirúrgico por inmersión en etanol al 70%.</li>
	<li>Frote la cabeza del cachorro con etanol al 70%. Ubicar el lambda de la señal en el cráneo y la lambda de la marca con un rotulador. Apunte la punta de la aguja a la lambda y fijar el antero-posterior (AP) y medial-lateral (ML) coordenadas como cero.</li>
	<li>Mueva el brazo de inyección al sitio de destino según las coordenadas X e Y del sitio de destino. Para el estriado de día postnatal (P) 2 crías, las coordenadas son: AP, +2,4 mm anterior a la lambda; ML, ±1. 0 mm lateral de la línea media; dorsal-ventral (DV), mm −1.7 del cráneo. Marque la posición de tinte verde rápido en PE10 tubo con una pluma.</li>
	<li>Bajar la aguja 30G lentamente a penetrar a través de la piel y el cráneo y luego traer hasta la punta de la aguja hasta que se detenga en la superficie del cráneo. Establecer la coordenada DV como cero.</li>
	<li>Haga descender la aguja 30G lentamente hasta llegar a la coordenada de la DV del sitio de destino. Espere 1 minuto permitir que el parénquima reasumir su forma normal. Ejecute el programa de la microinyección (100 nL/min).</li>
	<li>Asegúrese de que la marca de tinte verde rápido se está moviendo en el tubo de PE para que el líquido del virus es inyectado en el cerebro.</li>
	<li>Esperar 1 minuto después de la terminación de la microinyección y luego lenta y progresivamente lleve la aguja a la altura del 1/2 de profundidad DV dentro de los 30 s. Después de 30 s, retirar lentamente la aguja de la cabeza del cachorro.</li>
	<li>Repita el paso 6.2 a 6.7 hasta que se completen las microinyecciones de todos los sitios específicos.</li>
</ol>7. post quirúrgico recuperación del cachorro
<ol><li>El cachorro por 20 min en una incubadora de 33 ° C de calentamiento. Comprobar la recuperación de la cría de la hipotermia anestesia cada 5 min hasta que el cachorro ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.</li>
	<li>Regresar el cachorro a la presa después de que el cachorro se recupera completamente.</li>
</ol>

<ol><li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li>
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<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatal+mosaic%3A+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuit%22%5BJournal%5D)">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente estudio, se demuestra un método simple y confiable estereotáctica para inyectar virus AAV en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Microinyectados virus AAV-eGFP-Cre en el estriado de los ratones de reportero Ai14 en P2 y luego analiza la expresión del gen reportero en P14. Encontramos que AAV transduced células GFP-positivas en el cuerpo estriado a nivel rostrocaudal. Por otra parte, casi todas las células GFP-positivas Co expresan el gen reportero tdTomato en células estriatales, lo que sugie...

Los estudios modernos de la estructura y función del cerebro requieren manipulación genética de genes específicos en células neuronales. Para probar las funciones de diferentes genes, ratones transgénicos con alelos del mutante, incluyendo nocaut y knock-in alelos se han generado habitualmente. Neurocirugía estereotáctica para roedores adultos es un método estándar para entregar localmente los medicamentos, virus, marcadores y otros reactivos a regiones específicas del cerebro de roedores1,2. Aplicación de la cirugía estereotáctica cerebral en ratones transgénicos permite manipular genéticamente las funciones de los genes y la actividad neuronal en poblaciones neuronales específicas del cerebro del ratón. La manipulación de tipo específico de célula proporciona un enfoque poderoso para descifrar las funciones neuronales en complejos circuitos neuronales del cerebro3,4,5.
Desarrollo neuronal del sistema nervioso comienza en las primeras etapas embrionarias, y continúan con los procesos de desarrollo después del nacimiento hasta el periodo juvenil. Maduración postnatal del sistema nervioso incluye el cableado sináptico precisa de circuitos neurales, que es esencial para las funciones fisiológicas y cognitivas del cerebro6. Por lo tanto, estudiar eventos del desarrollo que ocurren en tiempo neonatal es importante no sólo para comprender el desarrollo neural normal, pero también puede proporcionar penetraciones en la patogenesia de Neurodesarrollo y trastornos neuropsiquiátricos7 ,8. Aunque los métodos de cirugía estereotáctica cerebral de roedores adultos son fácilmente disponibles2,9, algunos protocolos están disponibles en internet para cirugía estereotáctica cerebral en ratones neonatales10,11. De hecho, microinyecciones estereotáxicas de reactivos en el cerebro de crías de ratón neonatal son difíciles, porque la cabeza del cachorro neonatal es demasiado frágil para ser fijado en el aparato estándar estereotáxicas. Sin embargo, la aplicación de cirugía estereotáctica cerebral en ratones transgénicos es factible para ratones neonatales12. Aquí, describimos un método simple con una instalación casera para realizar cirugía estereotáctica cerebral en crías de ratón recién nacido. Nos demuestran que esta técnica permite eliminar condicional floxed genes microinjecting recombinase de AAV-expresión Cre ADN en el cuerpo estriado de reportero gene ratones y condicional de ratones transgénicos floxed. Esta técnica también es aplicable para entregar los reactivos en el neonatal estriado de los ratones de tipo salvaje.

<table><tbody><tr><td>Aguja PrecisionGlide 30G</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Jeringa MICROLITER</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>80300</td><td>Aguja de 30G apta para tubo de PE10; La aguja de 26G necesita un adaptador de PE20</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa de micro caudal</td><td>Bomba de precisión más larga Co.</td><td>TJ-2A (controlador) y L0107-2A (unidad de accionamiento)</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Instrumentos estereotáxicos estándar</td><td>RWD Life Science</td><td>68037</td><td>Sin usar 68030 Adaptador de ratón/rata neonatal</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-FOXP2</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>Conejo policlonal a FOXP2, 1:4.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-RFP</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>Monoclonal de ratón a RFP, microscopio 1:1.000</td></tr><tr><td>BX63 Microscopio</td> confocal <td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo conjugado Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lote # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken actin-eGFP</td><td>AAV core, Instituto de Ciencias Biomédicas, Academia Sinica, Taiwán</td><td>N/A</td><td>1x1014 (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J</td><td>El Laboratorio de Jackson&nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>El Laboratorio de Jackson&nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2fl/fl</td></tr><tr><td>Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato</td><td>Corning&nbsp; CellGro</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón neonatal

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Muchos genes se expresan en el cerebro embrionario y algunos de ellos se expresan continuamente en el cerebro después del nacimiento. Para tales genes persistentemente expresadas, pueden funcionan para regular el proceso de desarrollo o función fisiológica en el cerebro neonatal. Para investigar las funciones neurobiológicas de genes específicos en el cerebro, es esencial para desactivar genes en el cerebro. Aquí, describimos un método simple de estereotáctica para inactivar genes en el cuerpo estriado de los ratones transgénicos en ventanas de tiempo neonatal. AAV-eGFP-Cre virus fueron microinyectados en el estriado de los ratones de gen reportero Ai14 en día postnatal (P) 2 de cirugía estereotáctica cerebral. La expresión del gen reportero tdTomato fue detectada en P14 estriado, sugiriendo un éxito Cre-loxP mediada por recombinación de ADN en las células AAV-transduced estriada. Más validamos esta técnica por microinjecting virus AAV-eGFP-Cre en ratones P2Foxp2fl/fl . Etiquetado doble de GFP y Foxp2 demostró que las células GFP-positivas carecían de Foxp2 immunoreactivity en P9 estriado, lo que sugiere la pérdida de la proteína Foxp2 en AAV-eGFP-Cre transduced estriado células. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran una canceladura genética efectiva por los virus de AAV-eGFP-Cre stereotaxically microinyectados en poblaciones neuronales específicas en el cerebro neonatal de ratones transgénicos floxed. En conclusión, nuestra técnica estereotáctica proporciona una plataforma fácil y simple para la manipulación genética en el cerebro de ratón neonatal. La técnica no sólo permite eliminar genes en regiones específicas del cerebro neonatal, pero también puede ser utilizado para inyectar drogas farmacológicas, trazadores neuronales, optogenetics genéticamente modificados y chemogenetics proteínas, indicadores de la actividad neuronal y otros reactivos en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal.

Para el primer conjunto del experimento, nos microinyectados 200 nL de AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virus (AAV-eGFP-Cre, dilución 1/10 en tampón fosfato salino de Dulbecco) que expresan el recombinase de Cre DNA fundido con GFP en P2 estriado de los ratones Ai14. Los ratones Ai14 expresan el gen reportero de tdTomato sobre eliminación Cre-mediada del loxP flanqueado (floxed) cassette STOP (figura 2F). Los cerebros fueron cosechados en P14 de immunosta...

Se describe un protocolo de cirugía estereotáctica con un dispositivo casero hecho de cabeza fija de reactivos microinjecting en el cuerpo estriado del cerebro de ratón neonatal. Esta técnica permite la manipulación genética en las células neuronales de regiones específicas del cerebro de ratón neonatal.

Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo genético y neurológico, como durante el desarrollo postnatal. La principal ventaja de esta técnica es que es una técnica sencilla con un dispositivo casero. La demostración visual de este método es fundamental porque la realización de inyecciones dirigidas en el cerebro requiere una atención total a los detalles.Para empezar, haga un soporte para usar cachorros neonatos en un aparato estereotáxico. Primero haz la bandeja de la cabeza. Corta aproximadamente 1/5 de la parte inferior de un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros para hacer una abertura para la cabeza de un cachorro neonatal.A continuación, seleccione una caja de punta de pipeta vacía que se ajuste al pedestal del aparato estereotáxico. A continuación, utilice pegamento caliente para fijar la bandeja de la cabeza a la base de la caja de puntas. A continuación, pega un casete de papel en la caja donde pueda apoyar el torso del cachorro mientras se fija su cabeza.Ahora prepare agujas de acero inoxidable de calibre 30 para la inyección. Primero, límpialos previamente sumergiéndolos en cloroformo durante tres días en un frasco de vidrio. Tres días después, retire cuidadosamente las agujas y lávelas con etanol absoluto durante 20 minutos y con 50 rpm de agitación.A continuación, lavarlos tres veces en etanol al 70% durante 10 minutos por lavado también con agitación. Después de los lavados, deje que las agujas se sequen al aire y guárdelas en una caja limpia a temperatura ambiente hasta que las use. Para el conjunto de microinyección, use un segmento de cinco centímetros de tubo de polietileno PE20 para unir el tubo de PE10 a una jeringa de 10 microlitros de calibre 26.Asegure la unión con cianocrilato. A continuación, monte la nueva aguja de inyección de calibre 30 en el otro extremo del tubo PE10. Ahora cargue la jeringa de microinyección de 10 microlitros.Retire el émbolo y use otra jeringa de calibre 25 para cargar el conjunto con agua destilada esterilizada en autoclave para eliminar el aire del tubo. Luego vuelva a colocar el émbolo en la jeringa de microlitros y empuje el émbolo hasta que solo queden dos microlitros de agua destilada en el barril y no menos. A continuación, monte con cuidado la jeringa de microlitros en la bomba de jeringa de microflujo.A continuación, pipetee pequeñas cantidades de colorante Fast Green filtrado al 0,1% en los líquidos del virus experimental sobre un trozo de parafilm. Ahora aspire una pequeña cantidad de aire en la jeringa hasta que se vea una burbuja de aire entre la aguja de inyección y el tubo. A continuación, cargue 0,7 microlitros de solución Fast Green filtrada para probar el flujo de fluidos en el tubo de microinyección.Si el flujo es bueno, aspire otro pequeño volumen de aire para hacer una segunda burbuja de aire y luego cargue la solución de inyección en el tubo de microinyección. Coloque y asegure la aguja de microinyección al aparato estereotáxico y proceda a la microinyección de los ratones neonatos. En preparación para la cirugía, limpie a fondo el instrumento estereotáxico con etanol al 70% y esterilice los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%.A continuación, anestesiar a un neonato mediante hipotermia. Coloca al cachorro en un guante de látex y sumérgelo en hielo picado hasta el cuello durante cinco minutos. Luego, pellizca las patas del cachorro con pinzas para asegurarte de que no haya reflejo pedal.A continuación, coloque al cachorro con el guante en la bandeja de la cabeza y coloque un poco de hielo picado alrededor de la funda de látex para mantener la anestesia por hipotermia. A continuación, frote la cabeza del cachorro con etanol al 70% y localice el punto de referencia lambda. Márcalo con un rotulador.A continuación, apunte la punta de la aguja a la lambda y ajuste las coordenadas anterior/posterior y medial/lateral a cero. A continuación, consultando un atlas cerebral, mueva el brazo de inyección al sitio objetivo. Por ejemplo, el cuerpo estriado de las crías de P2 es 2,4 milímetros anterior a la lambda, 1,0 milímetros a cada lado de la línea media y 1,7 milímetros ventral.A continuación, marque la posición del tinte Fast Green en el tubo PE10 con un bolígrafo. Luego, comience a penetrar lentamente la aguja a través de la piel y el cráneo hasta que la punta de la aguja entre en contacto con la superficie del cráneo. Establezca la coordenada dorsal/ventral como cero.A continuación, baje la aguja lentamente hasta el sitio objetivo. Una vez en posición, espere un minuto para permitir que el parénquima vuelva a su forma normal. A continuación, ejecute el programa de microinyección a 100 nanolitros por minuto.Durante la inyección, observe cómo se mueve el tinte Fast Green en el tubo de PE. Es fundamental penetrar lentamente la aguja a través de la piel y el cráneo hasta que la punta de la aguja entre en contacto con la superficie del cráneo. Durante la inyección, es imperativo observar el movimiento del tinte Fast Green en el tubo de PE.Una vez completada la inyección, espere un minuto y luego suba lentamente la aguja hasta la mitad de la profundidad DV penetrada. Luego espere otros 30 segundos antes de proceder con la retirada lenta de la aguja de la cabeza del cachorro. Una vez finalizada la inyección, es importante esperar un minuto antes de subir lentamente la aguja hasta la mitad de la profundidad DV penetrada.Luego espere otros 30 segundos antes de retirar lentamente la aguja de la cabeza del cachorro. Después de que se hayan inyectado todos los sitios objetivo, caliente al cachorro durante 20 minutos en una incubadora a 33 grados centígrados. Revise al cachorro cada cinco minutos hasta que haya recuperado la decúbito esternal.A continuación, devuelve el cachorro a su madre. Se inyectaron 200 nanolitros de virus que expresan ADN Cre recombinasa fusionado con GFP en el cuerpo estriado P2 de ratones Ai14. Estos ratones expresaron el gen reportero tdTomato tras la deleción mediada por Cre de un casete de parada flanqueado por loxP.Los cerebros se recolectaron en P14 para inmunotinción de GFP y tdTomato. Muchas células positivas para GFP transducidas por AAV estaban presentes en todo el cuerpo estriado, lo que indica una infección extensa de las células estriadas por los virus AAV, EGFP Cre. También se encontró una expresión extensiva similar de tdTomato en el cuerpo estriado.Tras el examen microscópico a gran aumento, se encontró claramente que todas las células estriatales positivas para GFP coexpresaban el gen reportero tdTomato. Además, se detectaron señales de tdTomato en los terminales de los axones del globo pálido, en la sustancia negra pars reticulata, las regiones diana de las neuronas de proyección estriatonigral y estriatopallidal. En conjunto, estos resultados sugieren una exitosa recombinación de ADN mediada por Cre loxP inducida por la expresión de la actividad de Cre mediada por AAV en las neuronas estriadas neonatales.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos para la inyección estriatal bilateral si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se trata de una delicada cirugía cerebral neonatal que requiere paciencia y cuidado. A partir de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la optogenética y la quimiogenética con el fin de analizar la maduración durante el desarrollo postnatal.

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Investigación

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Neurociencia

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