Name: Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprende a determinar el índice de gotas lipídicas en Ustilago maydis mediante fluorescencia en placa. Este método de alto rendimiento permite evaluar la dinámica de acumulación lipídica en diferentes condiciones nutricionales sin extracción compleja.

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Este trabajo fue apoyado por becas de Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP-IPN-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM) y Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP y 256520 GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ Cientistas Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Nosotros gracias a la QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo para el Resumen esquemático. Agradecemos la valiosa ayuda de la microscopía confocal de LDs Dr. Miguel Tapia Rodríguez. Deseamos agradecer a Dr. Bruno Bozaquel Morais por su trabajo pionero en el desarrollo de la técnica en S. cerevisiae que adaptamos para U. maydis.

1. preparación de Buffers y soluciones
<ol><li>Para preparar 1 L de fosfato tampón salino (PBS, pH 7), disolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7.0 con ácido clorhídrico y luego añadir agua para un volumen final de 1 L. PBS puede ser hecho como un 10 x solución y almacenado a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar 10 mL de solución de fijación, añadir 1 mL de formaldehído al 37% para 9 mL de PBS para alcanzar una concentración final de 3,7%. Preparar esta solución antes de usar. PRECAUCIÓN: Use guantes para manejar la solución de formaldehído.</li>
	<li>Para preparar la solución de amortiguamiento (500 mM), disolver 8,3 g de KI en 100 mL de agua destilada. Preparar esta solución antes de usar y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar la solución madre de BODIPY 10 mM, disolver 10 mg de BODIPY 493/503 en 3,8 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Guardar alícuotas μl 100 en la oscuridad a-70 ° C.</li>
	<li>Para preparar la solución de enfriamiento μm 5 BODIPY, añadir 1 μl de 10 mM BODIPY 493/503-2 mL de 500 mM apaga solución. Para el análisis LFR, se requiere una concentración final de 5 μm de BODIPY.</li>
	<li>Para preparar la solución mineral, Añadir 0,06 g de H3BO3, 0,14 g de MnCl2-4 H2O, 0,4 g de vivencias20,04 g de Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g de FECLAS3-6 H2O y 0,4 g de CuSO 4-5 H2O a 1 L de agua destilada.</li>
	<li>Para preparar la solución de sal, añadir 16 g de KH2PO4, 4 g de Na2para que4, 8 g de KCl, 2 g de MgSO4, 1 g de CaCl2y 8 mL de solución mineral 1 L de agua destilación.</li>
	<li>Para preparar el medio mínimo sin una fuente de nitrógeno para U. maydis FB2 (a2b2), añadir 10 g de glucosa y 62,5 mL de solución de sal a 1 L de agua destilada, según Holliday, et al. 31. ajustar el pH a 7.0 y luego distribuir 100 mL del medio en frascos de 250 mL y esterilizarlas. Esterilizar autoclave durante 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) en el ciclo líquido o filtro.</li>
	<li>Para preparar la levadura peptona dextrosa medio (YPD), añadir 5 g de levadura extracto, 2,5 g de peptona, y 5 g de glucosa a 1 L de agua destilada. Distribuir 100 mL de la solución en frascos de 250 mL y esterilizarlas. Esterilizar autoclave durante 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) en el ciclo líquido o filtro.</li>
</ol>2. estado y fijación de la célula de la cultura
Nota: Conservar la estructura del LDs mediante la fijación de las células tan pronto como sea posible. La fijación puede realizarse en tubos de microcentrífuga. Las células fijas pueden conservarse a 4 ° C hasta un mes si la deshidratación se evita dejando una fina capa de agua.
<ol><li>Cultivar células de U. maydis bajo condiciones de cultivo relevantes para el estudio. Inicio la cultura con un OD inicial600 de 0.05 (1,15 x 106 células / mL). Incube las células a 28 ° C, 180 rpm por 24 h. Un OD600 de 1 corresponde a 2,3 × 107 células / mL.</li>
	<li>En el seleccionado veces, retirar una parte alícuota de las células. De U. maydis, retirar 5 mL cada 2 h durante las primeras 8 h. Después de 8 h de crecimiento, alícuotas de 2 mL son suficientes.</li>
	<li>Medir la densidad óptica a 600 nm de cada alícuota.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 14.000 x g durante 1 min a 4 ° C utilizando una centrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Suspender el sedimento de las células en 1 mL de tampón de PBS-formaldehído 3,7%. Incube las células durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la incubación, Centrifugue la suspensión de células a 14.000 x g durante 1 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar el pellet de células dos veces con un volumen similar de agua destilada (1 mL). Centrifugue la suspensión de células a 14.000 x g durante 1 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante después de cada paso de lavado.</li>
	<li>Ajustar el precipitado de células 5 OD600 (1,15 x 108 células / mL) con agua destilada agua (ecuación 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq1.jpg">    Ecuación 1.
</li>
	<li>Mantener la muestra a 4 ° C hasta su uso.</li>
</ol>3. ensayo de recuperación de fluorescencia líquida (LFR)
<ol><li>Encender el espectrofotómetro y abra el software de Skanlt. Haga clic en nueva sesióny seleccione Inicio y, a continuación Varioskan Lux. Seleccione el Protocolo en el árbol de sesión, introduzca los valores para las longitudes de onda de fluorescencia (excitación 485 nm/emisión de 510 nm; densidad óptica 600 nm) y elija ganancia del fotomultiplicador automático. Para ancho de banda de excitación, seleccione 12 nm. En la óptica, seleccione parte superior (excitación de la muestra es de la parte superior del pozo).</li>
	<li>Entrar en una agitación suave y continua (300 rpm). Seleccione Ejecutar placay Pausa hasta que la acción del usuario (tiempo utilizado para la adición de la muestra en los pocillos). Repita el protocolo cinco veces. Haga clic en Guardar , escriba un nombre para la sesión en el Campo de nombre de sesión. El protocolo está listo para el análisis de las muestras.</li>
	<li>Añadir 200 μL del μm 5 BODIPY - apagó la solución en cada pocillo de una placa de 96 fondo bien negro claro.</li>
	<li>Coloque la placa dentro del compartimiento del espectrofotómetro e incubar 5 min a 30 ° C. Desde este punto, proteja la placa de la luz tanto como sea posible.</li>
	<li>Haga clic en el botón Inicio y leer la fluorescencia (excitación 485/emisión de 510) y el de OD600 correspondiente a los espacios en blanco.</li>
	<li>Añadir 5 μl de la suspensión celular de formaldehído-fija a los pozos durante el tiempo de pausa. Mezclar cuidadosamente las muestras con la pipeta. Poner la placa dentro del espectrofotómetro y haga clic en continuar. Luego, las muestras se procesarán según el protocolo diseñado por encima.</li>
	<li>Repetir tres adiciones sucesivas de 5 μl de la suspensión celular. Asegúrese de que las células no precipitan. (Figura 1).</li>
</ol>4. cálculo del índice de LD
<ol><li>Para cada muestra en la microplaca, trazar un gráfico de fluorescencia y absorbancia contra el volumen de cada adición sucesiva (5 puntos incluyendo el espacio en blanco). En este estudio, utilizar software de Microsoft Excel para los cálculos. Trama de los datos, ingrese el volumen, la fluorescencia y datos de absorbancia en la primera, segunda y tercera columna de la hoja de datos, respectivamente. A continuación, seleccione los datos enteros con el cursor, haga clic en Insertar y seleccione dispersión (XY).</li>
	<li>Seleccione los puntos de cada línea en la gráfica e inserte la respectiva Línea de tendencia con el cuadro Mostrar ecuación seleccionado. Anote los valores de las pendientes de dos rectas, según la ecuación 2: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq2.jpg">    Ecuación 2 Donde y = fluorescencia o densidad óptica, x = volumen de muestra (0, 5, 10, 15, 20 μl), m = pendiente de la fluorescencia o la línea de densidad óptica y la b = intersección.</li>
	<li>Dividir la pendiente de la línea de fluorescencia por la pendiente de la línea de la densidad óptica para obtener el índice de LD, la ecuación 3. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq3.jpg">    Ecuación 3 Pistas de densidad óptica y el índice de LD corresponde al cociente de la fluorescencia.</li>
</ol>5. Análisis de calidad de datos
<ol><li>Calcular el coeficiente de correlación de cada recta: haga clic en el Asistente para la función (fx) y elija Coef.de. Si r &lt; 0.9, descartar los datos y repetir las lecturas. Si r ≥ 0.9, las lecturas es confiable.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
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<li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li>
<li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+lipids+from+glycerol%3A+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83(2014).</li>
<li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164(2014).</li>
<li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li>
<li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids%2C+carotenoids%2C+and+enzymes+for+use+in+industries%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li>
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<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li>
<li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li>
<li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast%3A+current+status+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li>
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<li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li>
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<li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada a la divulgación

LFR es un novedoso método que se aplicó por primera vez estudiar el metabolismo de los lípidos en S. cerevisiae y más tarde fue exitosamente implementado en U. maydis20,21. Aunque el índice de LD no da un valor absoluto de las etiquetas que se acumula en las células, proporciona una idea rápida del contenido en lípidos de las células, y la interpretación de los datos es sencilla cuando se comparan el índice de LD de dos o más condiciones experim...

Gotitas del lípido (LDs) son cuerpos de grasa intracelulares ubicuos compuesto por un núcleo de lípidos neutros, principalmente etiquetas y ésteres de esterol (SE). El núcleo está rodeado por una monocapa de fosfolípidos que interactúa con las proteínas como enzimas implicadas en la síntesis de lípidos neutros, como el diacilglicerol acil-transferasa, carboxylase del acetilo-CoA y acil-CoA sintasa1perilipin. Debido a su comportamiento dinámico, la monocapa de fosfolípidos también contiene triacilglicerol lipasas que hidrolizan etiquetas y SE2. Dependiendo del tipo de célula y organismo, almacenados lípidos neutros pueden utilizarse para generar energía y sintetizan fosfolípidos y moléculas de señalización. En levaduras y otros hongos, el contenido de LDs cambia en respuesta a variaciones en la relación nitrógeno/carbono en los medios de cultivo, lo que indica que la disponibilidad de nitrógeno disminuida podría ser la clave para aumentar la producción de lípidos neutros3,4 ,5. La producción de grandes cantidades de etiquetas en la levadura tiene un uso potencial en la biotecnología como fuente de biocombustibles y en la industria alimentaria. Algunos lípidos almacenados contienen altas proporciones de ácidos grasos poli-insaturados, como omega 3 y omega 6, con importancia nutricional y dietética 6,7,8,9,10 , 11. LDs de células de mamíferos, incluyendo células humanas, también contienen etiquetas y ésteres de colesterol. La monocapa de fosfolípidos interacciona con los mamíferos homólogos de las proteínas se describe en la levadura Sud y con una proteína adicional, perilipin, que está ausente en S. cerevisiae12. Uno propuso el papel de la monocapa de fosfolípidos y las proteínas asociadas es estabilizar la estructura del LDs y permitir la interacción de LDs con organelos como mitocondrias, retículo endoplasmático, peroxisomas y vacuolas, principalmente para el intercambio de lípidos 13,14. Curiosamente, en los seres humanos, LDs parecen intervenir en patologías como diabetes tipo 2, ateroesclerosis, esteatohepatitis, enfermedad coronaria, en el cual hay un aumento en su número 15,16,17 . Algunos tipos de virus utilizan LDs como plataformas para ensamblar los viriones 2,18,19.
Debido a las implicaciones de la Sud en patologías humanas y su potencial uso biotecnológico, la exacta determinación experimental de formación mormona es una tarea importante. Este artículo describe un ensayo confiable basado en la recuperación de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 1-difluoro-4, 3, 5, 7, 8-r:-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obtener un valor relativo del contenido de lípidos neutros en las células. Con este análisis, es posible seguir la dinámica de la acumulación de lípidos neutros en hongos como U. maydis y S. cerevisiaey también en células de mamífero, sin necesidad de extracción de lípidos 20. El método fue aplicado por primera vez en S. cerevisiae para identificar las proteína fosfatasas y quinasas implicadas en la regulación del metabolismo de los lípidos. Esto fue posible sin la extracción o purificación de la proteína21,22. LFR también se ha utilizado para establecer la dinámica de formación de LDs en macrófagos peritoneales23. El uso de BODIPY 493/503 tiene algunas ventajas sobre otros tintes de lípido neutral como Nilo rojo. BODIPY 493/503 es altamente específico de lípidos neutros y tiene un espectro de emisión estrecho, facilitando la detección simultánea de señales de tintes como proteína fluorescente roja o Mito-tracker, cuando las muestras son analizadas por microscopia confocal. Por desgracia, BODIPY 493/503 es sensible al fotoblanqueo, pero este proceso puede evitarse mediante el uso de un reactivo de antiquenching durante la exposición a luz24.
Para llevar a cabo el ensayo LFR en células de levadura, son cultivadas en las condiciones nutricionales deseadas y alícuotas son retiradas en diferentes momentos. A continuación, las células son fijadas con formaldehído, que preserva la integridad de LDs para meses cuando las células son almacenadas a 4 ° C. Otras técnicas de fijación deben evitarse, sobretodo las de metanol o acetona frío, puesto que conducen a la degradación de mormones dentro de las células24. Para medir el índice de LD, formaldehído-fija las células se suspenden en agua para obtener una concentración definida. Luego, se añaden a una solución que contiene el fluoróforo BODIPY 493/503 apagada por KI, y cuando el fluoróforo entra en la célula y se asocia con la mormona, hay una recuperación de su fluorescencia. Concomitante a la medida de la fluorescencia (485 nm/510 nm), la concentración de células se cuantifica midiendo la densidad óptica a 600 nm. Cada muestra se lee cuatro veces añadiendo subsecuentes partes alícuotas de 5 μl de una suspensión celular de formaldehído-fija al mismo bien. Espacios en blanco de fluorescencia y absorbancia son adquiridos antes de la adición de las células. La calidad de los datos de absorbancia y la fluorescencia son evaluados mediante la determinación de la linealidad de las mediciones: si r < 0.9, los datos se descartan. El valor de r es importante porque básicamente la intensidad de la fluorescencia debe producir una respuesta lineal a las concentraciones de células cada vez mayor. Si la concentración de células es demasiado alta, la linealidad se pierde. El ensayo LFR proporciona un método rápido, sencillo y económico para seleccionar el fenotipo deseado de LD en experimentos de alto rendimiento. Después de seleccionar las condiciones deseadas, el contenido de LD de células individuales puede ser estudiado mediante microscopía confocal, usando el mismo formaldehído-fija las células teñidas con BODIPY, proporcionando una imagen de LDs en la célula. Sus etiquetas y el contenido SE pueden ahora más analizadas por cromatografía en capa fina.

<table><tbody><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Varioskan Lux microplaca multimodo reade</td><td>D5879</td><td>Filtro 493/503 o detector monocromador</td></tr><tr><td>Placa costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3615</td><td>96 pocillos, de pared negra/fondo transparente</td></tr><tr><td>Placa costar</td><td>Corning Inc</td><td>3598</td><td>Placa de cultivo celular de 96 pocillos, costar</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen/ Thermofisher</td><td>D3922</td><td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>reactivo ACS, 37 % en peso en H2O, contiene 10-15% de metanol para evitar la polimerización</td></tr><tr><td>Yoduro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60399</td><td>BioUltra, &ge; 99,5% (AT)</td></tr><tr><td>FB2 Ustilago maydis</td><td>ATCC 201384</td><td></td><td>Levadura de basidiomiceto</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746398</td><td>reactivo ACS, sal inorgánica</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td>Reactivo ACS</td></tr><tr><td>Seleccionar extracto de levadura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y100</td><td>Mezcla de aminoácidos, péptidos, solubles en agua, vitaminas y carbohidratos para medios de cultivo</td></tr><tr><td>N-Z case plus</td><td>Sigma aldrich</td><td>N4642</td><td>Hidrolizado enzimático de caseína de leche bovina</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8270</td><td>D (+) glucosa</td></tr><tr><td>Matraz Skaker</td><td>Pirex</td><td>CLS4450250-6EA</td><td>Vidrio de borosiicato</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>SEV M&eacute; xico</td><td>INO650V-7</td><td>Agitador orbital</td></tr><tr><td>Mesa centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td>Centrífuga</td></tr><tr><td>Microtubos Sigma</td><td>Aldrich</td><td>Z606340</td><td>Eppendorf Puntas</td></tr><tr>de<td>pipeta</td><td>Axygen scientific</td><td>T-200-Y</td><td>Puntas de pipeta universales con extremo biselado, 200 microlitros, no estéril</td></tr><tr><td>pipeta mLine</td><td>Biohit</td><td>725130</td><td>8 canales, rango de volumen 5-100 uL</td></tr></tbody></table>

determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno ustilago maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

El artículo muestra cómo implementar el ensayo de índice de LD, que es un ensayo de microplacas sensible para determinar la acumulación de triacilgliceroles (etiquetas) en gotitas del lípido (LDs). Índice de LD se obtiene sin extracción. Permite medir el contenido de LDs en experimentos de alto rendimiento bajo diferentes condiciones tales como crecimiento en ricos o media de nitrógeno agotado. Aunque el método fue descrito por primera vez estudiar el metabolismo de la gota de lípido en Saccharomyces cerevisiae, fue aplicado con éxito a los basidiomicetos Ustilago maydis. Curiosamente, y debido a LDs son organelos filogenéticamente conservados en las células eucariotas, el método puede aplicarse a una gran variedad de células, de levadura para células de mamífero. El índice de LD se basa en el ensayo de recuperación de líquido de la fluorescencia (LFR) de BODIPY 493/503 bajo condiciones de amortiguamiento, mediante la adición de células fijadas con formaldehído. Yodo de potasio se utiliza como un extintor de la fluorescencia. La relación entre la fluorescencia y las laderas de la densidad óptica se denomina índice de LD. Pendientes se calculan a partir de las líneas rectas que se obtienen cuando BODIPY fluorescencia y densidad óptica a 600 nm (OD600) se grafican contra la adición de la muestra. Datos óptima calidad se refleja por coeficientes de correlación igual o superior a 0,9 (r ≥ 0.9). Muestras múltiples se pueden leer al mismo tiempo como se puede implementar en una microplaca. Desde BODIPY 493/503 es un lipofílico fluorescente tinte particiones en las gotitas de lípidos, puede ser utilizado en muchos tipos de células que se acumulan de LDs.

LFR, con BODIPY 493/503 como la punta de prueba fluorescente es un método fácil y confiable para estudiar la acumulación dinámica de LDs en U. maydis, independientemente de las condiciones de crecimiento. Cuando las células fueron cultivadas en medio YPD, hubo un aumento en el índice de LD durante la fase exponencial, seguido por un descenso en la fase estacionaria (figura 2A). En cambio, en las células cultivadas bajo hambre de nitrógeno, hubo un au...

Aquí, describimos un protocolo para obtener el lípido gotitas índice (LD) para estudiar la dinámica de triacilgliceroles en las células cultivadas en experimentos de alto rendimiento. El ensayo de índice de LD es un método sencillo y fiable que utiliza BODIPY 493/503. Este ensayo no es necesario dispendious extracción o análisis de la microscopia.

Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar el índice de gotas de lípidos de células cultivadas en diferentes condiciones nutricionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las gotas de lípidos y los lípidos, como la dinámica de acumulación y las diferentes condiciones nutricionales. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden leer varias muestras simultáneamente, ya que se puede implementar en la microplaca.Con el inicio de este método, cuando observamos la refractancia de las células de Ustilago maydis cultivadas bajo inanición de nitrógeno y luego nos damos cuenta de que esto podría significar que estos instructores podrían ser gotas de lípidos. Por lo tanto, nos pusimos en contacto con Monica Montero de la Universidade Federale do Rio de Janeiro en Brasil, quien implementó el ensayo de recuperación de florescencia líquida de gotas de lípidos en Saccharomyces cerevisiae para iniciar una colaboración para adaptar el procedimiento para Ustilago maydis. El primer paso en este protocolo es la preparación de los tampones y soluciones necesarios.Para preparar una solución madre de BO-DP de 10 milimolares, disuelva 10 miligramos de BO-DP 493-503 y 3,8 mililitros de dimetilsulfóxido. Divida en alícuotas de 100 microlitros. Luego manténgalo en la oscuridad a menos 70 grados centígrados.Prepare una solución de enfriamiento de BO-DP de cinco micromolares para la recuperación de florescencia líquida, o ensayo LFR, agregando un microlitro de 10 milimolares de BO-DP 493-503 a dos mililitros de solución de enfriamiento de 500 milimoleres. Cultive las células de umeda para este estudio iniciando un cultivo con una densidad óptica inicial de 600 nanómetros de 05. Incubar las celdas a 28 grados centígrados y 180 RPM durante 24 horas.En momentos seleccionados, retire una alícuota de las celdas. Durante las primeras ocho horas, retira cinco mililitros cada dos horas. Después de ocho horas de crecimiento, las alícuotas de dos mililitros son suficientes.Mida la densidad óptica a 600 nanómetros de cada alícuota. Centrifugar la suspensión celular a 14.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados. Y desecha el sobrenadante.Suspenda el pellet de celda en un mililitro de solución de fijación que contenga 3,7% de formaldehído en PBS. Incuba las células a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifugar la suspensión celular a 14.000 veces G y cuatro grados Celsius durante un minuto.Deseche el sobrenadante. Lave el pellet de celda con un mililitro de agua destilada. Centrifugar la suspensión celular durante un minuto.Deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de agua destilada para un segundo lavado. Centrífuga de nuevo. Retire el sobrenadante del segundo lavado.Usando agua destilada, ajuste la densidad óptica del pellet de celda a 600 nanómetros a cinco, lo que equivale a 1,5 veces 10 a la octava celda por mililitro. Mantenga las muestras a cuatro grados centígrados hasta su uso. Comience este procedimiento encendiendo el espectrofotómetro.Abra el software SkanIt. Haga clic en nueva sesión. En el árbol de sesiones, seleccione el protocolo, introduzca la configuración de la longitud de onda de la florescencia y elija la ganancia automática de fotos multijugador.Para el ancho de banda de excitación, seleccione 12 nanómetros. En la óptica, seleccione top para la excitación de la muestra desde la parte superior del pocillo. Ingrese a 300 RPM y bajo para una agitación suave y continua.Seleccione ejecutar la placa de salida, pausar y, hasta la acción del usuario, repetir el protocolo cinco veces. Haga clic en Guardar y, en el campo Nombre de la sesión, escriba un nombre para la sesión. El protocolo ya está listo para el análisis de muestras.Agregue 200 microlitros de la solución de enfriamiento BO-DP de 5 micromolares a cada pocillo de una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos. Coloque la placa dentro de la cámara del espectrofotómetro e incube a 30 grados centígrados durante cinco minutos. A partir de aquí, proteja la placa de la luz tanto como sea posible.Haga clic en el botón de inicio y lea la fluorescencia y la densidad óptica a 600 nanómetros, correspondientes a los espacios en blanco. Durante el tiempo de pausa, agregue cinco microlitros de la suspensión de celda fija de formaldehído a los pocillos y mezcle las muestras cuidadosamente con una pipeta. Vuelva a colocar la placa dentro del espectrofotómetro y haga clic en continuar.Repita tres adiciones sucesivas de cinco microlitros de suspensión celular. Mezcle con una pipeta para asegurarse de que las células no precipiten antes de continuar con la lectura. En esta demostración, se utiliza el software Excel para calcular y trazar un gráfico de fluorescencia y absorbancia frente al volumen de cada adición sucesiva para cada muestra en la microplaca.Introduzca los datos de volumen, fluorescencia y absorbancia en la hoja de datos. A continuación, seleccione todos los datos con el cursor, haga clic en insertar y X Y disperse. Seleccione los puntos para cada línea en el gráfico e inserte la línea de tendencia respectiva con el cuadro de mostrar ecuación seleccionado.Escribe los valores de las pendientes de las dos rectas de acuerdo con la ecuación. Para obtener la gota de lípidos, o índice LD, divida la pendiente de la línea de fluorescencia por la pendiente de la línea de densidad óptica. Para analizar la calidad de los datos, calcule el coeficiente de correlación de cada línea recta.Haga clic en el asistente de funciones y elija coral. Las lecturas son fiables si R es igual o superior a 0,9. Es importante corroborar la sensibilidad de este método mediante microscopio confocal.Cuando las células se cultivaron en medio YPD, hubo un aumento en el índice LD durante la fase exponencial seguido de una disminución en la fase estacionaria. Por el contrario, las células cultivadas bajo inanición de nitrógeno mostraron un aumento constante en el índice LD tanto en la fase exponencial como en la estacionaria. Bajo inanición de nitrógeno, el aumento en el índice LD fue inhibido por Soraphen A, un inhibidor específico de la enzima acetil-CoA carboxilasa, esencial para la síntesis de ácidos grasos, contenida en los triacilgliceroles almacenados en las gotas de lípidos.Dado que ambos cultivos se iniciaron con la misma densidad óptica, los resultados muestran la capacidad del ensayo para detectar pequeños cambios en el contenido de lípidos. La sensibilidad de este método fue corroborada por microscopía confocal. Las células YPD contienen muchos LD pequeños en toda la célula, mientras que la inanición de nitrógeno produjo LD grandes, generalmente de cuatro a cinco por célula.Para investigar más a fondo la movilización de LDs en U.Maydis, las células cultivadas bajo inanición de nitrógeno durante 72 horas se transfirieron al medio YPD. Como se muestra, el índice LD disminuyó siguiendo una función exponencial. Dado que las células fueron capaces de movilizar las LD acumuladas durante la inanición de nitrógeno, el resultado sugiere una reducción en el contenido de triacilglicerol.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar proteger las células de la luz y mezclar entre adiciones. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el triacilglicerol o la determinación del contenido total de lípidos para responder a preguntas adicionales, como el contenido exacto de lípidos en las células.Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología lipídica exploraran organismos nuevos o supuestos con el fin de aumentar la producción de biocombustibles o lípidos en aplicaciones farmacéuticas. Incluso las células cancerosas malignas se pueden estudiar con esta técnica para explorar la participación del metabolismo de los lípidos en el desarrollo de la enfermedad. Después de ver este video, usted también tiene una buena comprensión de cómo determinar el índice de gotas de lípidos de estas células.No olvide que trabajar con formaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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