Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

El objetivo general de este protocolo es aislar los linfocitos de los sitios inductivos intestinales, incluidos los parches de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos, y los sitios efectores, como la lámina propia y el epitelio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología de la mucosa, como la comprensión de las respuestas inmunitarias a las infecciones gastrointestinales, los cánceres y las enfermedades inflamatorias. La principal ventaja de esta técnica es que asegura el aislamiento de linfocitos altamente purificados y viables de distintos compartimentos del intestino delgado con una contaminación intercompartimental mínima.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es difícil identificar y aislar los ganglios linfáticos del mesenterio y los parches de Peyer y equilibrar la velocidad y la precisión para obtener rendimientos óptimos. Para comenzar el protocolo, coloque un ratón previamente anestesiado en su espalda y rocíelo con etanol al 70%. Use tijeras para hacer una incisión en la línea media y abrir la piel y la pared abdominal para exponer la cavidad peritoneal.

A continuación, localice el ciego y use pinzas para tirar suavemente del ciego hacia abajo. Use fórceps para mover cuidadosamente el intestino delgado hacia la derecha, exponiendo toda la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos o MLN, que está alineada con el colon. Identifique el nodo inferior de la cadena ubicado más cerca del ciego.

Use un juego de pinzas para agarrar la grasa del mesenterio a su alrededor y mueva suavemente la cadena MLN de abajo hacia arriba pinzando la grasa alrededor del ganglio linfático con otro juego de pinzas. A continuación, humedezca una toalla con medios de cosecha y coloque la cadena MLN sobre la toalla de papel. Retire la grasa del mesenterio enrollando la cadena sobre la toalla de papel y tirando de la grasa con dos juegos de pinzas.

Coloque el MLN en medios de cosecha en frío para los pasos de aislamiento posteriores. Con unas tijeras, corte el intestino delgado por debajo del esfínter pilórico y por encima del ciego. Tire del intestino lentamente desde el íleon hasta el duodeno con un juego de pinzas mientras retira la grasa del mesenterio adherida con otro juego de pinzas.

Coloque el intestino sobre una toalla de papel humedecida con medios de cosecha y elimine cualquier resto de grasa de mesenterio con dos juegos de fórceps. Mantenga el intestino humedecido a lo largo de estos pasos aplicando medios de cosecha periódicamente. Recoge los parches de Peyer retirándolos del intestino con unas tijeras curvas.

Recoge de 5 a 11 parches de Peyer del intestino delgado. Coloque los parches de Peyer en medios de cosecha en frío para los pasos de aislamiento posteriores. Use el lado plano de las pinzas y deslícelo suavemente desde el duodeno hacia el íleon para expulsar el contenido fecal y la mucosidad.

Repite este paso una vez para eliminar la mayor parte de la mucosidad. Use unas tijeras finas con un extremo romo en un punto, inserte el extremo romo en el intestino y corte el intestino longitudinalmente desde el duodeno hasta el íleon. Corta lateralmente el intestino abierto en trozos de dos centímetros.

Colocar las piezas intestinales en un tubo cónico de 50 mililitros con medios de cosecha en frío de 25 mililitros para posteriores pasos de aislamiento. Aísle los linfocitos de la MLN disociándolos suavemente a través de un filtro de células de 70 micrómetros utilizando el émbolo de una jeringa de tres mililitros. Lave el colador de células con cinco mililitros de medios de cosecha en frío.

Granule las células MLN centrifugandolas a 400 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, vuelva a suspender el pellet de células en un medio de cosecha en frío de un mililitro. Lave los trozos de intestino delgado tres veces con 25 mililitros de medios de cosecha en frío invirtiendo el tubo 10 veces.

Deje que las piezas intestinales se asienten y vierta el sobrenadante. A continuación, añada 20 mililitros de solución de ditioeritritol o DTE precalentada al tubo cónico de 50 mililitros que contiene los trozos de intestino y transfiera el contenido a un matraz Erlenmeyer siliconado de 50 mililitros con una barra agitadora. Use un imán grande en el exterior del matraz para sostener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución al tubo cónico de 50 mililitros.

A continuación, agite el tubo al máximo durante 10 segundos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros a través de un colador de células de 70 micrómetros, teniendo cuidado de mantener las piezas de tejido en el tubo original. Pellet las células.

Vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cosecha en frío de 10 mililitros y guárdelo en hielo. Agregue 20 mililitros de solución DTE precalentada al tubo cónico de 50 mililitros que contiene las piezas de intestino y transfiéralo nuevamente al matraz Erlenmeyer siliconado de 50 mililitros que contiene una barra agitadora. Use un imán grande en el exterior del matraz para sostener la barra de agitación y transferir el tejido y la solución al tubo cónico de 50 mililitros.

Agite el tubo en el ajuste máximo durante 10 segundos. Transfiera el sobrenadante a través de un filtro de células de 70 micrómetros al tubo que contiene las células del sobrenadante del primer tratamiento con DTE y centrifuga las células. Vuelva a suspender el pellet celular en ocho mililitros de solución de gradiente de densidad o DG al 44% a temperatura ambiente.

Transfiera la solución de 44%DG de ocho mililitros y la suspensión de celdas a un tubo de fondo redondo de polipropileno de 17 milímetros por 100 milímetros y 14 mililitros. Cubra las celdas con cinco mililitros de solución RT 67%DG. Centrifugar a 1.600 veces la gravedad durante 25 minutos a RT sin usar el freno.

Las células viables forman una capa leucocitaria en la interfaz del 44% y el 67%. Retire la capa de grasa de la parte superior mediante aspiración endouterina. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa leucocitaria en la interfaz y transfiérala a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 40 mililitros de medios de cosecha en frío.

Granule las células centrifugando a 400 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y vuelva a suspender la célula en un medio de cosecha en frío de un mililitro. Retire las células epiteliales de los trozos de tejido intestinal añadiendo 25 mililitros de solución de EDTA precalentada a los trozos intestinales restantes y transfiera el contenido a un matraz Erlenmeyer siliconado de 50 mililitros con una barra de agitación y agite. Sostenga la barra de agitación y deseche con cuidado el sobrenadante mientras mantiene las piezas intestinales en el matraz.

Repita el paso de extirpación de células epiteliales una vez más. A continuación, agregue 50 mililitros de medios de cosecha a temperatura ambiente y revuelva brevemente el contenido con un imán. Luego deje que los trozos intestinales se asienten y deseche con cuidado el sobrenadante.

Agregue 30 mililitros de solución de colagenasa precalentada y revuelva los trozos intestinales. Después de agitar, transfiera el tejido digerido y el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mililitros a través de un colador de células de 70 micrómetros. Disocie suavemente los trozos de tejido restantes utilizando el émbolo de una jeringa de tres mililitros para triturar el filtro.

Lave el filtro con 10 mililitros de medios de cosecha en frío y pelice las celdas. Después de girar, vuelva a suspender el pellet de la celda en ocho mililitros de solución 44%DG a temperatura ambiente. Transfiera los ocho mililitros de suspensión de celda de solución 44%DG a un tubo de fondo redondo de polipropileno fresco de 70 milímetros por 100 milímetros.

Capa base con cinco mililitros de solución de 67%DG a temperatura ambiente y luego centrifugar los gradientes. Retire la capa de grasa de la parte superior mediante aspiración endouterina. Utilice una pipeta Pasteur para cosechar la capa leucocitaria en la interfaz y transfiérala a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 40 mililitros de medios de cosecha en frío.

Finalmente, vuelva a suspender el pellet de celda en un mililitro de medio de cosecha en frío. Cada compartimento inmunitario intestinal se caracteriza por una composición única de subconjuntos de linfocitos. La MLN está compuesta predominantemente por linfocitos T alfa beta, mientras que los linfocitos PP son en su mayoría linfocitos B.

La composición de los linfocitos LP se compone principalmente de linfocitos T alfa beta y linfocitos B. Los IEL son principalmente linfocitos T gamma delta y linfocitos T alfa beta sin esencialmente linfocitos B. Los linfocitos T alfa beta positivos CD8 dentro de los compartimentos LP e IEL expresaron el homodímero alfa CD8 o el heterodímero alfa beta CD8, mientras que los linfocitos T CD8 alfa positivos alfa beta del sitio inductivo expresaron predominantemente el heterodímero alfa beta CD8.

La mayoría de los linfocitos T gamma delta en el compartimento IEL expresaron CD8 alfa, mientras que los linfocitos T gamma delta encontrados en la MLN carecen de CD8 alfa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar dedicar suficiente tiempo y cuidado durante los pasos de aislamiento del tejido para limitar la contaminación entre los compartimentos intestinales. Después de este procedimiento, los linfocitos aislados pueden ser sometidos a estimulación ex vivo, citometría de flujo y otras técnicas para su posterior análisis fenotípico y funcional.