Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico es preparar la glándula salival submandibular murina para la microscopía intravital vertical. Este método puede ayudar a responder preguntas en cualquier campo de investigación que utilice la glándula salival submandibular como órgano modelo, por ejemplo, la inmunología. La principal ventaja de esta técnica es que permite la preparación quirúrgica de la glándula salival para la microscopía intravital vertical, muy utilizada en el campo de la inmunología.

Primero, use una maquinilla de afeitar eléctrica para eliminar el pelo del área de afeitado en un mouse C57 black six. A continuación, frote un bastoncillo de algodón con crema depilatoria y aplíquelo sobre la zona afeitada. Después de unos tres minutos, use pañuelos húmedos para eliminar completamente la crema del área afeitada.

A continuación, retire los soportes para el anillo calefactor y el soporte de cubreobjetos extraíble para preparar el escenario para fijar el mouse. A continuación, afloje los tornillos de la barra de la oreja y los soportes de cubreobjetos fijos. A continuación, pega un trozo de gasa en el centro del escenario para preparar una ropa de cama para el ratón.

Use pegamento para unir un cubreobjetos de 20 milímetros de diámetro a la parte superior de un soporte cilíndrico de metal que forma el cubreobjetos inferior. A continuación, pega un cubreobjetos de 25 milímetros en la parte inferior de un soporte metálico plano formando el cubreobjetos superior. A continuación, coloque el ratón con la espalda en la gasa perpendicular a la cuerda estirada y la cabeza centrada entre las barras de las orejas.

A continuación, utilice una cinta quirúrgica para fijar la parte superior del ratón en el escenario. A continuación, enganche la cuerda en los incisivos frontales superiores, apretando la cuerda hasta que la mandíbula alcance una posición horizontal. A continuación, utilice unas pinzas curvas en ángulo para sacar con cuidado la lengua y asegurarse de respirar.

A continuación, tira de la cola con fuerza y pégala en el escenario. A continuación, alinee las barras de las orejas de modo que se establezca un ángulo de aproximadamente 30 grados entre la barra en el borde del escenario. Para hacerlo, dibuja dos ángulos de 30 grados hacia la derecha y hacia la izquierda en una hoja de papel.

A continuación, coloque la platina transparente sobre el papel para alinear los soportes. Siga moviendo las barras izquierda y derecha hacia adentro simultáneamente para fijar las mordazas en una posición inmóvil y luego apriete el tornillo. Vigile el movimiento del pecho antes, durante y después de fijar la mandíbula.

Coloque una lámpara térmica cerca o una almohadilla térmica debajo del escenario para calentar el mouse. Primero, intente ubicar una ligera protuberancia en la piel para identificar la glándula salival submandibular derecha. Luego, use pinzas finas para levantar el pliegue de la piel en el centro de la protuberancia y crear una incisión de aproximadamente cinco milímetros de largo.

A continuación, use una jeringa con aguja hipodérmica de calibre 25 llena de grasa para vacío para aplicar un anillo de cuatro milímetros de alto de grasa para vacío a lo largo de la superficie del corte. Llene el anillo de grasa con la solución salina para dejar el pañuelo húmedo. Luego, siéntese bajo un microscopio estereoscópico y use una pinza para sujetar firmemente el tejido conectivo conectado a la glándula y use otra pinza para tirar del tejido conectivo distal para que se rompa.

Continúe interrumpiendo el tejido conectivo en la parte superior de la glándula y luego la sección medial. A continuación, extirpe el tejido conectivo lateral en sentido contrario a las agujas del reloj alrededor de la glándula desde la sección medial hasta la rostral. Los principiantes suelen tener más dificultades para alterar el tejido conectivo que rodea la glándula sin dañar la glándula en sí.

A continuación, utilice fórceps para tirar del tejido conectivo unido a la glándula hacia arriba para levantar la parte caudal de la glándula. A continuación, rompe el tejido conectivo por debajo del lóbulo submandibular desde la caudal hacia el extremo rostral. Después de confirmar la ausencia de fugas del anillo de engrase, coloque el cubreobjetos inferior unido a la barra metálica en su soporte ajustable en altura.

Mantenga un ángulo de 60 grados con el ratón mientras coloca el soporte desde la dirección caudal. A continuación, baje el cubreobjetos para que entre en contacto con la glándula. Complete el anillo de grasa en la parte superior del cubreobjetos para formar un nuevo depósito de solución salina.

A continuación, use fórceps para pellizcar cuidadosamente el tejido conectivo unido al lóbulo submandibular y tire de él sobre el cubreobjetos. Mantenga el anillo de engrase a una altura de cuatro milímetros para evitar fugas. Compruebe que el soporte del cubreobjetos superior esté en su posición superior.

A continuación, utilice un tornillo para fijar la barra metálica con el cubreobjetos superior de 25 milímetros al soporte. Para colocar la glándula submandibular en el centro, utilice los tornillos ajustables del soporte para colocar el cubreobjetos. Con los tornillos del soporte ajustable, baje el cubreobjetos superior para tocar la glándula submandibular.

A continuación, observe la forma y el color de la glándula. A continuación, busque posibles burbujas de aire o gotas de solución salina fuera del depósito para descartar fugas. A continuación, apriete todos los tornillos de fijación.

Durante el uso rutinario de este protocolo, el paso crítico es ajustar el cubreobjetos y la grasa para formar una cámara de sellado perfecta sin presionar demasiado o muy poco la glándula salival. A continuación, inserte una sonda de temperatura dentro del depósito de forma que quede cerca del casquillo y pegue el cable de la sonda a la plataforma. Con la glándula submandibular colocada en el centro, aplique un anillo de grasa en el cubreobjetos superior.

A continuación, coloque el anillo calefactor en la parte superior del cubreobjetos y séllelo con la grasa. Por último, pega con cinta adhesiva el tubo del anillo calefactor a la plataforma. Aquí, se demuestra la vasculatura de la glándula submandibular y las células similares a fibroblastos que expresan la proteína fluorescente verde reportera COL1A1.

En la imagen de fluorescencia, los vasos sanguíneos se marcan mediante inyección intravenosa de conjugado de dextrano rojo de Texas, mientras que el colágeno fibrilar presente entre dos lóbulos se puede detectar como la segunda señal armónica. En esta imagen, la luz ductal está marcada con Dextrano azul en cascada después de inyectarlo en el conducto de Wharton y las células T positivas para CD8 con etiqueta de proteína fluorescente verde también son visibles para mostrar la presencia de células T en las glándulas salivales murinas. Estas son las secuencias de las células T de memoria residentes en tejido CD8 positivas para GFP tag.

Estas células T CD8 positivas migran a la glándula salival submandibular. Los vasos sanguíneos de la glándula se marcan mediante inyección intravenosa de dextrano rojo de Texas y los núcleos celulares se tiñen con Hoechst. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 a 40 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante controlar regularmente los signos vitales del ratón y la anestesia. Este procedimiento se puede utilizar en combinación con muchos otros métodos, como la transferencia adoptiva de células inmunitarias marcadas con fluorescencia para responder a preguntas adicionales, como la migración de células inmunitarias en el parénquima de las glándulas salivales. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la migración de células T de memoria residentes en los tejidos en la glándula salival.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar quirúrgicamente la glándula salival submandibular para la microscopía intravital vertical.