Name: Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a aislar y cultivar macrófagos alveolares de ratón y humanos in vitro mediante lavado broncoalveolar y técnicas de dissección. Este método proporciona poblaciones purificadas para investigar inmunología pulmonar y enfermedades respiratorias.

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Agradecemos a Clare Prendergast ayuda con editar el manuscrito. DKN es apoyada por una investigación conceder (#2095) de la Fundación Flinn y TM es apoyado por becas de institutos nacionales de salud (R01HL056643 y R01HL092514). DKN desarrolló los métodos, diseñó el estudio y escribió el manuscrito; OM con los estudios en animales y obtención de la muestra clínica; SB asistida con análisis cytometric del flujo y separación celular; TM bajo la supervisión de los estudios y revisaron el manuscrito.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y la Junta de revisión institucional (IRB) en el Hospital y centro médico de San José.
1. aislamiento de AMs del líquido murino el lavado broncoalveolar (BAL)
<ol><li>Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con preparación almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.</li>
	<li>Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.</li>
	<li>Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.</li>
	<li>Inyectar 10 mL helado tamponada fosfato salino (PBS) en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Absorber el flujo de sangre con almohadillas de algodón absorbente. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y entonces están listos para el lavado.</li>
	<li>Suavemente abrir la piel y del músculo en el cuello para exponer la vía aérea. Suprimir cuidadosamente los músculos adyacentes, cartílagos y tejido graso sin dañar la tráquea.</li>
	<li>Hacer una pequeña incisión (< 2 mm) en la tráquea a la laringe posterior. Esta incisión debe ser lo suficiente como para insertar un catéter en mientras que la tráquea está todavía unida a la laringe. Insertar un catéter de 22G de 1 pulgada sin aguja dentro de la tráquea hacia los pulmones. Asegurar el catéter con una sutura de seda trenzada (4-0; no absorbible) con un nudo cuadrado. Nota: El catéter debe recortarse según el tamaño del ratón. Catéteres muy cortos o largos tienden a tener fugas o romper la vía aérea durante el lavado. Longitud del catéter debe ser tal que cuando introduce completamente los restos de punta bien dentro de la tráquea y no llegar a los bronquios primarios.</li>
	<li>Conecte una jeringa de 1 mL con tampón BAL helada (Ca2 + y Mg2 + libre PBS + 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético, EDTA) con el catéter e infundir lentamente el búfer en los pulmones. Esto inflará los pulmones. Mantenga la jeringa atada catéter durante cinco segundos y luego aspirar el líquido del lavado tirando suavemente el pistón. Esto desinfla los pulmones. Recoger el líquido en un tubo cónico de 15 mL a hielo.</li>
	<li>Repita paso 1.10 para nueve veces más y el líquido del lavado de la piscina. No exceda 1 mL de tampón por descarga, exceda la capacidad del pulmón y provocar su ruptura.</li>
	<li>Eutanasia el ratón con sobredosis de CO2 por protocolo de IACUC aprobado.</li>
	<li>Centrifugar el líquido 10 mL BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células del BAL. PRECAUCIÓN: El pellet puede ser muy pequeño, así que tenga cuidado al aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 100 μL de buffer (PBS + 2% suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) + 1 mM EDTA 25 mM de ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)) de flujo/clasificación del BAL.</li>
	<li>Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc añadiendo bloques de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.</li>
	<li>Realizar tinción con fluorescencia menos uno (FMO) del anticuerpo y solo mancha controla11,25. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por análisis de citometría de Flujo unicelular software de análisis apropiado (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Aislar AMs por un celular activado por fluorescencia clasificador (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Como alternativa, tipo AMs en 1 mL de tampón de lisis (véase Tabla de materiales) suplementado con 10 μL/mL β-mercaptoetanol para extracción de RNA.</li>
</ol>2. aislamiento de AMs de pulmón de ratón, suspensión unicelular
<ol><li>Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.</li>
	<li>Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.</li>
	<li>Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.</li>
	<li>Inyectar 10 mL PBS helado en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y están listos para la cosecha.</li>
	<li>Diseccionar a los pulmones por cortar la tráquea, vasos sanguíneos y ligamentos en un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de frío medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM). Mantener en hielo hasta el siguiente paso.</li>
	<li>Eutanasia el ratón con sobredosis de CO2 por protocolo de IACUC aprobado.</li>
	<li>Transferir los pulmones perfundidos en una placa de cultivo estéril y libre de pirógenos de 60 mm con 3 mL DMEM. Con ayuda de fórceps de disección embromar hacia fuera de las vías respiratorias y otros materiales de tejido pulmonar no duro, si está presente. Pique el tejido pulmonar con un bisturí para < tamaño 1 mm.</li>
	<li>Añadir 300 μg/mL TL somatométrica y 5 U/mL DNasa I, mezclar mediante pipeteo e incubar a 37° C en una incubadora durante 25 minutos. Mezclar suavemente una vez transfiriendo después de 10 minutos.</li>
	<li>Pasar los pulmones disociados a través de un tamiz de célula μm 100 instalado en un tubo cónico de 50 mL. Use la parte posterior de un émbolo de la jeringa de 1 mL para hacer puré de grumos de células en el filtro. Lavar el filtro con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 20 mL de tampón de lavado.</li>
	<li>Repita los pasos 2.12 y 2.13 dos veces, cambiando el filtro y el tubo cada vez. Previo remojo el filtro en tampón de lavado durante más de cinco minutos aumenta la producción de AM. Preparar suspensión unicelular mediante la adición de 100 μL de buffer para el precipitado de células de flujo/clasificación.</li>
	<li>Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor de Fc al agregar bloque de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.</li>
	<li>Realizar coloración junto con FMO y controles solo mancha11,25del anticuerpo. Evaluar el pulmón células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.</li>
	<li>AMs de tipo por un clasificador de célula (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Por otra parte, clasificar AMs en 1 mL de tampón de lisis con β-mercaptoetanol de 10 μL/mL para la extracción de RNA.</li>
</ol>3. aislamiento de AMs de humano líquido del BAL
<ol><li>Organizar la transferencia del líquido del BAL humano de la clínica al laboratorio a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar el líquido del BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células de BAL11.</li>
	<li>Lavar el precipitado con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA) y centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Resuspender las células del BAL son en 100 μL de buffer de flujo/clasificación (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES).</li>
	<li>Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc agregando bloque Fc humano (clon Fc1.3070, 25 μg/mL) y de incubación en hielo durante 20 minutos.</li>
	<li>Realizar anticuerpos coloración junto con FMO y controles solo mancha11,24. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.</li>
	<li>AMs de tipo por un clasificador de células (véase Tabla de materiales) directamente en el medio de cultivo 1 mL humano AM o 1 mL de tampón de lisis suplementado con 10 μL/mL de β-mercaptoetanol.</li>
</ol>4. in vitro cultura de AMs
<ol><li>Siguiendo la clasificación de la célula, recoger las células por centrifugación a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>AMs humanos de resuspender en 1 mL medio de cultivo de humanos AM [Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultivo sobrenadante (como fuente de factor (M-CSF), concentración final de 100 U/mL estimulante de colonias de macrófagos), piruvato de sodio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Del mismo modo, resuspender ratón AMs en 1 mL ratón AM medio de cultivo [DMEM suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como una fuente de M-CSF, concentración final de 100 U/mL), 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM HEPES y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional )].</li>
	<li>Enumerar el trypan azul excepto células viables por un contador celular y ajustar la concentración de células viables en 1 x 106/ml. Nota: Idealmente, por a 5 x 105 AMs puede ser aislado de líquido del BAL de un ratón macho de 8-10 semanas viejo C57BL/6. La producción de AM de la recopilación de pulmón de ratón es variable y puede ser ligeramente menor que el líquido del BAL del ratón. Rendimiento de AM de líquido del BAL humano depende del volumen del líquido del BAL, el volumen total de solución salina que se utiliza en el lavado y condición clínica del paciente.</li>
	<li>Basado en el rendimiento y la necesidad experimental, las células en portaobjetos de la cámara, platos de cultura o frascos de cultivo de la semilla. Idealmente, la semilla las AMs a 1 x 105/ml con medio de 10 mL en un matraz de cultivo de tejidos T25.</li>
	<li>Incubar las células en una incubadora humidificada de 37 ° C con 5% CO2 ambiente. Nota: AMs crecerá como células adherentes y son de crecimiento extremadamente lento (tiempo de duplicación > 7 días).</li>
	<li>A las 24 horas post siembra, AMs debe ser adherente y no ser separado por un suave cambio de medio de cultivo. Quitarlo del medio por la aspiración de un extremo y llenar con medio fresco, previamente calentado a 37 ° C. Nota: Las células pueden utilizarse ahora para evaluar AM fisiología o los efectos de los estímulos. AMs en diapositivas de la cámara pueden ser convenientemente teñidas con anticuerpos apropiados y son ideales para la visualización microscópica. Para la evaluación de la citometría de flujo, AMs son cosechado por la incubación con no enzimática celular disociación solución.</li>
	<li>Aspire el medio de cultivo y añadir solución de disociación lo suficiente para cubrir la superficie de cultivo (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incube a 37 ° C durante 5-10 minutos. No raspar será necesario, y no se recomienda para raspar las células mecánicamente. Golpee ligeramente los lados, añadir 1-2 mL buffer de flujo/clasificación y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para retirar la mayoría de las células adherentes.</li>
	<li>Estudios de RNA, lyse las células directamente en la placa de cultivo mediante la adición de tampón de lisis.</li>
</ol>

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<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
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Los autores no tienen conflictos de intereses.

AMs son macrófagos de pulmón-residente de larga vida que pueblan los pulmones comienza al nacer y perdurable sobre la vida entera26. Sus funciones en la fisiología pulmonar Patología de7 y12 y su potencial para predecir de autoinmunidad pulmonar24 han sido reconocidos. Porque AMs tiene una presencia a largo plazo en los pulmones11,27 y participan en la activación y la ...

El microambiente del pulmón es un ecosistema único complejo con un conducto de aire elaborado y vasculatura. El aire inhalado viaja a través de la tráquea y numerosas ramificaciones de bronquios y bronquiolos antes de llegar a los alvéolos, donde ocurre el intercambio de gases sangre aire. Debido a la interacción directa con la atmósfera, la superficie respiratoria requiere protección contra los efectos potencialmente perjudiciales de partículas en suspensión y contaminantes. Un número de barreras físicas, químicas e inmunológicas protege a los pulmones. En particular, el despliegue de los fagocitos en la superficie respiratoria sirve un sistema importante de primera línea de defensa. Los macrófagos alveolares (AMs) son un tipo de fagocitos reside en el pulmón, y constituyen la inmensa mayoría de la piscina de macrófagos del pulmón. Como su nombre lo indica, AMs se localizan sobre todo a la luz alveolar y se presentan como células sésiles que constantemente muestra la atmósfera ambiente y comunican con el epitelio alveolar1. En estado estacionario los pulmones, más del 95% de los fagocitos en el espacio alveolar son AMs2, cuya composición puede alterar debido a inflamación, infección o exposición crónica a contaminantes.
AMs participan en una amplia gama de funciones que pueden ser locales a los pulmones o de importancia sistémica. Por ejemplo, AMs son esencial en el desarrollo y el óptimo funcionamiento de los pulmones; vigilancia inmune; y la separación de los desechos celulares, invasión de patógenos y partículas inhalado3,4,5,6,7. Agotamiento objetivo del AMs es conocido por afectar la separación de virus respiratorios y bacterias4,8. Además de su papel como los fagocitos y los defensores de una primera línea de la homeostasis pulmonar, AMs se conocen para funcionar como células presentadoras de antígeno en obtención de T de la célula de inmunidad9, potenciando la eficacia de la vacuna intranasal10 y influir en la restricción pulmonar autoinmunidad después de trasplante de pulmón11,12. Deficiencia en la función de AM se ha relacionado con la proteinosis alveolar pulmonar (PAP), una condición que resulta de una mutación genética, malignidad o infección que impide la separación de surfactantes pulmonares13,14. Trasplante de AMs ahora se está estudiando como un enfoque terapéutico para el tratamiento del PAP 15,16.
AMs se sabe que se originan durante la embriogénesis y a persistir en los pulmones durante toda la vida sin sustituidos por circular leucocitos2,17. Aunque, AM es indetectable en los pulmones homeostáticos, diferentes niveles de volumen de AM se han divulgado en ciertas condiciones clínicas, incluyendo infección por el influenza virus4, myeloablative irradiación18, exposición a endotoxinas 19y20de la tercera edad. AMs se cree que uno mismo-renovar vía una baja proliferación17,21, pero algunos estudios recientes afirman que los monocitos pueden dar lugar a una población de22,de macrófagos intravasculares pulmonares23 bajo condiciones experimentales, pero la funcionalidad de estos macrófagos pulmonares recién convertidos todavía tienen que definirse en enfermedades pulmonares. Por otra parte, entender el umbral de estímulo en el contexto de activación de AM es un área potencialmente interesante, como el pulmón trata de conservar un equilibrio entre las señales inflamatorias y los mecanismos inmunoreguladores.
Las alteraciones fisiológicas o patológicas que conducen a la pérdida de regulación inmune están importantes para evaluar en diversos contextos clínicos (p. ej., infecciones respiratorias, enfermedad inflamatoria pulmonar y enfermedad pulmonar fibrótica). Sin embargo, AMs son cada vez más reconocido como indicadores o incluso determinantes de la salud pulmonar11,24. Actualmente, no están disponibles para la recolección, caracterización y mantenimiento AMs de seres humanos y modelos preclínicos murinos protocolos unificados. Falta de un consenso sobre precursores de AM y fenotipos y la ausencia de una metodología detallada han sido la gran barricada en descifrar funciones de AM en la enfermedad y la salud pulmonar. El siguiente protocolo ofrece una identificación definitiva, aislamiento y en vitro cultura estrategia que mucho avanzar en la comprensión del comportamiento de AM y facilitar estudios diagnóstico y terapéuticos orientada a AM.

<table><tbody><tr><td>Solución disociadora de células no enzimáticas</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Opot</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Catéter&nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura trenzada de seda no absorbible&nbsp;</td><td>Kent Científico</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato S &nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Fc bloque&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis (kit de ARN PureLink)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células FACSAria II&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina &nbsp; (Cetatesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina&nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; Filtro de células M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bloque Fc Humano</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Solución de azul de tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino Atlanta</td><td>Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr> línea <tr><td>celular L-929</td><td>Colección de cultivos</td><td>tipo americano ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Matraz de cultivo de tejidos</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>plato de cultivo de 60 mm&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico&nbsp;</td>Tubo cónico <td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa analizador</td><td>celular BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Software</td></tr><tr><td>de análisis Anti-CD45 (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clon I3/2.3, FITC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clon M1/70, PerCP/Cy5.5</td></tr><tr><td>conjugado Anti-CD11c (Ratón)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>565452 Clon N418, BV 421 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clon AF6-120.1, PE/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Ratón)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clon E50-2440, PE-CF594 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clon 551, PE conjugado</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clon BM8, APC/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clon HK1.4, BV605 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clon X54-5/7.1, BV711 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Ratón)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clon M1/69, BV510 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Ratón)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clon OX-62, BV650 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clon 927, APC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Ratón)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clon SA011F11, BV785 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clon HI30, AF488 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clon M1/70, PE/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clon L243, APC/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clon 7-239, APC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clon 15-2, PE conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clon GHI/61, BV421 conjugado</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo in vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Los macrófagos alveolares son macrófagos terminalmente diferenciados, residente de pulmón de origen prenatal. Los macrófagos alveolares son únicos en su larga vida y su importante papel en el desarrollo pulmonar y función, así como sus respuestas localizadas del pulmón a la infección y la inflamación. Hasta la fecha, ningún método unificado para la identificación, aislamiento y manejo de los macrófagos alveolares de los seres humanos y ratones existe. Este método es necesario para estudios sobre estas importantes células inmunitarias innatas en varias configuraciones experimentales. El método descrito aquí, que puede ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio, es un enfoque simplificado para cosechar los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar o de tejido pulmonar y mantenimiento in vitro. Porque los macrófagos alveolares se presentan principalmente como células adherentes en los alvéolos, el enfoque de este método es el desalojo antes de la cosecha y la identificación. El pulmón es un órgano altamente vascularizado, y varios tipos de células de origen mieloide y linfoide habitan, interactúan y son influenciados por el microambiente del pulmón. Utilizando el conjunto de marcadores de superficie que se describe aquí, los investigadores pueden fácilmente y sin ambigüedades distinguir los macrófagos alveolares de otros leucocitos y purificarlos para aplicaciones posteriores. El método de cultivo desarrollado en este documento apoya a ambos humanos y ratón macrófagos alveolares para el crecimiento in vitro y es compatible con los estudios celulares y moleculares.

El enfoque de citometría de flujo para identificar ratón AMs se muestra en la figura 1. Esto incluye el análisis de un conjunto mínimo de marcadores de superficie necesarios distinguir AMs de otros fagocitos reside en el pulmón o infiltración pulmonar. Análisis diferencial es necesaria para identificar positivamente a AMs de intersticiales macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monocitos y macrófagos derivados de monocitos pulmonares que se producen en...

Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar macrófagos alveolares humanos y de ratones de los pulmones y el líquido de lavado broncoalveolar y desarrollar el método para su cultivo in vitro. Este método puede ayudar a responder algunas preguntas clave en el campo de la inmunología pulmonar, como el papel de los macrófagos alveolares en la infección respiratoria, la inflamación y la autoinmunidad. La principal ventaja de esta técnica es poder distinguir los macrófagos alveolares de los demás leucocitos pulmonares y obtener una población de macrófagos alveolares altamente purificados con fines experimentales.Coloque un ratón anestesiado sobre una superficie de disección con el lado ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmico en los ojos para prevenir la deshidratación. Limpie toda la superficie ventral del ratón con almohadillas de preparación con alcohol estéril, saturadas con isopropanol al 70%, para desinfectar.Monta el ratón con las cuatro patas retenidas. Abra suavemente la cavidad abdominal con herramientas de microdisección. Se debe tener cuidado de abrir la mayor cantidad de área posible sin dañar ningún órgano visceral ni crear tejido que sobresalga.Abra suavemente la cavidad torácica haciendo una incisión lenta en la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica se puede extirpar de lado a lado. Se debe tener mucho cuidado de no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.Localiza la vena cava inferior y haz una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbentes para absorber la sangre. Inyecte 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato helado en el ventrículo derecho para eliminar las células sanguíneas circulantes.Absorbe el flujo de sangre con almohadillas de algodón absorbentes. Una vez completamente perfundidos, los pulmones aparecerán blanqueados y entonces estarán listos para el lavado. Abra suavemente la piel y el músculo del cuello para exponer las vías respiratorias.Extirpe cuidadosamente los músculos, cartílagos y tejidos grasos adyacentes, sin dañar la tráquea. A continuación, haga una pequeña incisión en la tráquea, posterior a la laringe. Esta incisión debe ser suficiente para insertar un catéter mientras la tráquea aún está unida a la laringe.El paso más crítico en la recolección de líquido BAL es conectar de forma segura un catéter a la tráquea que minimizará las fugas durante el lavado. Inserte un catéter de calibre 22 de una pulgada sin aguja en la tráquea hacia los pulmones. Asegure el catéter con una sutura trenzada de seda y un nudo cuadrado.Al tener las manos robustas y seguir este paso, previene lenta y suavemente la ruptura de la tráquea y los pulmones. Conecte una jeringa de un mililitro, llena de tampón BAL helado al catéter e instilar lentamente el tampón en los pulmones. Esto inflará los pulmones.Mantenga la jeringa conectada al catéter durante cinco segundos y luego aspire el líquido de lavado tirando suavemente del pistón. Esto desinflará los pulmones. Recoja el líquido en un tubo cónico de 15 mililitros, colocado sobre hielo.Repita el inflado y el desinflado nueve veces más, y acumule el líquido de lavado. No exceda un mililitro de tampón por lavado, ya que eso puede exceder la capacidad pulmonar y provocar su ruptura. Centrifugar los 10 mililitros de líquido BAL a 250 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.El pellet de celda contiene células BAL. Vuelva a suspender las células BAL en 100 microlitros de tampón de clasificación de flujo. Proceda a teñir y clasificar las celdas como se describe en el protocolo de texto.Prepare un ratón anestesiado para la disección, realice incisiones y sangre el ratón como antes. Inyecte 10 mililitros de PBS helado en el ventrículo derecho para enjuagar las células sanguíneas circulantes. Una vez completamente perfundidos, los pulmones aparecerán blanqueados y estarán listos para la cosecha.Disecciona los pulmones cortando la tráquea, los vasos sanguíneos y los ligamentos en un tubo cónico de 15 mililitros, con cinco mililitros de DMEM frío. Manténgalo en hielo hasta el siguiente paso. Transfiera los pulmones perfundidos a una placa de cultivo estéril y libre de pirógenos de 60 milímetros con tres mililitros de DMEM.Con la ayuda de pinzas de disección, extraiga las vías respiratorias y otro material duro de tejido no pulmonar, si está presente. Picar el tejido pulmonar con un bisturí hasta obtener un tamaño de menos de un milímetro. Agregue 300 microgramos por mililitro de Liberase TL y cinco unidades por mililitro de DNAse uno.Mezclar por pipeteo e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora durante 25 minutos. Después de 10 minutos, mezcle suavemente una vez pipeteando. Pasar los pulmones disociados a través de un filtro de células de 100 micras instalado en un tubo cónico de 50 mililitros.Use la parte posterior de un émbolo de una jeringa de un mililitro para triturar los grumos de células en el filtro. Lave el filtro con 20 mililitros de tampón de lavado. Centrifugar a 500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 20 mililitros de tampón de lavado. Repita los pasos de colado y centrifugación dos veces, cambiando el filtro y el tubo cada vez. Finalmente, prepare la suspensión de una sola celda agregando 100 microlitros de tampón de clasificación de flujo al pellet de celda.Realice la tinción de anticuerpos y la clasificación de células, como se describe en el protocolo de texto. Después de la clasificación de las células, recoja las células centrifugando a 250 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Vuelva a suspender los AM de ratón en un mililitro de medio de cultivo AM de ratón.En función del rendimiento y la necesidad experimental, siembre las células en portaobjetos de cámara, placas de cultivo o matraces de cultivo. Lo ideal es sembrar los AM a 100.000 por mililitro con 10 mililitros de medio en un matraz de cultivo de tejidos T 25. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.A las 24 horas después de la siembra, los AM deben ser adherentes y no se desprenderán con un cambio suave de medio de cultivo. Retire el medio por aspiración de un extremo y reponga con medio fresco precalentado a 37 grados centígrados. Finalmente, observe el matraz bajo un microscopio invertido.Se muestra la evaluación por citometría de flujo de macrófagos alveolares en líquido de lavado broncoalveolar de ratón. Los macrófagos alveolares son positivos identificados por ser CD45 positivos, CD11c positivos y Siglec-F positivos. Aquí se muestra un resultado representativo de macrófagos alveolares de ratón cultivados in vitro durante 24 horas.Las células se han vuelto adherentes y un cambio suave del medio de cultivo no las desprenderá. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos horas, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo distinguir los macrófagos alveolares de ratón y humanos de otras células pulmonares.También, como los procedimientos para obtener una hermosa población de macrófagos alveolares para experimentos posteriores. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no todos los macrófagos o fagocitos residentes en el pulmón son macrófagos alveolares. Los macrófagos alveolares son un tipo de células especializadas presentes en los pulmones desde el nacimiento.Para el aislamiento de macrófagos alveolares, la atención debe centrarse en métodos de extracción viables del microambiente alveolar. El método de cultivo in vitro desarrollado aquí apoya el crecimiento de macrófagos alveolares en condiciones de laboratorio que se pueden utilizar en ensayos moleculares y celulares. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transferencia de células adoptivas, la presentación de antígenos y la evaluación de la respuesta a estímulos inflamatorios para responder preguntas adicionales sobre la biología de los macrófagos alveolares.

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El protocolo utiliza la criopreservación de monocitos junto con su diferenciación masiva en macrófagos. Luego, los macrófagos cosechados se pueden sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.

Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento primario de monocitos de sangre humana, así como su diferenciación en macrófagos y células dendríticas y el montaje con células epiteliales en un modelo pulmonar humano multicelular. Se comparan las respuestas biológicas de las cocultivos compuestas de células inmunitarias diferenciadas de los monocitos recién aislados o descongelados, tras la exposición a estímulos proinflamatorios.

Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Aprende a aislar y cultivar macrófagos alveolares de ratón y humanos in vitro mediante lavado broncoalveolar y técnicas de dissección. Este método proporciona poblaciones purificadas para investigar inmunología pulmonar y enfermedades respiratorias.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

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