Name: Un método para el estudio del polimorfismo C924T del gen Receptor tromboxano A2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprende a analizar el polimorfismo C924T del gen TBXA2R mediante extracción de ADN, PCR y análisis RFLP. Este método económico permite identificar pacientes de alto riesgo para procesos aterotrombóticos en investigación de trombosis.

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Este proyecto fue parcialmente financiado por % 60 que Ateneo otorga del Ministero dell'Università, Italia a S.M. y E.T. También recibimos contribuciones parciales a la investigación de gastos por el Departamento de medicina, Oral y Ciencias biotecnológicas de la Universidad de Chieti "G. d'Annunzio".

El protocolo sigue las directrices de la Comisión de ética de investigación médica de la Universidad de Chieti.
1. reactivo configuración
<ol><li>Preparar el tampón Tris-EDTA (TE) (pH 8.0). Añadir 200 μL de EDTA 0,5 M y 1 mL de Tris-Cl 1 M en un matraz y llevar a 100 mL con agua estéril. Concentración final de tampón TE: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Almacenar a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparar 1 L de 10 x buffer de electroforesis de solución madre (TBE). Disolver 108 g de Tris Base, 55 g de ácido bórico y 40 mL de EDTA 0,5 M (pH 8) en un vaso y llevar a volumen de 1 L con agua destilada. Tienda a TA.</li>
	<li>Preparar el gel colorante de carga. Disolver 0,25 g de bromofenol azul, 0,25 g de xileno cyanol FF, 50 g de glicerina, 1 mM EDTA (pH 8) en 60 mL agua destilada o desionizada y llevar a un volumen de 100 mL con agua estéril. Almacenar a 4 ° C (algunos meses) o a-20 ° C (por años)</li>
	<li>
Preparar 200 mL de gel de agarosa al 2%. Uso fresco o, alternativamente, almacenar solidificó a temperatura ambiente por hasta varias semanas.
	<ol>
<li>Disolver 4 g de agarosa en 200 mL de buffer de x TBE 1 en un vaso de precipitados de 600 mL. Mezclar con un mezclador magnético de alrededor de 5 minutos hasta que la agarosa se suspende completamente.</li>
		<li>Calentar la solución de agarosa al 2% en agua hirviendo o en una placa caliente (por unos 10 minutos, hasta que la agarosa se disuelva completamente). Tenga en cuenta que el vaso con el gel de la agarosa debe cubrirse con papel de aluminio. Por otra parte, calentar el vaso destapado en el microondas a temperatura alta unos 3 – 5 minutos.</li>
		<li>Agite la solución de agarosa al 2% utilizando un mezclador magnético, comprobando que la agarosa se disuelva completamente. Nota: Las partículas de agarosa aparecen como granos translúcidos antes de la disolución completa. Puede ser necesario calentar las partículas durante varios minutos (5 – 10 min.).</li>
		<li>Si una porción almacenada del gel de la agarosa se utiliza calentar el vaso, cubierto con papel de aluminio, en un baño de agua caliente (a unos 60 ° C) hasta que la agarosa se disuelve. Extraiga con una pipeta Pasteur "indicios" de agarosa solidificada de la superficie antes de verter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificación de DNA
<ol><li>
Realice lo siguiente antes de comenzar la purificación:
	<ol>
<li>Utilizar muestras de sangre humana fresca, o descongelar sangre congeladas las muestras rápidamente (de unos 2 a 3 minutos) en un baño de agua (a 37 ° C) aplicando una suave agitación y luego alcancen la RT antes de su uso.</li>
		<li>Mezclar las muestras de sangre fresca o descongelada invertir los tubos varias veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniciar el procedimiento de purificación siguiendo los protocolos del proveedor de 100 μl de volumen de elución.</li>
	<li>
Cuantificar y calcular la pureza de ADN midiendo la absorbancia a 260, 280 y 320 nm.
	<ol>
<li>Utilizar agua estéril para diluir las muestras y para calibrar el espectrofotómetro.</li>
		<li>Aplicar la siguiente fórmula, para calcular la concentración de la muestra de ADN = 50 μg/mL x (un260 − A320) x factor de dilución y la pureza del ADN = (un260 − A320) / (un280 − A320), con una aceptable relación entre 1.7 y 1.9.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR la amplificación de las muestras de ADN
<ol><li>Preparar 25 μl de mezcla de reacción en un tubo de micro-amplificación de 0,2 mL, como se muestra en la tabla 1.</li>
	<li>Llevar a cabo una amplificación mediante PCR de las muestras de ADN purificadas utilizando a un termociclador automatizado, siguiendo el programa de amplificación que se muestra en la tabla 2.</li>
	<li>Al final de la amplificación de PCR, detener las reacciones de PCR por dejar las muestras de ADN a 4 º C.</li>
</ol>4. RFLP de productos de PCR
<ol><li>Preparar 22,5 μl de la solución de mezcla maestra para cada muestra, de manera que el las enzimas de restricción digiere los productos PCR, como se muestra en la tabla 3.</li>
	<li>2,5 μl del producto de PCR de transferencia a un nuevo tubo PCR para cada muestra, utilizando una pipeta y extremidades de filtro.</li>
	<li>Añadir 22,5 μl de la solución de mezcla maestra de digestión en los tubos que contiene el producto PCR de cada muestra, utilizando una pipeta y extremidades de filtro.</li>
	<li>Incubar la mezcla de reacción (solución de mezcla maestra y producto de la polimerización en cadena) a 37 ° C durante 4 horas.</li>
</ol>5. gel electroforesis análisis de muestras de PCR-RFLP
<ol><li>Tinción del gel de agarosa mediante la adición de bromuro de etidio (EtBr) a 0,5 μg/mL el gel durante 10 minutos EtBr se une al DNA, que puede ser visualizado bajo luz ultravioleta (UV). PRECAUCIÓN: Es importante utilizar guantes y otros dispositivos de protección durante su manipulación, almacenamiento y disposición de EtBr, ya que es un mutágeno con carcinogenicidad potencial.</li>
	<li>Verter el gel de agarosa preparado en una bandeja de gel con el peine bien en su lugar y esperar hasta que se solidifica.</li>
	<li>Colocar el gel de agarosa solidificada en la caja de gel (unidad de electroforesis).</li>
	<li>Llene la caja de gel con 1 x TBE hasta cubre el gel.</li>
	<li>Con una pipeta y extremidades de filtro, carga 6 μl de la digest amplificada DNA (específicamente, carga 5 μl de cada muestra y 1 μl de gel colorante de carga) en los pocillos del gel de agarosa. Agregar un marcador del tamaño de ADN en un separado bien en paralelo con las muestras.</li>
	<li>Correr el gel para 20-30 min a 100 V.</li>
	<li>Con un transiluminador UV, visualizar los fragmentos de ADN cortados o los productos PCR sin digerir, comparando fragmentos con el marcador del tamaño de ADN y registrar los resultados por la fotografía siguiendo las instrucciones del fabricante. PRECAUCIÓN: Utilice los dispositivos de protección (gafas de seguridad o una máscara) alrededor de las fuentes de luz UV.</li>
</ol>

<ol><li>Shen, R. F., Tai, H. H. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Article/Abstract/25327">Thromboxanes: synthase and receptors.</a> J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).</li>
<li>Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+chromosomal+mapping+of+the+human+thromboxane+A2+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene.</a> J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).</li>
<li>Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+thromboxane+synthase%2C+prostacyclin+synthase+and+thromboxane+receptor+in+atherosclerotic+lesions%3A+correlation+with+plaque+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition.</a> Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).</li>
<li>Cipollone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Polymorphism+in+the+Cyclooxygenase+2+Gene+as+an+Inherited+Protective+Factor+Against+Myocardial+Infarction+and+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke.</a> JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).</li>
<li>Fontana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+polymorphisms+of+the+thromboxane+A2+receptor+gene+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers.</a> Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).</li>
<li>De Iuliis, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1098882317300060">Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat.</a> pii. (17), (2017).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).</li>
<li>Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+polymorphism+discovery+resource+for+research+on+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.</a> Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).</li>
<li>Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABO+genotyping+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">ABO genotyping by polymerase chain reaction.</a> J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).</li>
<li>Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+detection+by+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).</li>
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<li>Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+allele-specific+PCR+and+fluorescence+melting+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves.</a> Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).</li>
<li>O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+typing+by+apyrase-mediated+allele-specific+primer+extension+on+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays.</a> Nucleic Acids Res. 30 (15), e75(2002).</li>
<li>Pickering, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+DNA+ligation+and+rolling+circle+amplification+for+the+homogeneous%2C+end-point+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 30 (12), e60(2002).</li>
<li>Chatterjee, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+bacterial+and+P1+artificial+chromosome-nested+deletions+for+identifying+position-specific+single-nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+discrimination+using+fluorogenic+probes+and+the+5%27+nuclease+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Anal%22%5BJournal%5D)">Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.</a> Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scalable+SNP+genotyping+assay+using+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology.</a> Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente estudio, hemos descrito una metodología que permite genotyping paciente para investigar el papel postranscripcional de polimorfismos de C924T (rs4523) situado en la región 3' del gen TBXA2R. En primer lugar, este método se basa en la extracción de ADN de la sangre entera. En particular, este primer proceso consiste en una purificación de ADN humano total, genómica y mitocondrial, de muestras de sangre entera frescas o congeladas, tratados con EDTA (citrato o heparina). Para el almacenamiento de corto plazo de muestras de sangre, almacenar a 2-8 ° C durante 10 días. Para el almacenamiento durante 10 días, almacenar las muestras a-70 ° C. El proceso de purificación automatizado consta de 4 pasos: lyse, enlazar, lave y responsables. En segundo lugar, el método se basa en la amplificación por PCR de la porción del gen TBXA2R que contiene la mutación C924T. Por último, se realiza la identificación del tipo salvaje o genotipo mutante con un análisis de enzimas de restricción (RFLP) en gel de agarosa.
Pasos críticos en el protocolo son los siguientes: (i) en caso de que una porción del gel de agarosa almacenada en el RT se utiliza, la agarosa solidificada puede ser volver a disuelto en baño de agua hirviendo (a 60 ° C por unos 15-20 min) o en un horno de microondas (3-5 min) antes de verter. Nota: Afloje la tapa al volver a derretir la agarosa en un frasco. (ii), además, al volver a calentar la agarosa, evaporación causará un aumento de su concentración. Por esta razón, podría ser útil compensar añadiendo un pequeño volumen de agua. (iii) fragmentos de menos de 1.000 bp fueron distinguidos por el gel de agarosa y almacenador intermediario TBE se recomienda para obtener la mejor separación posible. (iv) preferimos utilizar un gel de agarosa en lugar de un gel de poliacrilamida, debido a la preparación de este último es más difícil y lleva mucho más tiempo para configurar. (v) la elección del tiempo de la electroforesis en gel se basa en el tamaño esperado de los productos de amplificación. Basado en este protocolo, es suficiente para llevar a cabo una electroforesis durante 20-30 min a 100 V en gel de agarosa al 2%, ya que el tamaño de la PCR los fragmentos oscila entre 100-500 BP (vi) es obligatorio para obtener de 10 a 50 ng de una plantilla de buena calidad DNA extraída de muestras humanas . Por esta razón, preferimos utilizar una purificación de ADN automatizada en lugar de uno manual o semiautomático. (vii) Prepare la mezcla maestra reacción para amplificación por PCR y la solución de mezcla maestra para la digestión de productos PCR, agregando 10% más (para tener en cuenta la pérdida de líquido durante el pipeteo) al volumen calculan multiplicado por el número de muestras para el volumen de para una muestra de ADN.
La trampa más frecuente del método es la presencia de productos de amplificación adicional debido a un programa del termociclador incorrecta, una preparación de mezcla maestra de amplificación incorrecta o una contaminación de la plantilla de ADN. Además, la ausencia de productos de la PCR puede ser inactivada Taq polimerasa o un termociclador incorrecto funcionamiento. Además, la presencia de fragmentos inesperados puede ser debido a la contaminación del producto PCR o a una digestión incompleta de una enzima inactiva, muy poca cantidad de enzima de la restricción de volumen o un tiempo de incubación demasiado corto.
En los últimos años, se han utilizado las siguientes metodologías para el análisis SNP con la técnica de PCR: hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo corto11, PCR alelo-específica12, cartilla extensión de microarrays de DNA13 , ligadura del oligonucleótido14de ensayo, dirigir la secuencia de la DNA para la identificación de polimorfismos de nucleótido posición específica15, Taqman método16, extracción mediante desorción/ionización del Laser Espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF)17y18de GeneChips. Estos métodos no son ideales porque no son fáciles de utilizar o requerir el equipo costoso. Por el contrario, el método de PCR-RFLP que se describe en este estudio es barato, fácil de usar, cómodo, tiene una alta eficiencia y permite la rápida identificación del polimorfismo C924T. Una limitación para el presente método es que sólo se puede utilizar para un pequeño número de SNPs y unas muestras en una sesión de trabajo.
Para futuras aplicaciones, este método puede utilizarse para estudios predictivos sobre la formación de placa y la progresión de aterosclerosis mediante el análisis de los genotipos de paciente para el polimorfismo TBXA2R C924T. Además, este método podría identificar sujetos más susceptibles a los procesos aterotrombóticos, en particular, pacientes de alto riesgo trataron con aspirina. Por último, este método podría aplicarse para estudiar otros polimorfismos implicados en la medicina personalizada para drogas específicas (por ejemplo, anticoagulantes y anticonvulsivos) para entender la dosis del fármaco apropiado y el individuo farmacológico y respuesta clínica de cada paciente antes de comenzar la terapia y para evitar efectos adversos.

TBXA2R es miembro de la superfamilia de proteínas G acoplada con regiones siete transmembrana, que son ampliamente expresada y localizada en las membranas celulares o en las estructuras intracelulares1,2. La vía de señalización TBXA2R participa en procesos aterosclerótica avanzada3. Aumento de la expresión del receptor TBXA2 fue demostrado durante la progresión de la aterogénesis y clínicas y estudios experimentales demostraron su papel relevante en la isquemia y el infarto de miocardio4. C924T, un polimorfismo de nucleótido único (SNP) del gen TBXA2R, fue reconocido como un polimorfismo funcional en voluntarios sanos y se ha relacionado con trastornos clínicos5. Además, nuestro anterior estudio6 demostraron que el polimorfismo C924T del gen TBXA2R participa en la estabilidad de la transcripción; en concreto, hay una mayor inestabilidad de la transcripción mutante de tipo (TT) en relación con el tipo salvaje (CC). Además, varios estímulos como adenosina difosfato (ADP), epinefrina y colágeno a diferentes concentraciones indujeron una agregación plaquetaria menos eficaz para el tipo de mutante (TT). Esto es consistente con una formación reducida del trombo y la hemostasia. Así, la inestabilidad de la transcripción TBXA2R y la reducción asociada de la agregación plaquetaria podrían asociarse con un papel protector para el genotipo TT TBXA2R contra aterotrombosis y sus complicaciones en pacientes tratados con aspirina riesgo6 .
Aquí, describimos una metodología de genotipado paciente investigar el papel postranscripcional del polimorfismo C924T (rs4523) situado en la región 3' del gen del receptor TBXA2. Este método se basa en los siguientes pasos: extracción de ADN (1) de la sangre entera, amplificación por PCR (2) de la porción del gen TBXA2R que contiene la mutación de C924T y (3) identificación del tipo salvaje y mutantes genotipos utilizando longitud de fragmento de restricción polimorfismo (RFLP) en gel de agarosa. RFLP es una técnica que aprovecha las variaciones de las secuencias de ADN homólogas7. Esta aplicación se utilizó para detectar polimorfismos del ADN, especialmente SNPs y para encontrar relevancia biológica en variaciones genéticas8. El polimorfismo analizado por primera vez mediante RFLP-PCR en humanos fue el ABO sangre9. El método RFLP-PCR permite el análisis de mutaciones genéticas en las secuencias de ADN homólogas mediante la evaluación de la presencia de fragmentos de diferentes longitudes después de la digestión del ADN con endonucleasas de restricción específica10.
En años anteriores, las siguientes metodologías se han utilizado para el análisis SNP con la técnica de PCR: hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo corto11, PCR alelo-específica12, cartilla extensión de microarrays de ADN13, ligadura del oligonucleótido ensayo14, secuencia para la identificación de polimorfismos de nucleótido posición específica15, Taqman método16, extracción mediante láser de desorción/ionización tiempo de vuelo (directa de la DNA MALDI-TOF) espectrometría de masas17y18de GeneChips. Estas técnicas no son fáciles de usar y pueden requerir el equipo costoso. Por el contrario, el método de PCR-RFLP es barato, fácil de usar, cómodo, tiene una alta eficiencia y permite la rápida identificación del polimorfismo C924T. Además, confirmamos los resultados mediante la secuenciación del gen TBXA2R utilizando el método de Sanger15.
Este enfoque permite un estudio predictivo de la formación de placa y la progresión de aterosclerosis mediante el análisis de pacientes genotipos para el polimorfismo TBXA2R C924T. Este método puede identificar a sujetos más susceptibles a los procesos aterotrombóticos, en particular aquellos pacientes de alto riesgo, tratados con aspirina.

<table><tbody><tr><td>QIAsymphony SP</td><td>QIAGEN</td><td></td> Espectrofotómetro 937055 <td></td></tr><tr><td></td><td>EPPENDORF</td><td>6131-02222</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador UVP</td><td></td><td>732-110</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>EPPENDORF</td><td>H0030121589</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de PCR</td><td>EPPENDORF</td><td>5331-03721</td><td></td></tr><tr><td>Pipettores y puntas de filtro</td><td>EPPENDORF</td><td>H4910000018/42/69 Y 0030067037/10/02</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis horizontal en minigel</td><td>DIATECH PHORESIS 10</td><td>RI002-10</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de bloque seco</td><td>INCUBADORA DOBLE</td><td>DG210</td><td></td></tr><tr><td>QIAsymphony DNA Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>931255</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón PCR (normalmente suministrado por el fabricante con la polimerasa Taq)</td><td>DIATECH Y TAKARA</td><td>T0100 Y R0001DM</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasa</td><td>Takara TAKARA</td><td>R0001DM</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>mezcla DIATECH&nbsp; farmacogenética</td><td>NM001</td><td>dNTP MIX 10x 100 microlitros, 10 mM</td></tr><tr><td>cebadores PCR</td><td>DIATECH&nbsp; farmacogenética</td><td>\\</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción RsaI</td><td>New England biolabs</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción 10x tampón</td><td>New England biolabs</td><td>R0167L</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9539</td> Los <td>fragmentos de ADN se separan mejor en tampón TBE</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>10% (peso / vol) persulfato de amonio</td><td>Sigma</td><td>E3678</td><td>preparado fresco cada vez</td></tr><tr><td>EtBr ( 0,5 &mu; g/&mu; L)</td><td>Sigma</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de tamaño de ADN</td><td>DIATECH&nbsp; farmacogenética</td><td>R1002-10</td><td>Pbluescript II SK (+) restringir MSPI</td></tr><tr><td>Agua estéril (esterilizada en autoclave)</td><td>DIATECH&nbsp; Farmacogenética</td><td>\\</td><td></td></tr></tbody></table>

un método para el estudio del polimorfismo c924t del gen receptor tromboxano a2

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

El gen del receptor (TBXA2R) de tromboxano A2 es un miembro de la superfamilia de la proteína G acoplada con regiones siete transmembrana. Está implicado en la progresión de la aterogénesis, isquemia e infarto de miocardio. Aquí presentamos una metodología de genotipado paciente para investigar el papel postranscripcional de los polimorfismos C924T (rs4523) situado en la región 3' del gen del receptor TBXA2. Este método se basa en la extracción de ADN de la sangre entera, la amplificación de la reacción en cadena (PCR) de la porción del gen TBXA2 que contiene la mutación de C924T e identificación de tipo salvaje y mutantes genotipos utilizando un análisis de la recopilación de restricción, polimerasa específicamente un fragmento longitud polimorfismo de restricción (RFLP) en agarose gel. Además, los resultados fueron confirmados por secuenciación del gen TBXA2R. Este método ofrece varias ventajas potenciales, tales como alta eficiencia y la rápida identificación del polimorfismo C924T por análisis de PCR y restricción enzimática. Este enfoque permite un estudio predictivo para la formación de placa y la progresión de aterosclerosis mediante el análisis de pacientes genotipos para el polimorfismo TBXA2R C924T. Aplicación de este método tiene el potencial para identificar a temas que son más susceptibles a los procesos aterotrombóticos, en determinados temas de un grupo de alto riesgo, tratados con aspirina.

El objetivo de este método es evaluar el genotipo del receptor de tromboxano A2 en relación con el polimorfismo C924T. El gene humano de TBXA2R encuentra en 19p13.3 abarca 15 kbp y consta de tres exones separados por dos intrones. Los polimorfismos de C924T del gene TBXA2R (de 539 bp) se amplificó utilizando los cebadores PCR se muestra en la figura 1, que fueron bien diseñados para amplificar una región específica de ADN pero no un orthologous o parálogo región inespecífica. Además, se realizó un análisis RFLP utilizando la enzima de restricción RsaI (figura 1) en los productos PCR y los resultados fueron visualizados en un gel de agarosa, para caracterizar el SNP específico estudiado.
Basado en la presencia de longitudes diferentes fragmentos después de la digestión del ADN, es posible discriminar el genotipo de un paciente para el polimorfismo C924T. De hecho, como se muestra en la figura 2, la calidad de homozigoto del alelo principales (CC) muestra dos bandas (395 y 144 PB), porque la enzima de restricción corta precisamente la porción del gen TBXA2R en el sitio de polimorfismo de C924T. La calidad de homozigoto del alelo menor (TT) se demuestra por una sola banda (539 bp), porque no se produce el corte de la enzima de la restricción. El alelo heterozigótico de (CT) muestra tres bandas (539, 395 y 144 bp). Como se muestra en la figura 2, el polimorfismo de C924T, definido por la digestión de la RsaI en producto de la polimerización en cadena, ha sido confirmado por análisis de la secuencia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x buffer PCR Tween-20 (15 M MgCl2)</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5 MgCl2 mmol/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>mezcla de dNTP (10 mM)</td>
			<td>1</td>
			<td>200 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cartilla (hacia adelante) (10 pmol/μm)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cartilla (inversa) (10 pmol/μm)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Taq polimerasa (5 U/μL)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>1 U/ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN de la muestra (42 ng/μL)</td>
			<td>1</td>
			<td>42 ng/μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de DNAsas</td>
			<td>20.55</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Configuración de amplificación PCR. Una mezcla de mezcla maestra reacción de 25 μl montada en un tubo PCR de 0.2 mL para amplificar una sola muestra de DNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Polimerización en cadena estándar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Paso inicial de activación</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
			<td>95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>ciclo de 3 pasos</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturalización</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
			<td>94 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>De recocido</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensión</td>
			<td>60 s</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de ciclos de</td>
			<td></td>
			<td>30 ciclos</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensión final</td>
			<td>8 min</td>
			<td></td>
			<td>72 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Programa de amplificación PCR. Configurar un termociclador automatizado para realizar PCR y ampliar la plantilla de ADN. Reacciones de PCR son detenidas por refrigeración a 4 ° C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Volumen (μL) (n = 1)</td>
			<td>Volumen (μL) (n = 10) *</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x buffer de la enzima</td>
			<td>2.5</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima de restricción (5 U/μL)</td>
			<td>0.5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de DNAsas</td>
			<td>19.5</td>
			<td>214.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total</td>
			<td>22.5</td>
			<td>247.5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Digestión de la enzima de la restricción de productos de la PCR. Se prepara una solución de mezcla maestra para que el las enzimas de restricción digiere los productos PCR. *: Para configurar una solución de mezcla maestra para 10 muestras, añadir 10% más, que finalmente componen 11 muestras.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2.jpg"> Figura 1: PCR primers y enzima de restricción RsaI. Los iniciadores de adelante y atrás diseñados para amplificar la porción del gen TBXA2R de 539 bp con el polimorfismo C924T. RsaI es la enzima de restricción seleccionada para reconocer los sitios GTAC. ˅: sitio de corte de la enzima RsaI. C(/T): C924T polimorfismo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2.jpg"> Figura 2: Análisis de la secuencia del patrón electroforético y el ADN. Patrón (A) el genotipo es reconocido por el RFLP de C924T después de la digestión con la enzima RsaI específica. Análisis de la secuencia de ADN (B): los resultados obtenidos por RFLP después de la digestión con la enzima de restricción RsaI fueron confirmados con análisis de la secuencia que muestra el polimorfismo C924T. Esta figura ha sido modificada desde De preve et al., las prostaglandinas y otros mediadores de lípidos6. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57289/57289fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En el presente estudio, se describe una metodología para analizar el genotipo C924T. El protocolo consta de tres etapas: extracción de ADN, amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) en gel de agarosa.

Un método para el estudio del polimorfismo C924T del gen Receptor tromboxano A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la trombosis y la hemostasia identificando sujetos más susceptibles a los procesos aterotrombóticos en particular los pacientes de alto riesgo tratados con aspirina. La principal ventaja de esta técnica es que es barata, fácil de usar, conveniente, tiene una alta eficiencia y permite una rápida identificación de los polimorfismos C924T. Aunque este método puede proporcionar información sobre el campo de la aterotrombosis, también se puede aplicar a otros sistemas como polimorfismos que implican medicina personalizada o medicamentos específicos con el fin de entender la respuesta farmacológica individual.Demostrando el procedimiento estará el Doctor Sebastiano Ursi, un técnico de nuestro laboratorio. Para preparar el tampón Tris EDTA a pH 8.0, agregue 200 microlitros de 0,5 molares EDTA y un mililitro de un cloruro molar Tris en un vaso de precipitados, luego ajuste el volumen a 100 mililitros con agua estéril y guárdelo a temperatura ambiente. A continuación, prepare un litro de solución de material 10X de tampón de electroforesis añadiendo todos los reactivos y, a continuación, almacene el búfer a temperatura ambiente.A continuación, prepare el tinte de carga de gel añadiendo todos los reactivos y luego lleve el volumen a 100 mililitros con agua estéril. Una vez preparado, guarde el tinte a cuatro grados centígrados durante unos meses. Agregue 450 mililitros de agua a 50 mililitros de tampón 10X TBE para preparar una solución de tampón 1X TBE.Añadir cuatro gramos de agarosa en 200 mililitros de tampón 1X TBE juntos en un vaso de precipitados de 600 mililitros para preparar 200 mililitros de 2% de gel de agarosa. El gel de agarosa solidificado almacenado a temperatura ambiente se puede disolver en un baño de agua hirviendo a 60 grados durante 15 a 20 minutos o en un horno microondas durante 35 minutos añadiendo un pequeño volumen de agua para compensar el aumento de la concentración de agarosa. Siga revolviendo el vaso de precipitados en un mezclador magnético durante aproximadamente cinco minutos hasta que la agarosa se suspenda y luego caliente la agarosa en una placa caliente durante unos 10 minutos o en un horno microondas durante tres minutos para que se disuelva por completo.Después de la purificación del ADN, mezcle suavemente las muestras de ADN frescas pipeteando tubos varias veces. Es obligatorio obtener de 10 a 50 nanogramos de una plantilla de ADN de buena calidad extraída de muestras humanas. Por esta razón, preferimos utilizar una purificación automática de ADN en lugar de una semiautomática o manual.Para comenzar la purificación, primero cuantificar y calcular la pureza del ADN midiendo los absorbentes en 260, 280 y 320 nanómetros, luego diluir las muestras utilizando agua estéril. A continuación, calibrar el espectrofotómetro. Para constituir la reacción PCR, añada todos los reactivos para preparar 25 microlitros de mezcla maestra de PCR en un tubo de microamplificación de 0,2 mililitros.A continuación, coloque los tubos de PCR en un termociclador automatizado y amplificar las muestras de ADN purificado. Una vez que el programa termina, detener la reacción dejando los tubos a cuatro grados Centígrados. Añadir 10X tampón enzimático cinco unidades por enzima de restricción de microlitro en el agua libre del ADN a un volumen de 22,5 microlitros.A continuación, agregue 2,5 microlitros de producto PCR a un nuevo tubo de PCR y luego agregue los 22,5 microlitros de la mezcla de digestión de restricción al producto PCR. Incubar la mezcla maestra de digestión de restricción de producto PCR a 37 grados Celsius durante cuatro horas, luego añadir 0,5 microgramos por mililitro de bromuro de etidio para manchar el gel durante 10 minutos. Vierta el gel en la bandeja de gel con el peine de pozo en su lugar para que el gel se solidifique.Ahora vierta la caja de gel con 1X TBE tampón hasta que el gel esté cubierto. Utilice puntas finas para cargar seis microlitros del ADN digerido amplificado en los pozos formados en el gel, luego agregue un marcador de ADN también en un espacio separado paralelo a la muestra. A continuación, encienda la unidad de electroforesis.Con el fin de identificar el polimorfismo genético C924T en el gen TBXA2R, se realiza un análisis RFLP. En el gel, muestra dos bandas a 395 y 144 pares de bases para la versión de tipo salvaje del alelo mayor, mientras que una sola banda en 539 pares base para la versión mutante del alelo menor se ve indicando que no se corta por la enzima de restricción. Curiosamente, tres bandas en 395, 144 y 539 pares base están presentes para el alelo heterocigoto.A continuación, el polimorfismo C924T se confirma mediante el análisis de secuencia. La secuencia resaltada representa el polimorfismo. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en unas ocho horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este método solo se puede usar para un pequeño número de recortes y para algunas muestras en una sesión de trabajo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de recortes con el fin de responder a preguntas adicionales como la importancia de otras vías que implican procesos aterotrombóticos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología molecular exploraran las variaciones genéticas sobresalientes en este desarrollo y progresión inicial.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo evaluar el genotipo del receptor Thromboxane A2 con respecto al polimorfismo C924T utilizando el análisis de electroforesis de gel de las muestras PCR-RFLP. No olvide que trabajar con bromuro de etidio y fuentes de luz UV puede ser extremadamente peligroso y las precauciones tales como guantes, gafas de seguridad, o una máscara facial y otros dispositivos de protección siempre deben tomarse durante el realización de este procedimiento.

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Investigación

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