Name: Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a rastrear células endocárdicas durante el desarrollo del corazón en embriones de pez cebra mediante fotoconversión de proteína Kaede. Esta técnica supera los desafíos de la microscopía tradicional.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli y Basile Gurchenkov para ayudar a diseñar y hacer el molde que se describe en este protocolo. Este trabajo fue financiado por la ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), el programa EMBO joven investigador, FRM (DEQ20140329553), la Comunidad Europea, ERC CoG N ° 682938 Evalve y por el subsidio ANR-10-LABX-0030-INRT, a cargo de un fondo del Estado francés la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir etiquetado ANR-10-IDEX-0002-02.

1. preparación de moldes y montaje agarosa
<ol><li>Crear un molde con las dimensiones indicadas en la figura 1 utilizando una impresora 3D o herramientas de taller mecánico tradicional.</li>
	<li>Pipetee aproximadamente 1,5 mL de agarosa 1% fundido en un plato de montaje plástico 35 mm. Colocar el molde de plástico en la agarosa líquida, teniendo cuidado de evitar atrapar aire entre el molde y la agarosa. Coloque el plato a 4 ° C, espere hasta que la agarosa endurece (esto toma alrededor de 5 minutos), luego retire el molde de plástico.</li>
	<li>Para guardar el plato de montaje para su uso posterior, cubrir el plato con su tapa y, a continuación, envuelva el plato y la tapa con parafilm. Luego puede almacenarse el plato de montaje lateral de la tapa hacia abajo hasta 5 días a 4 ° C.</li>
	<li>Prepara con antelación alícuotas de 1 mL de agarosa de bajo punto de fusión de 0,7% en 1,5 mL tubos Eppendorf para usar en el día de montaje. Nota: Los pozos de agarosa del plato de montaje se deformen con el tiempo como el agua se evapora si parafilm no envuelve los platos bien.</li>
</ol>2. obtención de embriones para la Photoconversion
<ol><li>Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) línea y crecen aproximadamente 200 embriones en medio del embrión en la oscuridad a 28,5 ° C. Para obtener más información sobre cómo cruzar líneas de pez cebra, consulte la base de datos educación ciencia de JoVE11.</li>
	<li>Después de 5 h, pero antes de 24 h, tratamiento de embriones con la 1-fenil-2-tiourea (PTU) para evitar la formación de pigmento (0.003% PTU en medio del embrión).</li>
	<li>Sobre 1 h antes del comienzo de photoconversion, pantalla embriones bajo un estereoscopio fluorescente y seleccionarlos embriones sanos 5 parecen expresar la fluorescencia verde brillante. Se recomienda el uso de luz de baja intensidad al visualizar los embriones para evitar la exposición de los embriones a la luz ambiente para evitar photoconverting Kaede en células no específicas.</li>
</ol>3. incrustar
<ol><li>Preparar 10 mL de medio de montaje: Metanosulfonato de 0,02% y el 50 mM BDM en medio embrión.</li>
	<li>Añadir 2 mL de medio de montaje en el plato de montaje y permite 15-30 min de la solución que se difunden en la agarosa.</li>
	<li>Mientras tanto, derrita una alícuota de 1 mL de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) de 0,7% colocando el tubo en un bloque de calor de 70 ° C durante aproximadamente 5 minutos.<ol>
<li>Espere la agarosa de la LMP se enfríe un poco, luego añada 25 μl de solución de metanosulfonato de 8 mg/mL y 40 μl de solución de 1 M de la BDM al tubo de agarosa de bajo punto de fusión. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo, luego transferir el tubo a un bloque de 38 ° C de calor para mantener la agarosa de la LMP en su estado líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En una Petri dish con medio embrión, dechorionate cuidadosamente los embriones previamente seleccionados bajo el estereomicroscopio con unas pinzas, procurando no para dañar los embriones.</li>
	<li>Transfiera los embriones a un plato separado que contiene 2 mL de medio de montaje.<ol>
<li>Cuando se detuvo el corazón de los embriones (tarda unos 5-10 min), colas de transferencia los embriones para el montaje del plato y colocar los embriones en los pozos con unas pinzas que se encuentran en un ángulo de 25 grados, apuntando hacia la parte más profunda del pozo, yema mirando hacia arriba.</li>
		<li>Cuando embriones son más o menos en su lugar, eliminar los medios de comunicación, integrar los embriones en ~ 200 μL de agarosa LMP de 0,7% que contiene Metanosulfonato y BDM y reajustar la posición de los embriones, inclinando los embriones a la izquierda o derecha según sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Espere a que los conjuntos de agarosa LMP (tarda unos 5 minutos), luego agregar medio de montaje en el plato. Los embriones están ahora listos para ser photoconverted. Nota: El Metanosulfonato y el BDM se utilizan para anestesiar los embriones y para detener el corazón de los embriones, respectivamente. Medios de montaje se pueden preparar el día antes de la proyección de imagen, pero no se olvide de proteger los medios de comunicación de la luz. Nota: La correcta colocación de los embriones es importante para permitir un camino claro láser a las células que se desea photoconvert. Coloque la cabeza del embrión cerca de la salida del pozo para que la luz láser no tiene que viajar lejos para llegar hasta el embrión, y para que los embriones pueden ser fácilmente desmontados después de photoconversion.</li>
</ol>4. Photoconversion
<ol><li>En un microscopio confocal vertical (como Leica SP8) equipado con un 405 nanómetro, 488 nanómetro y 561 nm láser fuente, localizar el embrión del corazón usando transmite luz blanca (brightfield) y un objetivo (como Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objetivo). Compruebe la fluorescencia roja de Kaede usando el 561 nm láser (es decir, láser DPSS 561, en ~ 5% de intensidad, detector colocado a 589 728 nm). A continuación, visualizar el endocardio usando el 488 nm láser (es decir, láser de argón multilínea de 30 mW en ~ 5% de intensidad, detector colocado a 502 556 nm).</li>
	<li>Entrar en modo "FRAP" en el software de adquisición de microscopio. Seleccione la potencia de láser de ~ 1% para ambos 488 nm y 561 nm láseres.</li>
	<li>Centrarse en el plano de interés, seleccione una región de interés (ROI), y células photoconvert con diodo 405 nm láser en energía del laser de 25%, tres veces la exploración sobre el ROI. Kaede insuficiente debe photoconverted en el ROI, escanee el 405 nm láser sobre el área tres veces nuevamente. Repita este paso para todos ROIs.</li>
	<li>Volver al modo "TCS SP8" en el software y adquirir una pila de z, usando la 561 nm y 488 nm láser secuencialmente. Asegúrese de seleccionar la opción 'bidireccional' para aumentar la velocidad de proyección de imagen. Nota: Cuánto tiempo tarda en photoconvert y la imagen de cada embrión varía. Latido del corazón se sabe para ser importante para el desarrollo de la válvula de corazón normal, así que evite mantener el corazón parado durante más de 30 minutos, incluso si esto significa que no tienes tiempo para photoconvert todos los 5 embriones. Nota: Durante el proceso de photoconversion, uso de detectores de PMT, mientras que después de photoconversion, se recomienda usar detectores de híbrido a modo de conteo. Esto es porque los detectores híbridos son más sensibles y son capaces de producir imágenes de mejor calidad, pero se dañan fácilmente por la sobre exposición.</li>
</ol>5. Desmontaje de embriones photoconverted
<ol><li>Después de photoconversion, utilice una pipeta de vidrio para presionar un poco justo por encima de la cabeza del embrión para romper la agarosa de la LMP, luego aspirar suavemente el embrión.<ol>
<li>Expulsar el embrión de la pipeta de vidrio en un plato de Petri de 35 mm que contiene medio de embrión con PTU (a lavar que contiene medio de BDM).</li>
		<li>Transferir el embrión a un pozo en una placa de 6 pozos que contienen medio embrión con PTU. Durante este paso, asegúrese de que tome nota de que embrión entra que bien, ya que es esencial para correlacionar la posición de las células photoconverted en etapas tardías del desarrollo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ahora que los embriones se quitan del medio con BDM, deben comenzar sus corazones batiendo otra vez en unos 5 minutos embriones retorno a la oscuridad a 28,5 ° C para permitir que los embriones continuar desarrollando normalmente.</li>
</ol>6. proyección de imagen de células de photoconverted en etapas embrionarias tardías
<ol><li>En la etapa deseada, detener el corazón y volver a embeber los embriones como en el paso 3 de este protocolo, con la importante diferencia de que los embriones deben ser tratados con BDM en platos separados, marcados para seguimiento de embriones.</li>
	<li>De embriones hasta 62 hpf, adquirir z-pila del endocardio con 561 nm y 488 nm para el rojo y verde fluorescente señales, respectivamente. Embriones en etapas mayores de 62 hpf, use un multifotón laser set a 940 nm imagen Kaede verde en vez del láser de 488 nm.</li>
</ol>7. Análisis de la imagen embriones bajo 48 hpf
Nota: Movimientos de tejido del AVC pueden ser difíciles de analizar debido a su estructura tridimensional compleja. Para cuantificar la longitud de una región de photoconverted en el AVC entre dos regiones no photoconverted o la longitud de una región no photoconverted en el AVC entre dos regiones de photoconverted, puede ser deseable para cartografiar la estructura tridimensional en un mapa de dos dimensiones. Imágenes de photoconverted embriones obtienen antes de 48 hpf puede analizarse mediante el método siguiente.
<ol><li>Importar las imágenes adquiridas en Matlab o cualquier software similar.</li>
	<li>Delimitar manualmente el retorno de la inversión, es decir, el endocardio y aplicar una mascarilla para quitar la señal de fuera de esta región.</li>
	<li>Aplicar un umbral de intensidad en la imagen para identificar los puntos en el endocardio y el terreno en tres dimensiones. Aislar los puntos correspondientes a la parte más estrecha y más recta de la AVC, borrando manualmente los puntos de ningún interés en la aurícula y el ventrículo mediante el comando borrar en el software.</li>
	<li>Use un cilindro para adaptarse a los puntos que representan el AVC así obtenido.</li>
	<li>Definir un sistema de referencia para comparar varias muestras. Por ejemplo, adoptar el centro de la masa de los puntos de AVC como el origen del sistema de referencia y el eje del cilindro equipado como el eje z.<ol>
<li>Asegúrese de que z-posiciones positivas corresponden siempre al mismo lado del corazón (ventricular o atrial).</li>
		<li>Proyectar los puntos de AVC en el plano x-y y una elipse para que encajen.</li>
		<li>Rotar los puntos endocárdicos alrededor del eje z para que el eje mayor de la elipse y el eje y del sistema de referencia son paralelos y los y-valores positivos corresponden a la parte interna de la AVC con respecto a los embriones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para segmentar el AVC, corte el dataset tridimensional con algunos aviones obtenidas haciendo girar el plano de media {y = 0, x > 0} en la dirección z.<ol>
<li>La intensidad de los píxeles vecinos en estos planos del proyecto y definir el endotelio de manera consistente. Por ejemplo, dibujar manualmente una línea desde el auricular en el lado ventricular del AVC en el espesor medio del endotelio.</li>
		<li>Interpolar los puntos de las líneas que representan el endotelio con una spline tridimensional usando el toolbox de spline para representar el AVC con una superficie. Nota: El número de los planos de corte determina tanto la precisión de la segmentación y el consumo de tiempo de este paso. Generalmente, 8 planos son suficientes para lograr buenos resultados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definir la posición azimutal de cada punto sobre la superficie de AVC usando coordenadas cilíndricas.<ol>
<li>En cada posición azimutal definir una curva paramétrica a lo largo de la superficie de la AVC mediante el cálculo de la longitud de arco en la superficie entre puntos consecutivos.</li>
		<li>Para cada curva paramétrica, definir el punto en la curva más cercana al centro del AVC a cero. Los puntos del AVC así son descritos totalmente por su posición azimutal y su posición en la curva paramétrica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>El AVC se despliegan en una imagen bidimensional usando la posición paramétrica de los puntos.</li>
	<li>Encontrar los bordes de la región para cuantificar como los bordes de la umbralización binaria de la imagen de la relación entre las intensidades de lo photoconverted y los canales no photoconverted. Manualmente el resultado correcto si es necesario.</li>
	<li>Calcular la longitud del arco entre los bordes para calcular la longitud de los tejidos en función de la posición azimutal.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo%3A+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li>
<li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li>
<li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+development+of+the+atrioventricular+canal+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+mechanics+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood flow mechanics in cardiovascular development.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).</li>
<li>Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+driven+cardiac+valve+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+modeling+for+shear+stress+quantification+in+the+embryonic+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Steed, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((klf2a+couples+mechanotransduction+and+zebrafish+valve+morphogenesis+through+fibronectin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis.</a> Nat Commun. 7, 11646(2016).</li>
<li>Herwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+mechanisms+of+blood+vessel+fusion+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo.</a> Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+shear+stress+patterns+predict+the+orientation+of+convergent+tissue+movements+in+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart.</a> Development. , (2017).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="NULL">Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005(2015).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li>
<li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li>
<li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li>
<li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhOTO+zebrafish%3A+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888(2012).</li>
<li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li>
</ol>

Ningún conflicto de interés declarado.

Tiempo de photoconversion: Kaede aunque sigue siendo brillantemente expresada en EdCs en 96 hpf, cabe señalar que a medida que el embrión crece, la luz laser difunde más antes de que llegue el AVC, dificultando el photoconversion confinado de Kaede. En embrionario etapas después de 55 años hpf, la dilatación del ventrículo y la aurícula también significa que el haz de láser violeta utilizado para photoconversion no puede llegar a las células de AVC sin pasar a través de la aurícula o ventrículo. Esto significa q...

El pez cebra es actualmente uno de los más importantes modelos vertebrados para estudiar los procesos celulares y de desarrollo en vivo. Esto es en gran parte debido a la transparencia óptica de pez cebra y receptividad a la genética, que es un potente modelo para la aplicación de técnicas ópticas genéticamente codificado photoresponsive proteína tecnologías1. Específicas para el estudio del desarrollo del corazón, pez cebra recibe suficiente oxígeno por difusión que incluso mutantes sin latidos del corazón pueden sobrevivir a través de la primera semana de desarrollo, que permitan el análisis de los efectos de los genes del desarrollo y perturbado flujo de sangre en la morfogénesis del corazón no es posible en la mayoría vertebrados2.
El tubo de corazón de pez cebra está formado por 24 horas post fecundación (hpf). Poco después de su formación, el tubo del corazón comienza batiendo activamente. Por 36 hpf, una clara constricción separa la aurícula del ventrículo. Esta región de constricción se llama el canal auriculoventricular (CAV) y las células en esta región el cambio de una morfología escamosa a una morfología cuboidal3. Pez cebra válvula auriculoventricular morfogénesis se inicia alrededor de 48 h post fertilización. 5 días post fertilización, dos valvas se extienden al AVC y prevenir el flujo retrógrado de sangre desde el ventrículo a la aurícula durante el ciclo cardíaco4. Seguimiento de las células durante la formación de AVC y la válvula es un reto como el latido rápido del corazón hace que sea difícil seguir las células vía microscopia Time-lapse tradicional5,6. Este protocolo, adaptado de Steed et al., 20167, describe un método que utiliza la Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 pez cebra transgénica línea, en la que la proteína de photoconvertible Kaede se expresa en células endoteliales, incluyendo el endocardio. La droga 2, 3-butanedione-2-monoxima (BDM) se utiliza para detener temporalmente el corazón latiendo, lo que permite photoconversion exacta de EdCs entre 36 y 55 hpf y proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en momentos específicos de desarrollo. Se ha demostrado previamente que EdCs photoconverted utilizando este método puede seguir siendo distinguible de sus vecinos inconversos durante cinco días o más después del tiempo de photoconversion7. Este protocolo también detalla un método utilizado para el análisis de la imagen de photoconverted EdCs en embriones menores de 48 hpf, que se ha utilizado con éxito para seguir movimientos de tejido durante el desarrollo de AVC (Boselli et al., en prensa)9. Esperamos que los lectores encontrarán este protocolo útil para el estudio de AVC y válvula de desarrollo de embriones normales y mutantes, morphants o embriones tratados con drogas. Para un protocolo más general sobre rastreo de celulares usando photoconvertible proteínas durante el desarrollo del pez cebra, vea por favor el artículo por Lombardo et al., 201210.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td>Equipo necesario para la cría de peces y la recolección de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>huevos (consulte el Libro del pez cebra22 para obtener más detalles).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal vertical (equipado con láseres que funcionan a 488 nm, 561 nm y 405 nm, un láser multifotónico sintonizable y un Leica HCX IRAPO L, 25 &times;, N.A. 0,95 objetivo)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo de tejidos de 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>placa</td><td></td><td></td><td></td>de Petri</tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>de vidrio</tr><tr><td>Molde</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL Solución madre de tricaína&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM solución</td><td></td><td></td><td></td>madre</tr><tr><td>UltraPure agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-fenil-2-tiourea)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Medio embrionario: 30x solución</td><td></td><td></td><td></td> madre</tr> <tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab equipado con las cajas de herramientas de análisis de imágenes, ajuste de curvas, bioformatos</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL solución madre de tricaína</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mg de tricaína en polvo (ácido etil 3-aminobenzoato metanosulfónico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ajuste a pH 7, alícuota y almacene a -20 ° C&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><solución madre de BDM fuerte>1 M</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alícuota y almacenar a -20 &0 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Embrión medio: 30x solución madre</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50,7 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0,78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1,47 g Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2,1 g Nitrito de calcio tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19,52 g HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Ajustar a pH 7,2 y almacenar a temperatura</td><td></td><td></td><td></td> ambiente</tr><tr><td><fuerte>moho</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>resina</td> <td>PlasCLEARAsiga</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus 39&nbsp; Impresora 3D Freeform Pico</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

siguientes movimientos de tejido endocárdico vía photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Durante la embriogénesis, las células se someten a cambios dinámicos en el comportamiento de la célula, y descifrar la lógica celular detrás de estos cambios es una meta fundamental en el campo de la biología del desarrollo. El descubrimiento y desarrollo de proteínas de photoconvertible han ayudado grandemente nuestra comprensión de estos cambios dinámicos al proporcionar un método para resaltar ópticamente las células y tejidos. Sin embargo, mientras que photoconversion, Time-lapse microscopía y análisis posteriores han demostrado para ser muy exitosa en descubrir dinámica celular en órganos como el cerebro o el ojo, este enfoque generalmente no se utiliza en pleno desarrollo debido a desafíos planteados por el rápido movimiento del corazón durante el ciclo cardíaco. Este protocolo consta de dos partes. La primera parte describe un método para photoconverting y posteriormente seguimiento de células del Canal auriculoventricular (EdCs) en pez cebra canal auriculoventricular (CAV) y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón. El método consiste en detener temporalmente el corazón con una droga en orden para photoconversion exacto lugar. Corazones están autorizados a reanudar la paliza sobre retiro de la droga y el desarrollo embrionario continúa normalmente hasta que el corazón está parado otra vez para la proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en un punto del tiempo de desarrollo más adelante. La segunda parte del protocolo describe un método de análisis de imagen para cuantificar la longitud de una región photoconverted o no photoconverted en el AVC en embriones jóvenes mediante la asignación de la señal fluorescente de la estructura tridimensional en un mapa bidimensional . Juntas, las dos partes del protocolo permite examinar el origen y el comportamiento de las células que conforman el pez cebra AVC y válvula auriculoventricular del corazón y potencialmente puede aplicarse para el estudio de mutantes, morphants o embriones que han sido tratados con reactivos que interrumpen el desarrollo AVC o válvula.

Un ejemplo de un embrión photoconverted en 48 hpf y reflejada otra vez 80 hpf se muestra en la figura 2, cine 1 y 2. Exponer Kaede a la luz nm 405 irreversiblemente conversos de la proteína de su forma verde fluorescente para formar rojo fluorescente, que permite el comportamiento de las células con el verde o su forma roja a seguir con respetan a su color diferenciado vecinos durante la formación de la válvula. Se puede ver ...

Este protocolo describe un método para la photoconversion de Kaede proteína fluorescente en células endocárdicos de la vida del embrión de pez cebra que permite el seguimiento de células del Canal auriculoventricular durante canal atrio-ventricular y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón .

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

El objetivo general de este procedimiento es seguir a las células endocárdicas durante la formación del canal auriculoventricular y la válvula cardíaca. Este método puede ayudar a abordar cuestiones clave en el campo del desarrollo cardíaco, como comprender cómo se comportan las células endocárdicas en diferentes tipos de mutantes. El seguimiento de las células durante la formación de AVC y válvulas es un desafío debido a los latidos rápidos del corazón.Esto dificulta el seguimiento de las células a través de la microscopía tradicional de lapso de tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que evita algunas de estas dificultades. La demostradora del procedimiento correrá a cargo de Renée, una investigadora postdoctoral en mi laboratorio.Después de crear un molde de acuerdo con el protocolo de texto, pipetee aproximadamente 1,5 mililitros de agarosa al 1% derretida en un plato de montaje de plástico de 35 milímetros. Luego, coloque el molde de plástico en la agarosa líquida, teniendo cuidado de evitar que el aire quede atrapado entre el molde y la agarosa. Coloca el plato a cuatro grados centígrados hasta que la agarosa se endurezca.Luego, retire el molde de plástico de la agarosa. A continuación, agregue dos mililitros de medio de montaje previamente preparado al plato de montaje y espere de 15 a 30 minutos para que la solución se difunda en la agarosa. Mientras tanto, derrita una alícuota de un mililitro de agarosa de 0,7% de punto de fusión bajo, o LMP, colocando el tubo en un bloque de calor a 70 grados Celsius durante unos cinco minutos.Pipetear la agarosa LMP hacia arriba y hacia abajo para enfriarla un poco. Luego, agregue 25 microlitros de ocho miligramos por mililitro de tricaína y 40 microlitros de soluciones de BDM de un molar al tubo. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Luego, transfiera el tubo a un bloque de calor de 38 grados Celsius para mantener la agarosa LMP en su estado líquido. Transfiera los embriones a un plato separado que contenga dos mililitros de medio de montaje. Luego, cuando los corazones hayan dejado de latir, transfiera los embriones a la placa de montaje y use fórceps para colocarlos en los pocillos de modo que queden en un ángulo de 25 grados, con las colas apuntando hacia la parte más profunda del pocillo, con la yema hacia arriba.Cuando los embriones estén más o menos en su lugar, retire el medio e insértelos en aproximadamente 200 microlitros de agarosa al 0,7% LMP que contenga tricaína y BDM. Luego, reajuste las posiciones de los embriones, inclinándolos hacia la izquierda o hacia la derecha según sea necesario. Presione hacia abajo las paredes del cuadrado dentado para permitir que el exceso de agarosa se desborde hacia las áreas laterales del plato de montaje.Espere aproximadamente cinco minutos para que la agarosa LMP se asiente, luego agregue el medio de montaje al plato. Los embriones ya están listos para ser fotoconvertidos. Para llevar a cabo la fotoconversión, en un microscopio confocal vertical equipado con fuentes láser de 405, 488 y 561 nanómetros, se utiliza luz blanca transmitida y una lente objetivo para localizar el corazón del embrión.Con el láser de 561 nanómetros, compruebe la fluorescencia roja de Kaede. A continuación, utiliza el láser de 488 nanómetros para visualizar el endocardio. A continuación, en el software de adquisición del microscopio, ingrese al modo FRAP.A continuación, seleccione aproximadamente el 1 % de la potencia del láser para los láseres de 488 y 561 nanómetros. Mientras se centra en el plano de interés, seleccione una región de interés o ROI. A continuación, utilizando el láser de diodo de 405 nanómetros a una potencia láser del 25%, fotoconvierta las células, escaneando el ROI tres veces.En caso de que no se fotoconvierta suficiente Kaede en el retorno de la inversión, escanee el láser de 405 nanómetros sobre el área tres veces más. Regrese al modo TCS SP8 en el software y, utilizando los láseres de 561 y 488 nanómetros secuencialmente, en modo bidireccional, adquiera una pila Z. Después de la fotoconversión, use una pipeta de vidrio para presionar ligeramente hacia abajo justo por encima de la cabeza del embrión para romper la agarosa LMP.Luego, succiona suavemente el embrión. Para lavar el medio que contiene BDM, expulse el embrión de la pipeta de vidrio a una placa de Petri de 85 milímetros que contenga medio embrionario con PTU. Transfiera el embrión a un pocillo en una placa de seis pocillos que contiene medio embrionario con PTU.Durante este paso, asegúrese de tomar nota de qué embrión entra en qué pozo, ya que esto es esencial para correlacionar la posición de las células fotoconvertidas en etapas posteriores del desarrollo. Ahora que los embriones han sido extraídos del medio que contiene BDM, sus corazones deberían empezar a latir de nuevo en unos cinco minutos. Regrese los embriones a la oscuridad a 28,5 grados centígrados para permitir que continúen desarrollándose normalmente.En la etapa deseada, detenga el corazón y vuelva a incrustar los embriones, como se demostró anteriormente en este video, con la diferencia importante de que los embriones deben tratarse con BDM en platos separados y marcados para realizar un seguimiento de ellos. Para embriones de hasta 62 hpf, adquiera pilas Z del endocardio utilizando 561 y 488 nanómetros para señales fluorescentes rojas y verdes, respectivamente. Para embriones de más de 62 hpf, use un láser multifotónico configurado a 940 nanómetros para obtener imágenes de Kaede verde en lugar del láser de 488 nanómetros.En el caso de embriones menores de 48 hpf, es posible proyectar el AVC tridimensional en una imagen bidimensional para su análisis. En primer lugar, umbral de la imagen. Luego, borra los puntos que se encuentran fuera del corazón.Para realizar la segmentación manual, oriente la imagen de la izquierda para que coincida con la imagen de la derecha. Segmenta el lado del corazón por el que pasa el vector naranja y añade puntos en la dirección del vector azul. A continuación, interpola las secciones transversales y proyecta la intensidad del color sobre la superficie.Por último, ajuste la orientación del AVC y proyéctelo sobre una superficie 2D. Aquí se muestra un ejemplo de un corazón embrionario justo después de la fotoconversión a 48 hpf. El Kaede citoplasmático en varias células del lado superior del AVC se ha convertido de verde a rojo.En el mismo embrión a 80 hpf, es evidente que las células fotoconvertidas han proliferado y han migrado a la cara interna de la válvula auriculoventricular superior. Aquí se muestra un ejemplo de un embrión de 36 hpf en el que las EdC de la aurícula y el ventrículo han sido fotoconvertidas. A continuación, el AVC se proyecta en dos dimensiones para facilitar la visualización y el análisis, y permite cuantificar la distancia entre las dos regiones fotoconvertidas.Al intentar este procedimiento, es importante mantener el tiempo en que el corazón se detiene al mínimo para evitar afectar el desarrollo normal. Con la práctica, la fotoconversión se puede completar en unos 30 minutos, siempre que todo esté preparado con anticipación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo rastrear las células endocárdicas después de la fotoconversión en un embrión vivo de pez cebra y analizar sus conjuntos de datos.

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.

Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra

Aquí presentamos un método para el cambio fotoactivado de proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFPs) en embriones vivos de pez cebra y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida en puntos temporales específicos durante el desarrollo. Esta metodología permite el monitoreo de eventos de biología celular subyacentes a diferentes procesos de desarrollo en un organismo vertebrado vivo.

Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para mostrar cómo photoconversion celular se logra a través de la exposición Ultravioleta a áreas específicas que expresan la proteína fluorescente, Eos, en animales vivos.

Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo

Describimos herramientas optimizadas para estudiar el corazón de pez cebra in vivo con microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Específicamente, sugerimos líneas transgénicas cardíacas brillantes y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cardíacos. También se proporciona una posible línea de adquisición y análisis de datos adaptada a las imágenes cardíacas.

Microscopía de hoja de luz de dinámica cardíaca rápida en embriones de pez cebra

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Este protocolo describe un método de microscopía óptica de bajo costo para evaluar la morfología y función cardíaca en embriones de pez cebra, lo que permite una evaluación reproducible de la cardiotoxicidad del desarrollo sin la necesidad de sistemas de imágenes avanzados.

Imágenes cardíacas funcionales en embriones de pez cebra mediante microscopía estándar y análisis de video: aplicaciones en investigación ambiental y biomédica

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Aprende a rastrear células endocárdicas durante el desarrollo del corazón en embriones de pez cebra mediante fotoconversión de proteína Kaede. Esta técnica supera los desafíos de la microscopía tradicional.

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

Explorar más videos