Name: Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprende a generar plantas transgénicas con inserciones de solo-copia intactas usando el vector binario BIBAC-Gateway. Este método optimiza la transformación de Arabidopsis y garantiza expresión génica estable.

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Esta investigación es apoyada por el holandés tecnología Fundación STW (12385), que forma parte de la organización de países bajos para la investigación científica (NWO), y que en parte es financiado por el Ministerio de economía (OTP Grant 12385 a MS).  Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidad de Cornell, Estados Unidos) para proporcionar la pCH20, la columna vertebral de los vectores de la BIBAC GW.

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<li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li>
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<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.

Crítica a la generación de transgénicos con integraciones individuales, intactos de un transgen es la elección del vector binario utilizado. Vectores familia BIBAC se han utilizado para proporcionar secuencias de intereses a muchos planta especie23,24,25,26,27,28. Vectores de la BIBAC, incluyendo BIBAC-GW, rendimiento solo co...

Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que el integrado transgene(s) estable expresado. Esto puede lograrse por integraciones copia intacta de un transgen. Integraciones múltiples pueden conducir a aumento de la expresión de un transgen, sino también al silenciamiento génico. Silenciamiento de transgenes es más probable si las secuencias insertadas están dispuestas en tándem o repeticiones invertidas1,2,3,4. Vectores binarios se utilizan como lanzaderas en Agrobacterium-mediada por experimentos de transformación a entregar las secuencias de interés en genomas de plantas. El número de integraciones en el genoma de una planta es dependiente en el número de copias del vector binario en Agrobacterium tumefaciens5,6. Muchos vectores binarios utilizados son vectores de alta copia y por lo tanto producir un número de copia del transgen promedio alto: 3.3 a 4.9 copias en Arabidopsis5.
El número de integraciones de T-DNA puede reducirse mediante el uso de vectores binarios que tienen un número de copia baja en a. tumefaciens, como BIBAC7o lanzando un T-DNA de a. tumefaciens cromosoma5. El número medio de integración del transgén en tales casos es inferior a 25,8,9,10. Debido a que solo copia en a. tumefaciens y también en Escherichia coli, derivados de la BIBAC pueden mantener y ofrecer construcciones tan grandes como 150 kb11.
GW-compatible BIBAC vectores10,12 permiten fácil introducción de los genes de interés en el vector mediante clonación de Gateway. El uso de la tecnología Gateway simplifica enormemente el procedimiento de clonación, pero también supera problemas comunes asociados con gran número de copias bajo vectores13,14, tales como un bajo rendimiento de ADN y una selección limitada de restricción única sitios disponibles para la clonación7,11. Los derivados pBIBAC-GW están disponibles con cualquier resistencia al glufosinato-amonio (pBIBAC-BAR-GW) o fluorescencia DsRed en las capas de semilla (pBIBAC-RFP-GW) para la selección de las plantas (figura 1)10,12. Para ambos vectores, se utiliza un gen de resistencia a kanamicina como el marcador de selección en las bacterias.
Se combinan los vectores pBIBAC-GW: diseño (1) fácil y manipulación genética en e. coliy (2) intacto solo copia integraciones en planta con alta eficiencia. La producción de vectores pBIBAC-GW en integraciones promedio 1.7 en Arabidopsis con aproximadamente la mitad de las plantas transgénicas con un solo había integrado T-ADN10.
La expresión estable de transgenes es un requisito para la mayoría transgénicos generados. Expresión del transgén estable puede lograrse mediante integraciones intactos, solo copia. Sin embargo, trabajar con plantas transgénicas portadoras de integraciones intactos, solo copia es aún más importante si por ejemplo, el objetivo es estudiar la eficiencia de los procesos basados en la cromatina, como la mutagénesis, recombinación, o reparación y la dependencia de estos procesos en la localización genómica y la estructura de la cromatina en el sitio de inserción. Para nuestro interés, para estudiar la dependencia de mutagénesis de oligonucleótidos dirigidos (ODM) en el contexto genómico local, un conjunto de líneas de reportero con integraciones intactos, solo copia de un gen reportero de mutagénesis fue generado (figura 2)10. Mediante este conjunto de líneas, fue demostrado que la eficacia ODM varía entre loci transgénicos integrados en diversas localizaciones genómicas, a pesar de los niveles de expresión de transgenes siendo algo similar.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de kanamicina monohidrato</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 células competentes</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>En su lugar, se puede utilizar One Shot ccdB Survival 2 T1R Competence Cells (A10460) de Invitrogen o cualquier otra cepa resistente a ccdB E. coli en su lugar&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Células competentes DH10B</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR mezcla de enzimas clonasa&nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>citrato trisódico dihidratado</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disódico dihidratado</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptona</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa monohidrato</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación, espacio de 0,1 cm</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>Electroporador Gene Pulsador</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Maltosa monohidrato 90%</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific NC0138454</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige Medio Skoog</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Glufosinato de amonio (Basta)</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de restricción NEB</td> Bromuro de etidio <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1610433</td><td></td>Sistema<td>de</td><td></td></tr><tr><td>electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de</td> <td>sodioÁcido</td><td></td> clorhídrico 106498 <td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nailon secante Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>o GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr papel secante</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Acetilado BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Grueso</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>o Sephadex G-50 Medio (17004301)</td></tr><tr><td>Sal de sulfato de dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>Salmón Esperma ADN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Almacenamiento Pantalla y casete de fósforo</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes de fósforo</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>film transparente (envoltura de Saran)</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>marcador de ADN ' Blauw'; Escalera de ADN.</td><td>MRC Holanda</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>marcador de ADN' Rood'; escalera de ADN</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de hexanucleótidos</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de construcción grande</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno termosellable, transparente</td><td>varios proveedores</td><td></td><td>El ancho de la tubería debe ser más ancho que el de la membrana secante</td></tr><tr><td>Sellador</td><td></td><td></td><td></td>térmico</tr><tr><td>Filtro de membrana </td><td>disco Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>Malla de hibridación</td><td>GE Healthcare Life Sciences RPN2519</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando vector binario bibac-gw

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que la expresión estable de un transgen. Esto requiere una integración del transgén, sola, intacta como integraciones de copia múltiple a menudo son objeto de silenciamiento génico. El vector binario compatible con Gateway basado en cromosomas artificiales bacterianos (pBIBAC-GW), como otros derivados de pBIBAC, permite la inserción de los transgenes de la solo-copia con eficacia alta. Como una mejora a la original pBIBAC, un cassette de Gateway ha sido clonado en pBIBAC-GW, para que las secuencias de interés pueden ahora ser fácilmente incorporadas en la transferencia vector DNA (T-DNA) Gateway clonando. Comúnmente, la transformación con pBIBAC-GW resulta en un rendimiento de 0.2 – 0.5%, por el que la mitad de los transgénicos llevan una integración solo copia intacta del T-ADN. Los vectores pBIBAC-GW están disponibles con resistencia a glufosinato-amonio o DsRed fluorescencia en las capas de semilla para la selección de las plantas y con resistencia a la kanamicina como una selección de las bacterias. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector por el proceso de generación de plantas transgénicas mediante pBIBAC-GW: a partir de la recombinación de las secuencias de interés en el vector de pBIBAC-GW de elección, a la planta de transformación con Agrobacterium, selección de los transgénicos y las pruebas de las plantas para la integridad y número de copia de los partes movibles utilizando ADN borrar. Se presta atención al diseño de una estrategia de Blot de DNA a reconocer solo y multi copy integraciones en loci únicos y múltiples.

Usando el sistema de la BIBAC-GW, construcciones de reportero para el estudio de ODM en las plantas fueron generado10. Construcciones fueron diseñadas en la entrada de la puerta de entrada vector pENTR gm12 y se inserta en pBIBAC-BAR-GW (figura 1) mediante la reacción de recombinación Gateway LR.
Arabidopsis se transformaron con pDM19, un plásmido de l...

Usando un vector binario pBIBAC-GW hace generar plantas transgénicas con inserciones intactas de solo-copia, un proceso fácil. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector a través del proceso de generación de plantas transgénicas de Arabidopsis y prueba de las plantas para la integridad y copiar el número de los insertos.

Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

El objetivo general de esta metodología es generar plantas transgénicas que lleven inserciones intactas de una sola copia de un ADN de transferencia, o ADN-T, de manera eficiente. El vector BIBAC-Gateway es una herramienta valiosa para generar plantas transgénicas que llevan inserciones intactas de una sola copia de secuencias de interés que muestran una expresión génica estable. Con el vector BIBAC-Gateway, se puede utilizar la tecnología de recombinación de gateway para insertar secuencias de interés con el mínimo esfuerzo.Todos los derivados de BIBAC, incluidos los vectores BIBAC-Gateway, son adecuados para transferir grandes fragmentos de ADN transgénico a los genomas de las plantas. Los vectores BIBAC-GW se pueden utilizar para insertar secuencias de interés en muchos sistemas de plantas, como el maíz, el arroz y el tomate. Hay dos plásmidos BIBAC-GW disponibles.El plásmido BIBAC-RFP-GW contiene un gen DsRed que se expresa en las cubiertas de las semillas. El plásmido BIBAC-BAR-GW contiene un gen que proporciona resistencia al glufosinato. Ambos vectores contienen un gen resistente a la kanamicina como marcador de selección en las bacterias.Para insertar las secuencias de inte

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este video, demostramos la generación de plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan un transgén estable a través de la transformación de genes basados en cromosomas artificiales bacterianos binarios mediados por Agrobacterium.

Transformación de genes basada en vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios en plantas de Arabidopsis: una técnica para generar plantas transgénicas con inserción de una sola copia

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son ensayos funcionales de rutina para la expresión ectópica transitoria de genes en plantas. Estos métodos son ensayos eficientes en estrategias efectoómicas (resistencia rápida y descubrimiento de genes de avirulencia) y cruciales para la investigación moderna en fitopatología molecular. Satisfacen la demanda de análisis funcionales robustos de alto rendimiento en las plantas.

Agroinfiltración y PVX Agroinfección en Papa y Nicotiana benthamiana

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

Las metodologías de selección de genes se pueden utilizar para generar ratones transgénicos con alelos knockout, knock-in y marcados.  Aquí, describimos un método mejorado de recombinación en E. coli, que denominamos 'subclonación más inserción', que se puede utilizar para generar rápidamente vectores de orientación génica personalizados.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

A continuación, presentamos un protocolo para transformar el lino utilizando Agrobacterium transformación de plantas mediada a través floral por inmersión. Este protocolo es simple de realizar y de bajo costo, sin embargo, produce una tasa de transformación más alta que los métodos actuales disponibles para la transformación de lino.

Floral-Dip transformación de lino ( Linum usitatissimum) Para generar transgénicos progenies con una alta tasa de Transformación

Usando el montaje de ADN, múltiples vectores de CRISPR pueden ser construidos en paralelo en una única reacción de clonación, por lo que la construcción de un gran número de vectores de CRISPR una tarea simple. Tomate raíces peludas son un excelente sistema modelo para validar vectores de CRISPR y generar materiales mutantes.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Aquí, presentamos un método para generar sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila sustituyendo el primer exón de la codificación de los genes con los conductores de la transcripción. El método basado en el CRISPR/Cas9 coloca una secuencia de transactivator bajo la regulación endógena de un gen sustituyó y en consecuencia facilita la expresión de transctivator exclusivamente en los patrones espacio-temporales de gene-específico.

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Aquí, describimos la generación y aplicación de un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana líneas de expresión inducible, tejidos específicos que en los tres principales meristemos, el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium.

Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Aquí, describimos un protocolo para generar mutantes maternos que acopla una línea knock-in zpc:cas9 estable con la entrega mediada por Tol2 de casetes de expresión de sgRNA.

Generación de mutantes maternos usando pez cebra zpc:cas9 knock-in

Aprende a generar plantas transgénicas con inserciones de solo-copia intactas usando el vector binario BIBAC-Gateway. Este método optimiza la transformación de Arabidopsis y garantiza expresión génica estable.

Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW

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