Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW

El objetivo general de esta metodología es generar plantas transgénicas que lleven inserciones intactas de una sola copia de un ADN de transferencia, o ADN-T, de manera eficiente. El vector BIBAC-Gateway es una herramienta valiosa para generar plantas transgénicas que llevan inserciones intactas de una sola copia de secuencias de interés que muestran una expresión génica estable. Con el vector BIBAC-Gateway, se puede utilizar la tecnología de recombinación de gateway para insertar secuencias de interés con el mínimo esfuerzo.

Todos los derivados de BIBAC, incluidos los vectores BIBAC-Gateway, son adecuados para transferir grandes fragmentos de ADN transgénico a los genomas de las plantas. Los vectores BIBAC-GW se pueden utilizar para insertar secuencias de interés en muchos sistemas de plantas, como el maíz, el arroz y el tomate. Hay dos plásmidos BIBAC-GW disponibles.

El plásmido BIBAC-RFP-GW contiene un gen DsRed que se expresa en las cubiertas de las semillas. El plásmido BIBAC-BAR-GW contiene un gen que proporciona resistencia al glufosinato. Ambos vectores contienen un gen resistente a la kanamicina como marcador de selección en las bacterias.

Para insertar las secuencias de interés en el vector binario, primero prepare la entrada de puerta de enlace y los vectores binarios, como se describe en el protocolo de texto. Para llevar a cabo una reacción Gateway, prepare la reacción de recombinación LR de acuerdo con las sugerencias del proveedor en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a temperatura ambiente. Mezcle de 100 a 300 nanogramos del clon Entry superenrollado y 300 nanogramos del vector BIBAC-Gateway.

Ajusta el volumen de la mezcla a 16 microlitros con TE. Por último, añadimos cuatro microlitros de mezcla de enzimas LR Clonasa, y mezclamos por vórtice. Incubar la mezcla a 25 grados centígrados durante una hora. Termine la reacción LR agregando dos microlitros de solución de proteinasa K a la mezcla.

Mezcle e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos antes de proceder con la transformación en E. coli, como se describe en el protocolo de texto. Para preparar las plantas de Arabidopsis para la transformación, cultive plantas de Arabidopsis en un invernadero o cámara de crecimiento con clima controlado hasta que estén floreciendo. Sujete los primeros pernos para permitir que emerjan más pernos secundarios.

Las plantas están listas para sumergirse de cuatro a seis días después del recorte, cuando las plantas tienen muchas cabezas de flores inmaduras y no muchas silicuas fertilizadas. Para realizar la inmersión floral, sumerja las inflorescencias durante cinco a 10 segundos en la suspensión de Agrobacterium. Agita suavemente.

Envuelva las partes aéreas de las plantas en una película adhesiva para mantener la humedad alta y cubra las macetas con una caja para mantener las plantas en la oscuridad. Incuba las plantas durante dos días en un invernadero o cámara de crecimiento. Después de dos días, retire la caja y la película adhesiva y cultive las plantas hasta la madurez en un invernadero o cámara de crecimiento.

Para aumentar la eficiencia de la transformación, las mismas plantas se pueden volver a sumergir siete días después de la primera inmersión. A continuación, cuando las plantas transformadas estén maduras y secas, coseche las semillas. Agrupa y analiza las semillas de las plantas transformadas con la misma construcción como un solo conjunto.

En caso de que las plantas se transformen con un derivado de plásmido BIBAC-RFP-Gateway, identifique las plantas transgénicas analizando las semillas mediante microscopía de fluorescencia. Para detectar la expresión de DsRed en las cubiertas de las semillas, obtenga imágenes de las semillas a una excitación de 560 nanómetros y una emisión de 600 a 650 nanómetros. Separe las semillas fluorescentes de las contrapartes no fluorescentes con pinzas.

Para detectar plantas transgénicas transformadas con un derivado plásmido BIBAC-BAR-Gateway, siembre las semillas en bandejas llenas de tierra. Asegure una distribución uniforme de las semillas sobre las bandejas suspendiendo las semillas en agar al 0,1% en medio MS 0,5x, y esparza las semillas con una pipeta de un mililitro. Estimula las semillas para que germinen de forma sincronizada incubando las semillas durante al menos dos días a cuatro grados centígrados.

Esto se puede hacer antes o después de sembrar las semillas. Dos y tres semanas después de sembrar las semillas, rocíe las plántulas con una solución de glufosinato y amonio al 0,5%. Use 500 mililitros de solución de glufosinato de amonio por metro cuadrado.

Transfiera las plántulas sobrevivientes a macetas. Analice las plantas resistentes al glufosinato de amonio por PCR para detectar la presencia del constructo de interés. Determine el número de integraciones de ADN-T y su integridad mediante transferencia de ADN utilizando enzimas de restricción.

Este método permite la identificación de integraciones únicas y repetidas en el mismo loci o en loci diferentes en el genoma. Utilice una serie de digestiones de restricción para identificar los diferentes patrones de integración posibles. Seleccione una enzima que corte una vez en el centro del ADN-T, para poder sondear de forma independiente las secuencias aguas arriba y aguas abajo del sitio de restricción.

Además, seleccione una enzima o una combinación de enzimas que eliminen toda la secuencia de interés a la vez. Tenga cuidado de usar solo enzimas de restricción que no sean sensibles a la metilación de la citosina. Después de realizar la transferencia de ADN, como se detalla en el protocolo de texto, realice el análisis de transferencia.

El análisis depende de la estrategia de restricción utilizada. Al analizar la transferencia utilizando la estrategia con un sitio de restricción en el centro del ADN-T, cuente el número de fragmentos detectados. En esta estrategia, el número de fragmentos hibridados sugiere el número de integraciones de ADN-T.

Compare el número de fragmentos detectados con una sonda para el lado izquierdo y derecho del ADN-T. Si se detecta un número diferente de fragmentos hibridados con las dos sondas, entonces están presentes múltiples integraciones de ADN-T en una repetición invertida o ADN-T incompletamente integrados. Para identificar las disposiciones en tándem e invertidas de los ADN-T, estime los tamaños de los fragmentos hibridados en la transferencia en función del tamaño de las bandas de marcadores y compare los tamaños estimados con los tamaños de fragmentos esperados calculados en función de la estrategia de restricción.

Para examinar si la secuencia de interés transgénica está intacta, analice el blot preparado de acuerdo con la estrategia con sitios de restricción en los extremos de la secuencia de interés. Calcule el tamaño de los fragmentos hibridados en la mancha en función del tamaño de las bandas marcadoras y compárelo con el tamaño esperado. Una inserción intacta produce un solo fragmento con una longitud definida.

Cualquier desviación de la longitud esperada indica una integración incompleta. Se muestra la estrategia de restricción y transferencia del ADN para determinar el número y la integridad de las integraciones de ADN-T. El sitio de restricción ScaI divide la secuencia reportera en las partes proximales del borde izquierdo que se detectan cuando se usa una sonda para barra y las partes proximales del borde derecho que se detectan cuando se usa una sonda para eYFP.

Los sitios de restricción BglII y PciI se colocan dentro del ADN-T, fuera de la construcción reportera. Una doble digestión da como resultado un fragmento con un tamaño definido, y cualquier desviación es una indicación de inserciones incompletas. El número de fragmentos hibridados identificados refleja el número de inserciones de ADN-T.

Un blot que contenía ADN genómico de nueve transgénicos digeridos con ScaI se hibridó con sondas para bar y eYFP. Varios carriles indican transgénicos con integraciones simples de ADN-T. El carril cuatro muestra dos fragmentos con barra y uno con eYFP, lo que indica un truncamiento de la secuencia eYFP o una repetición invertida alrededor del borde derecho.

El carril seis muestra dos fragmentos con bar y eYFP. Un fragmento tiene una intensidad débil con la sonda de barra. El otro fragmento tiene una intensidad alta, lo que indica dos inserciones de ADN-T, una de las cuales está truncada.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo incorporar su secuencia de ADN de interés en un vector binario BIBAC-GW utilizando la recombinación de Gateway, seguida de la transformación de Arabidopsis, el cribado y la evaluación del número de integraciones de ADN-T y su integridad. La generación y caracterización de plantas transgénicas requiere mucho tiempo. Cuando se utiliza BIBAC-Gateway como vector binario, se puede acortar el proceso de identificación de transgénicos con integraciones intactas de una sola copia.

Aproximadamente la mitad de los transgénicos generados con derivados de BIBAC llevan integraciones intactas de una sola copia. Por lo general, los individuos no se dan cuenta de que muchas plantas transgénicas generadas utilizando vectores binarios comunes llevan copias truncadas de un transgén o transgenes que muestran silenciamiento génico. Con los derivados de BIBAC, la mayoría de las plantas transgénicas generadas llevan integraciones intactas y únicas de un transgén que rara vez muestran silenciamiento génico.

Cuando se utiliza BIBAC-GW para generar transgénicos, es importante transformar un número suficiente de materiales vegetales, ya que la eficiencia general de transformación de los derivados de BIBAC es menor que la de los vectores binarios comúnmente utilizados. La eficiencia de transformación de BIBAC-GW está generalmente entre 0.2% y 0.5%Después de identificar plantas transgénicas que llevan integraciones de ADN T intactas de una sola copia, si es necesario, se pueden realizar análisis adicionales para definir la ubicación genómica precisa de la inserción de ADN-T. Los transgénicos con integraciones intactas de una sola copia muestran niveles de expresión comparables de los transgenes.

Esto indica que la posición de integración del ADN-T en el genoma tiene poco efecto sobre el nivel de expresión del transgén.