Name: Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a generar cepas tetraploides estables de Caenorhabditis elegans mediante interferencia de ARN del gen rec-8. Este método único permite estudiar los efectos de la poliploidización del genoma completo en procesos biológicos como dosificación génica y adaptación al estrés.

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Agradecemos al centro de genética de Caenorhabditis (financiado por el Instituto Nacional de salud (NIH) Oficina de investigación infraestructura programas P40 OD010440) para las cepas. Los autores desean agradecer a Baptiste Roelens y Eli Lessman, por facilitarnos el laboratorio Mano CCNY, CUNY para el uso de su laboratorio por parte de la película y por su ayuda y comentarios constructivos. Este trabajo fue financiado por una concesión de PSC-CUNY TRADB-46-113 y NIH grant 1SC2GM118275-01. M.S. fue apoyada parcialmente por un Instituto canadiense de beca postdoctoral de la salud (CIHR) y E.K. fue apoyada por la subida de NIH/NIGMS conceder GM062981.

1. ajuste rec-8 RNAi (día 1-3 en la figura 2)
Este protocolo se ha modificado de Kamath y Ahringer30.
<ol><li>Para la inducción de la rec-8 dsARN expresión en Escherichia coli, preparar medio de crecimiento de nematodos (NGM) agar placas31 suplementado con una concentración final de 1 mM Isopropil-β-D-2-tiogalactopiranósido (IPTG) y 100 μg/mL ampicilina. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C hasta su utilización, hasta por 4 semanas.</li>
	<li>Bacterias HT115 racha lleva el rec-8 (W02A2.6) clon del clon Ahringer laboratorio biblioteca30 rec 8 en platos de caldo Luria (LB) suplementado con 100 μg/mL ampicilina y tetraciclina μg/mL 50. Crecen durante la noche en un agitador a 37 ° C.</li>
	<li>El día 1, inocular las colonias individuales de las colonias solo recién veteadas de las bacterias e. coli de HT115 llevar el clon de ARNi rec 8 en 4 mL LB que contiene 100 μg/mL ampicilina y tetraciclina μg/mL 50. Cultivar la cultura de las bacterias durante la noche en un agitador o un tambor de rodillo a 37 ° C.</li>
	<li>A la mañana siguiente (día 2), inducen la producción de doble cadena (ds) RNA para rec-8 W02A2.6 en el cultivo bacteriano HT115 añadiendo una concentración final de 1 mM IPTG y agitándolo durante 40 min a 37 ° C.</li>
	<li>Después de la inducción, semilla planchas NGM/IPTG con 100-200 μL de HT115 rec-8 bacterias y almacenar las placas a temperatura ambiente en la noche oscura (día 3).</li>
	<li>A la mañana siguiente (día 4), añadir la tensión deseada de nematodos a las placas de bacterias inducidas HT115 rec-8 como se describe en el paso 2.1 a continuación.</li>
</ol>2. generar y aislar tetraploides (día 4-16 en la figura 2)
<ol><li>En el día 4, colocar 3-4 jóvenes hermafroditas (cuarto) estado larvario de L4 de la cepa diploide deseada en las placas de la NMG/IPTG sembradas con HT115 rec-8 bacterias que habían sido inducidas el día antes (paso 1.5, arriba). Crecen nematodos a 15 ° C en la oscuridad.</li>
	<li>Repita los pasos 1.3 y 1.4 a partir de 3 días después del paso 2.1, que tres días antes de la primera progenie (F1s) de ese paso se L4s. Los tiempos de este paso dependerá de cuán rápido crece una cepa Nematoda a 15 ° C. Algunas cepas mutantes diploides son cultivadores lentos, y este momento se necesita fina sintonización para aislar tetraploides.</li>
	<li>Día 8 (después de 4 días de tratamiento de alimentación de ARNi rec-8 ), 20 (2 hermafroditas/placa Petri) de las F1 (primera generación filial) L4 hermafroditas en las HT115 rec-8 bacterias en recién inducido HT115 rec-8 ARNi de transferencia y permite que fertilizarse.<ol>
<li>Por otra parte, transferencia 20 de los hermafroditas F1 L4 crecido en las HT115 rec-8 bacterias en recién inducida por HT115 rec-8 ARNi bacterias junto con machos no tratados de la misma cepa (2 hermafroditas machos/placa de 4-6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>El día 13, Inicio detección F2 (segunda generación filial) progenie que aparecen largo (Lon) o en general mayor que el tipo salvaje; luego se transfieren los animales Lon en regular OP50 o HB101 cepas de bacteria e. coli . Continuar investigación F3 progenie (tercer filial); sin embargo, progenie F3 de la misma placa no puede considerarse cepas independientes si ellos establecidos, porque podían ser hermanos del mismo establecieron ya madre de F2. Nota: Supuestos tetraploides son fácilmente identificables porque son claramente más largos que los diploides. Hermafroditas de tipo salvaje son dos tercios menos de tetraploides. Porque es más largo, un organismo tetraploide hace un giro extra mientras se mueve hacia adelante generando ondas sinusoidales cuerpo-flexión de la cabeza a la cola (Figura 3A).</li>
	<li>Permiten Lon gusanos para fertilizarse y propagan escogiendo Lon progenie hasta sólo Lon progenie se engendró en la ausencia de rec-8 tratamiento de RNAi. Esto puede tardar dos o tres generaciones más. LON gusanos a menudo son estériles y no producen progenie.</li>
</ol>3. verificación de variedades tetraploides (película 1 y Figura 3A, B)
Nota: Variedades tetraploides pueden validarse contando el número de cromosomas en los óvulos no fecundados. Microscopía fluorescente se puede utilizar para detectar el número de pares de cromosomas en ovocitos no fecundados diploides (antes de la división meiótica), si la cepa tiene un marcador fluorescente de los cromosomas. En la ausencia de marcadores de cromosoma fluorescente, pueden proyectará tetraploides nematodos los nematodos de fijación y tinción con un colorante de ADN; Vea a continuación un protocolo para la fijación de etanol y 4′ de todo animal, coloración diclorhidrato 6-Diamidine-2′-phenylindole (DAPI).
<ol><li>Todo animal de la coloración de DAPI Nota: Variedades tetraploides con 12 pares de cromosoma conectado pueden ser validadas por DAPI tinción de estos animales y contar el número de cuerpos DAPI en sus ovocitos no fecundados.<ol>
<li>Lugar de 5 a 10 μl de buffer M931 en un portaobjetos de microscopio, luego transferencia 6-10 nematodos a la caída.</li>
		<li>Con un microscopio de disección, sacar la mayor parte de la M9 de la gota sin eliminar los nematodos con un pañuelo de limpieza sin pelusa. Luego, añadir una gota de 10 μl de etanol al 90% en los gusanos. Permitir a los gusanos que se seque completamente, pero para no más de un par de segundos.</li>
		<li>Tan pronto como el etanol se evapora (esto se puede ver como ocurre con el microscopio de disección), agregar un adicional 10 μl de etanol al 90% en los gusanos.</li>
		<li>Repita el paso 3.1.3 tres veces más.</li>
		<li>Una vez que se haya evaporado la última gota de etanol, agregue 6 μl de colorante DAPI o Hoechst en la concentración final recomendada en los medios de montaje de elección (por ejemplo, una dilución de la 1:1,000 de una concentración stock de 2 ng/μl DAPI en M9). Para almacenamiento a largo plazo de las diapositivas, 0.5% p-fenilenodiamina disuelto en 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, en 90% de glicerol como solución antifade, en lugar de M9, puede utilizarse.</li>
		<li>Cubrir los gusanos en el portaobjetos con un cubreobjetos y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Puntuación en un microscopio de fluorescencia (paso 3.1.7) por lo menos 10 minutos después de agregar el cubreobjetos. Diapositivas sin preservador de fluorescencia pueden almacenarse durante unos días a 4 ° C antes de anotar, pero la calidad de fluorescencia comienza a disminuir después de algunos días.</li>
		<li>Utilizando un microscopio de fluorescencia con 100 aumentos, anotar el número de cuerpos solo de DAPI (pares de cromosomas probablemente único) en el oocito sin fertilizar más maduro, que es inmediatamente adyacente a la espermateca y aún no ha entrado en la espermateca o el útero.<ol>
<li>Para conseguir cuerpos DAPI individuales dentro de un núcleo de ovocito, usar foco fino del microscopio a moverse lentamente desde la parte superior del núcleo del ovocito al fondo durante la cuenta. Entonces, narran el mismo núcleo mientras se mueve el foco en la dirección opuesta (es decir, desde el fondo hasta la parte superior del núcleo) para confirmar el número contado de cuerpos DAPI.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Anotar la más madura ovocitos no fecundados en cada una de las dos gónadas en por lo menos diez hermafroditas por cepa Lon estable. Ovocitos de tipo salvaje tienen 6 cuerpos DAPI en promedio, 5 pares de autosome y el par de cromosomas sexuales. La presencia de 12 cuerpos DAPI en el ovocito de cepas Lon estables indica que los animales en esta cepa son parciales (4 juegos de autosomas, 3 X-cromosomas) o completadas (4 juegos de autosomas, 4 X-cromosomas) tetraploides.</li>
		<li>Calcular el número promedio de DAPI cuerpos observados desde múltiples ovocitos (por lo menos 10) por cepa. Se tocarán algunos pares de cromosomas o en top de otro, por lo que el número de DAPI cuerpos en un oocito es a menudo más pequeño que el número real de pares de cromosomas.</li>
		<li>(Opcional) Validar otras cepas de Lon estables donde el número promedio de organismos DAPI es 12 para probar si son full (4A, 4 X) o parcial (4A, 3 X) tetraploides por la inmunofluorescencia que manchaba contra proteínas de eje del cromosoma como HTP-332. Esta coloración distinguir pares de cromosomas, mostrando un patrón cruciforme de cromosomas solo presentes en el tetraploide parcial.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Producción de haploides gametos (n) es clave para generar un cigoto diploide (2n) en la fertilización. Esta reducción del genoma se logra durante la meiosis con dos divisiones celulares consecutivas después de una duplicación del genoma individual. Generar haploides gametos, C. elegans, como con la mayoría de los metazoos, segregan homólogos maternal y paternal-derivados de la primera división, mientras que hermana cromátidas hermanas de cada homólogo se segregan en la segunda división. Una manera genoma polyploidy se presenta en la naturaleza es a través de la generación de gametos que no a la mitad su tamaño del genoma durante la meiosis.
Ha sido conocido por más de 50 años que tetraploide nematodos C. elegans son viables y fértiles. Nigon23y más adelante Madl y Herman22generado e identificó un puñado de C. elegans tetraploides interrumpiendo segregación cromosómica meiótica usando tratamientos de shock térmico y uso de marcadores genéticos, respectivamente. Un solo adicional C. briggsae variedad tetraploide se derivó usando este protocolo más de 30 años más adelante24. Estos tetraploides se utilizaron para investigar cómo C. elegans determinar si masculina o hermafrodita, cómo regula la ploidía y el crecimiento y analizar el apareamiento y sinapsis en meiosis25,26, 38 , 39 , 40. sin embargo, estos y otros estudios que requieren el uso de específicas tetraploides o variedades triploides fueron limitados por la dificultad en la generación de variedades tetraploides por este método.
El protocolo aquí descrito permite la generación de 4A completo estable, 4 X y parcial 4A, 3 X tetraploide Caenorhabditis NEMATODAS cepas de cualquier inicial fondo genético diploide o karyotype sin el uso de marcadores genéticos.
Tetraploidy puede presentarse en más de un mecanismo en la C. elegans:
Madl y Herman sugirieron que las variedades tetraploides que generó probablemente derivan de un estado intermedio triploide. Sus cepas fueron obtenidas por selección durante varias generaciones o cruzando el triploide supuesto intermedio con machos diploides22. Los defectos en el cromosoma repartir en rec-8 mutantes que da lugar a óvulos diploides y a esperma sugieren otro posible mecanismo por el cual animales tetraploides pueden surgir con la rec-8 esquema de ARNi27.
Las rec-8 ARNi tratado hermafroditas podrían producir diploides ovocitos y espermatocitos, que darían lugar a animales tetraploides en fertilización. Es consistente con esta posibilidad el hecho de que algunos de los clonados hermafroditas F2 dieron lugar a cepas Lon estables en la próxima generación, que sugiere que el clonado hermafroditas Lon F2 donde ya tetraploide. En el esquema de cruce, la primera generación de rec-8 ARNi tratado hermafroditas se cruza con machos no tratados. Espermatocitos diploides todavía podrían surgir en los hombres porque la Cruz se hace en presencia de bacterias expresando dsARN rec-8 y por lo tanto, los machos están expuestos a rec-8 ARNi durante el apareamiento durante al menos 3 días. Por lo tanto, los poliploides Lon en el esquema cross-fertilizing también pudieran haber formado de la fertilización de ovocitos diploides por un espermatozoide diploide. Estables variedades tetraploides pueden surgir de cualquier fecundación entre gametos diploides o de cruzar animales triploides que contengan ovocitos de ploidia variable con animales diploides producen espermatozoides haploides.
Consideraciones importantes:
Uno mismo-frente a esquemas de intercambio de ideas:
El esquema de la uno mismo-fertilización rec-8 ARNi tratados F1 hermafroditas y el régimen de cruce de hermafroditas tratadas con los varones no tratados dieron lugar a 4A, 4 X y 4A, 3 variedades tetraploides de X. Aunque poliploides más fueron aislados inicialmente del sistema uno mismo-fertilización, más de estos animales poliploides fueron estériles y así ambos sistemas son igualmente eficientes en producir cepas estables tetraploides. La razón para el éxito y la esterilidad en el esquema autofértiles sigue siendo desconocida. Aunque ambos sistemas son igualmente eficientes, el esquema autofértiles es más fácil que no requiere el aislamiento de machos para el apareamiento. Además, cuando la cepa de interés es ineficiente o defectuosa en el apareamiento, el esquema autofértiles sería preferible. El esquema de cross-fertilizing puede utilizarse para generar complejos tetraploides que contiene más de dos versiones de un solo cromosoma.
Modificaciones y limitaciones:
Actualmente, este protocolo trata de rec-8 tratamiento de ARNi alimentando bacterias expresando dsRNA para el gen de la rec-8 . Así, este Protocolo no funciona en la especie Caenorhabditis insensible a ARNi de alimentación, o en mutantes defectuosos en difusión ambiental o sistémica de ARNi entre tejidos41,42,43. Potencialmente, este problema podría solucionarse mediante la introducción de ARNi tratamiento por inyección directa de dsRNA de interés directamente en la línea germinal.
Animales triploides deben generarse un tetraploide, cruzando a un animal diploide del que se deriva, porque este esquema no genera variedades triploides estable44,45. Sólo el 15% de los huevos deseada por triploides portilla y su progenie es sobre todo estéril descendencia debido a aneuploide. Además, la progenie fértil sobreviviente pocos tiende a ser completa o cerca de diploides dentro de un par de generaciones. Esto es probable, al menos en parte, porque los ovocitos corrigen parcialmente trisomía por segregar el tercer cromosoma en el cuerpo polar en la primera división meiótica.
Una limitación insuperable de este protocolo es que no funciona para hacer tetraploides de mutantes que afectan a los componentes de la maquinaria de RNAi porque son resistentes a ARNi tratamiento46.
Solución de problemas:
REC-8 ARNi:
Algunas consideraciones son cruciales para este protocolo tenga éxito. La primera es utilizar IPTG fresco y recién hechas placas de IPTG NMG para la inducción de la rec-8 producción de dsRNA en las bacterias las bacterias HT115 llevar el clon de rec-8 (W02A2.6). IPTG es sensible a la luz y es importante reducir la exposición a la luz a las placas. Placas IPTG pueden almacenarse un mes a 4 ° C en la oscuridad. En segundo lugar, el rec-8 (W02A2.6) ARNi HT115 las cepas bacterianas de la biblioteca de Ahringer (Kamath y Ahringer 2003) rindieron un fenotipo rec-8 más fuertes que otros disponibles rec-8 clones HT115.
Mantenimiento de la variedad tetraploide:
Tetraploides cepas crecen muy lentamente y producen a más de 50 progenies por generación47. Todas las variedades tetraploides identificadas son relativamente estables, pero puede romper y convertirse en diploide cuando subrayó (comunicación personal de Jonathan Hodgkin y nuestras observaciones no publicadas). Por lo tanto, es importante tener en cuenta cuando crecen variedades tetraploides a 25 ° C, calor-dio una sacudida eléctrica, de hambre, o congelados y descongelados, rápidamente puede volver a Diploidia, por lo que es importante seguir escoger los animales Lon cuando estas cepas de descongelación o cuando exposición de estas cepas a condiciones estresantes que pueden causar a revertir.
Posibles aplicaciones:
Investigación del efecto o el papel de la poliploidización del genoma entero en evolución, ciclo celular, expresión génica y el desarrollo en organismos pluricelulares ha dependido de las comparaciones entre: las células en un organismo que contienen diferente ploidía, la misma célula estrechamente relacionada con los tipos de especies con diferente ploidía o especies que han sufrido eventos de poliploidización evolutivamente reciente y aislamiento físico3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Aunque tetraploides pueden derivarse de sistemas modelo de pez cebra y el ratón, sus crías son estériles o catequizador letal16,17. Además, estos sistemas de modelo tienen ciclos de vida largo en comparación con el C. elegans, y los métodos disponibles para generar animales poliploides son complejos e ineficientes. Por lo tanto, las cepas de C. elegans obtenidas por este método será fundamental para impulsar las investigaciones sobre los efectos y funciones de todo el genoma polyploidy en los organismos multicelulares.
Puesto que un triploide puede derivarse de un tetraploide cruzando el tetraploide para la diploide original, una comparación entre diploides, triploides y tetraploides que sólo difieren en el número de copias del genoma, provee una oportunidad única y sin precedentes para evaluar el equivalente animales/órganos/células con genoma diferente tamaño (o dosis de gen). La flexibilidad y facilidad del esquema aquí descrito nos ha permitido generar docenas de variedades tetraploides de diferentes genéticas diploides o cariotipos. Algunas de estas cepas fueron utilizados ya a mecanismos de consulta del cromosoma homólogo apareamiento y sinapsis durante la meiosis27.
Las cepas tipo salvaje y mutante tetraploides con marcadores fluorescentes proporciona nuevas vías de investigación para entender las relaciones entre la relación de tamaño y nuclear/citosol genoma animal intracelular/celular/órgano y toda escala, todo el genoma poliploidización en adaptación, especiación, dosis del gen, expresión y desarrollo de órganos y tejidos. Además del estudio de la escala biológica, la generación de variedades tetraploides será significativamente más consultas de cuestiones biológicas fundamentales pertinentes a extracelular señalización, inestabilidad del genoma, endorreduplicación, genoma duplicación, dosificación del gene, adaptación al estrés, desarrollo de resistencia a las drogas y especiación del mecanismo.

Genoma entero polyploidy existe en toda la naturaleza y es a menudo un paso necesario en la adaptación, especiación, organogénesis, cicatrización de la herida y la escala biológica; también es conocido por promover el cáncer y la resistencia a drogas1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. industrias de la agricultura y la pesca generan plantas poliploides, pescados y mariscos por tratamiento químico (p. ej., colchicina y orzalin) para obtener las tasas de crecimiento más rápidas y más voluminosas cosechas y el ganado13, 14,15. Experimental e ineficiente producción de tetraploides existe para el ratón y pez cebra modelo sistemas16,17. Sin embargo, la mayoría o todos poliploides animales multicelulares generados son catequizador letal o estéril y por lo tanto no es lo ideal para los estudios de laboratorio sobre los efectos de polyploidy en un organismo multicelular. En consecuencia, cualquier comprensión de la poliploidización del genoma en organismos pluricelulares se ha limitado a especies estrechamente relacionadas de evolutivo reciente poliploidización eventos18,19,20 . Un camino para avanzar en las consultas de la función biológica o consecuencias del polyploidization es el uso del sistema de modelo de C. elegans . Lo importante, C. elegans es un sistema genético tratable que normalmente existe como un diploide, contiene sólo cinco autosomas (A) y un cromosoma sexual (X) por genoma, es transparente para la observación en vivo de los procesos biológicos, y tiene un corto ciclo de vida de 3-4 días (de huevo a adulto sexualmente maduro). C. elegans ha demostrado ser capaz de reproducir como un tetraploide, que es el tipo más común de todo el genoma poliploidía en la naturaleza. Animales triploides pueden ser generados por cruzar tetraploides con diploides, pero su ploidía no es estable, y las cepas se vuelven diploides dentro de un par de generaciones.
En las últimas décadas sólo un puñado de viable y fértil C. elegans variedades tetraploides se aislaron en el laboratorio, usando una estrategia que es laborioso y genera sólo limitados tipos de cepas21,22, 23. esta estrategia genera tetraploides de C. elegans mediante tratamientos de choque térmico, que probablemente afecta a la segregación de cromosomas en los gametos, seguido por una investigación por supuesto animales poliploides utilizando marcadores genéticos. Estos tetraploides eran extremadamente útiles en la investigación de cómo este nematodo determina si se macho o hermafrodita. Estudios posteriores utilizan las cepas disponibles para investigar el crecimiento, la dosis de gen y regulación de la sinapsis durante la meiosis en este nematodo21,24,25,26. Desafortunadamente, estos estudios estuvieron limitados por la dificultad para generar nuevas variedades tetraploides y los marcadores genéticos de fondo estas cepas contenidas. Se muestra a continuación es un protocolo simple y rápido para generar tetraploides estables, que se ha utilizado para generar cepas para estudiar la regulación de la sinapsis durante la meiosis27.
Como en la naturaleza, poliploidización puede surgir por la formación de diploide en vez de gametos haploides. Nuestro hallazgo de que un componente de cohesina específica de meiosis mutante rec-8 genera espermatozoides diploides y ovocitos tumbaron el gen rec-8 resultaría en la producción de descendencia tetraploide (figura 1)27, 28,29. Generación de variedades tetraploides simplemente implica derribar 8 rec por ARN de interferencia (ARNi) para dos generaciones en orden a la fenocopia rec-8 gametos diploides mutantes. Supuesta poliploides pueden ser fácilmente identificados por su más que el tamaño normal del cuerpo. Poliploides son confirmados como tetraploides total o parciales por contando el número de cromosomas por núcleo una vez que se establecen líneas estables.
La estrategia aquí descrita permite la generación de estable tetraploides cepas NEMATODAS Caenorhabditis de fondo genético diploide inicial o cariotipo sin el uso de marcadores genéticos. Puesto que este protocolo es más eficiente, versátil y simple que el esquema anteriormente utilizado, ampliará las herramientas necesarias para consultar los roles de poliploidización en procesos fundamentales de desarrollo, la estabilidad del genoma y la evolución en pluricelulares organismos. La limitación sólo previsible en el uso de este protocolo es en fondos genéticos resistentes a ARNi.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Microscopía Mótica</td><td>SMZ171</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>NGM placas de agar</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Placas de Petri, Estéril</td><td>Investigación</td> <td>TritechT3305</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 35 mm x 15 mm, estériles</td><td>Tritech Research</td><td>T3500</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico, 5 kg</td><td>VWR</td><td>89140-850</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, grado biotecnológico</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>Peptona, BD Bacto</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina Trihidrato</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, sin dioxano</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Growth Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Lennox Broth</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-176</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>LB Placas de agar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Lennox</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-182</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Antibióticos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicilina Trihidrato</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrate</td><td>Biotium</td><td>40045</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fijación de etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, puro, 190 pruebas (95%), USP</td><td>Koptec, VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>M9 Tampón</fuerte>Cloruro</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>de <td>sodio, grado biotecnológico</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico anhidro</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, monobásico dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC271750025</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Clones de ARNi</bacterias strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 que expresan rec-8 dsRNA</td><td>Fuente: Bioscience</td><td>W02A2.6</td><td></td></tr><tr><td>Bacterias HT115 que expresan rec-8 dsRNA</td><td>Dharmacon</td><td>RCE1182-202299820</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulación de ploidía en caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mecanismos que involucran todo el genoma polyploidy desempeñan papeles importantes en el desarrollo y evolución; también, una generación anormal de las células tetraploides se ha asociado con la progresión del cáncer y el desarrollo de resistencia a los medicamentos. Hasta ahora, no ha sido posible manipular fácilmente la ploidía de un animal multicelular sin generar progenie sobre todo estéril. Presenta aquí un protocolo simple y rápido para generar tetraploide Caenorhabditis elegans animales de cualquier cepa diploide. Este método permite al usuario crear un sesgo en la segregación cromosómica durante la meiosis, en última instancia aumento de ploidía en C. elegans. Esta estrategia se basa en la reducción transitoria de la expresión del gen rec-8 para generar gametos diploides. Un mutante de rec-8 produce gametos diploides que pueden potencialmente producir tetraploides en fertilización. Este esquema manejable se ha utilizado para generar variedades tetraploides con mutaciones y los cambios del cromosoma para profundizar en la dinámica cromosómica e interacciones durante el apareamiento y sinapsis en la meiosis. Este método es eficiente para la generación de variedades tetraploides estables sin marcadores genéticos puede aplicarse a cualquier cepa diploide y se puede utilizar para derivar triploide C. elegans. Este sencillo método es útil para la investigación de otras cuestiones biológicas fundamentales pertinentes a inestabilidad genómica, gene dosificación, escala biológica, señalización extracelular, adaptación al estrés, desarrollo de resistencia a las drogas, y mecanismos de especiación.

Este método permite la generación de nematodos Caenorhabditis tetraploides y triploides de cualquier cepa diploide. Las cepas poliploides generadas por este método se han utilizado para estudiar las interacciones de cromosoma en profase meiótica, y este método es útil para examinar importantes cuestiones fundamentales, del desarrollo, evolutiva, biología celular y cáncer.

Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

El objetivo general de esta metodología es derivar cepas tetraploides estables a partir de diploides de cualquier genotipo o cariotipo con el fin de estudiar el papel o las consecuencias de la poliploidización del genoma completo en los procesos biológicos. Este método puede ayudar a estudiar el papel de la poliploidización del genoma completo en la dosis de genes, el escalamiento biológico, la señalización extracelular, la inestabilidad del genoma, el desarrollo de resistencia a los fármacos, la adaptación al estrés y los mecanismos de especiación. La principal ventaja de esta técnica es que es eficiente, versátil, simple, así como la única técnica disponible en organismos multicelulares para generar tetraploides estables y fértiles a partir de cualquier cepa diploide.La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando estaba analizando el fenotipo de segregación cromosómica de los mutantes rec-8 en espermatocitos y ovocitos. Los mutantes Rec-8 generan espermatozoides y ovocitos diploides, lo que indica que la reducción del nivel de expresión del gen rec-8 podría resultar en la producción de progenie tetraploide en la fertilización. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Katherine Rivera Gómez, estudiante graduada de mi laboratorio.Para inducir la expresión de ARN bicatenario rec-8 en Escherichia coli, prepare placas de agar NGM con un milimolar de IPTG y 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Guarde estos platos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante un máximo de cuatro semanas. Ahora prepare las bacterias que llevan el clon rec-8 apropiado.Escríbalos en los platos que contienen los antibióticos apropiados e incube las bacterias durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, inocule colonias individuales de las placas en cuatro mililitros de LB con la misma concentración de antibiótico y cultive las bacterias durante la noche a 37 grados centígrados con agitación. Al día siguiente, inducir la producción de ARN bicatenario mediante la adición de IPTG hasta que la concentración final sea de un milimolar de IPTG.Luego continúe la incubación durante 40 minutos. A continuación, siembre las placas NGM IPTG preparadas. Agregue de 100 a 200 microlitros de cultivo a las placas e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche.A la mañana siguiente, coloque tres o cuatro hermafroditas jóvenes en etapa L4 en las placas de bacterias rec-8 y déjelos crecer a 15 grados centígrados en la oscuridad. Aproximadamente tres días después, cuando los hermafroditas F1 están en la etapa larvaria L3 a L4, comienzan a producir más placas de bacterias rec-8 RNAi. Después de unos cuatro días en las placas de bacterias rec-8, transfiera 20 de los hermafroditas adultos jóvenes F1 L4 a las placas de ARNi rec-8 recién inducidas y permita que se autofecunden.También es posible incluir de cuatro a seis machos no tratados de la misma cepa. Más tarde, compruebe si hay progenie F2 con el fenotipo largo. En general, son más grandes que el tipo salvaje y sus cuerpos hacen un giro adicional a medida que avanzan, generando ondas sinusoidales de flexión del cuerpo desde la cabeza hasta la cola.Transfiera estos supuestos tetraploides a las bacterias E. coli OP50 o HB101 regulares. Examina también la placa para detectar la progenie F3. Sin embargo, estas F3 no pueden considerarse cepas independientes porque pueden ser hermanas de la misma madre F2.Deje que los gusanos largos recolectados se autofertilizen para propagarse. Continúe transfiriendo de tres a seis animales largos de cada generación a una nueva placa hasta que solo se engendre una progenie larga. Esto puede llevar algunas generaciones, ya que los gusanos a menudo son estériles y no producen progenie.Las cepas tetraploides tienen 12 pares de cromosomas que se pueden validar contando los cuerpos teñidos con DAPI en ovocitos no fertilizados. Para hacerlo, deje caer de cinco a 10 microlitros de tampón M9 en un portaobjetos y transfiera de seis a 10 tetraploides putativos a la gota. Bajo un microscopio de disección, absorba cuidadosamente la mayor parte del M9 en un pañuelo de limpieza sin pelusa.A continuación, deje caer 10 microlitros de etanol al 90% sobre los gusanos y observe cómo el etanol se evapora por completo. Tan pronto como termine la evaporación, repita el proceso de agregar etanol y observe cómo se evapora. En total, agregue 10 microlitros en cuatro aplicaciones.Después de que la última gota se evapore, agregue seis microlitros de DAPI a dos nanogramos por microlitro o una mancha similar. Para el almacenamiento a largo plazo de los portaobjetos, monte los gusanos en un antidecoloración disponible comercialmente o casero. A continuación, añade un cubreobjetos y sella los bordes con esmalte de uñas.Una vez que el esmalte de uñas se haya secado, las diapositivas se pueden marcar. Utilice un microscopio fluorescente y un aumento de 100X. En primer lugar, encontrar el ovocito no fecundado más maduro que esté inmediatamente adyacente a la espermateca y que aún no haya entrado ni en la espermateca ni en el útero.Los cuerpos DAPI aquí son presumiblemente pares de cromosomas individuales. A continuación, concéntrese en el núcleo del ovocito y utilice el enfoque fino del microscopio para escanearlo lentamente de arriba a abajo mientras cuenta los cuerpos DAPI. A continuación, vuelva a contar los cuerpos DAPI en el mismo núcleo moviendo el foco de abajo hacia arriba.Los ovocitos de tipo salvaje tienen un promedio de seis cuerpos DAPI. La presencia de 12 cuerpos de DAPI indica que los animales de esta cepa son tetraploides parciales o completos. Analice al menos 10 animales por cepa.A menudo, los pares de cromosomas estarán muy cerca o se tocarán, por lo que el número de cuerpos DAPI suele ser menor que el número real de pares de cromosomas. Se generaron múltiples cepas tetraploides alimentándose con bacterias C. elegans que expresan ARN bicatenario rec-8. Los tetraploides pueden surgir por autofertilización de hermafroditas durante dos o tres generaciones o por cruzamiento de la primera generación de hermafroditas con machos no tratados del mismo genotipo.En este último escenario, los machos del cruce están expuestos a las bacterias rec-8 RNAi desde la etapa L4 en adelante durante el apareamiento. Las cepas tetraploides se confirmaron mediante el cribado de la presencia de 12 pares de cromosomas encontrados en los ovocitos de los hermafroditas tetraploides en comparación con los seis pares de cromosomas encontrados en los ovocitos de los hermafroditas diploides. Se identificaron dos tipos de hermafroditas tetraploides.Uno engendró machos a frecuencias similares a los hermafroditas diploides, y el otro engendró machos a una frecuencia mucho mayor. El primero es tetraploide para todos los cromosomas y el segundo es tetraploide para todos los autosomas, pero es triploide para el cromosoma sexual. Las cepas tetraploides crecen más lentamente y producen crías más pequeñas.La inspección superficial de las cepas tetraploides no ha revelado un número suficientemente elevado de ovocitos aneuploides, ni divisiones anormales de ovocitos o espermatocitos para explicar la reducción observada en el tamaño de la cría. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo del cáncer del desarrollo y la biología evolutiva exploren el papel de la poliploidización del genoma completo en una gran variedad de funciones biológicas. Al utilizar esta técnica, es importante recordar que siempre se deben utilizar placas NGM IPTG frescas para inducir la expresión bacteriana de ARN bicatenario.Si todo va bien, los tetraploides se pueden producir en menos de tres semanas.

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Investigación

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Genetics

Genética

Aquí, describimos una técnica utilizada para visualizar el ADN genómico en nematodos fijos e intactos. El video incluye un ejemplo de protocolo para contar cromatina en ovocitos no fertilizados de C. elegans.

Fijación de etanol y tinción con DAPI: un método para visualizar el ADN en C. elegans

Describimos los pasos detallados de un ensayo químico de alto rendimiento en el nematodo Caenorhabditis elegans utilizado para evaluar la toxicidad de la línea germinal. En este ensayo, la interrupción de la función de la línea germinal después de la exposición química se monitorea utilizando un indicador fluorescente específico para embriones aneuploides.

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aquí detallamos protocolos específicamente diseñados para monitorear los defectos morfogénicos que ocurren durante las fases tempranas y tardías de la elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans. En última instancia, estos protocolos están diseñados para identificar los genes que regulan estas fases y caracterizar sus requisitos diferenciales a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Un protocolo modificado para la manipulación de ploidía utiliza un choque de calor para inducir una parada de un ciclo en la citocinesis en el embrión temprano. Este protocolo se demuestra en el pez cebra, pero puede ser aplicable a otras especies.

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Presentamos un método automatizado para la reconstrucción tridimensional de lo elegans de Caenorhabditis del germline. Nuestro método determina el número y la posición de cada núcleo dentro de la línea germinal y análisis del germline proteínas distribución y estructura citoesquelética.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

Este es un método comúnmente utilizado para la disección de gónadas de C. elegans seguida de grieta por congelación, que produce muestras de línea germinal para inmunofluorescencia a través de tinción de anticuerpos, o para tinción DAPI simple para visualizar el ADN. Este protocolo ha sido exitoso para los estudiantes universitarios en un laboratorio de investigación y en una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos.

C. elegans Disección de gónadas y grieta por congelación para inmunofluorescencia y tinción DAPI

Aquí, presentamos un método general para determinar la viabilidad embrionaria y el número total de embriones producidos (cría) utilizando el organismo modelo C. elegans.

Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans

Este protocolo proporciona un método para medir las frecuencias de cruce y la distribución durante la meiosis en Caenorhabditis elegans. Se utilizó el genotipado de polimorfismo de un solo nucleótido con PCR en tiempo real para determinar el origen de los cromosomas. El mapeo de 4 puntos permitió determinar las distribuciones cruzadas de las regiones del brazo izquierdo, central y derecho de cada cromosoma. ...

Frecuencia y distribución de cruzamientos en la meiosis de Caenorhabditis elegans mediante genotipado de SNP mediante PCR en tiempo real

Aprende a generar cepas tetraploides estables de Caenorhabditis elegans mediante interferencia de ARN del gen rec-8. Este método único permite estudiar los efectos de la poliploidización del genoma completo en procesos biológicos como dosificación génica y adaptación al estrés.

Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans

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