Name: Mejora de señal rápida Nanoprobe por síntesis de nanopartículas de oro In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprende a amplificar señales de nanosondas en biosensores mediante reducción de ácido cloroáurico in situ. Este método versátil detecta concentraciones mínimas de nanopartículas de oro, plata y óxido de hierro con aumento de 100 veces.

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Financiación del Consejo Europeo de investigación de la Unión Europea en el séptimo programa marco (FP/2007-2013) / ERC Grant acuerdo no. 615458, el Consejo Sueco de investigación y excelencia Pronova centro de tecnología de la proteína (VINNOVA - sueco Agencia gubernamental de los sistemas de innovación) se agradece.

De acuerdo a los requisitos legales y éticos del país de colección, es decirse obtuvieron muestras de suero humano. con la aprobación de un Comité de ética (o similar) y con el consentimiento del donante.
1. preparación de solución realce:
<ol><li>Para preparar un tampón de pH 6 10 mM MES suspender MES sal de sodio en agua desionizada. Ajustar el pH a 6 con una solución de NaOH de 4 M.</li>
	<li>Preparar una solución de4 HAuCl en tampón 10 mM MES pH 6 (solución 1) de 5 mM.</li>
	<li>Preparar una solución de 1,027 M H2O2 en tampón 10 mM MES pH 6 (solución 2). Nota: Los volúmenes de la solución 1 y 2 de solución depende del número y tamaño de los microarrays para mejorarse. Por ejemplo, un microarray de 10 x 10 mm requiere 100 μL volumen total (solución 1 + solución 2) para asegurar que el área de microarray está en contacto con la solución de mejora. Después de dilución, H2O2 debe utilizarse dentro de aproximadamente 30-45 días.</li>
</ol>2. nanopartículas preparación:
<ol><li>Preparar 40 nm AuNPs descrito por Bastús et al. 16 brevemente, inyectar 1 mL de precursor de4 HAuCl acuosa 25 mM en una solución hirvienda de 2,2 mM de citrato de sodio (149 mL). Espere hasta que se observa un color rojo vino. Utilice esta solución de nanopartículas como semillas para pasos de crecimiento de la semilla.</li>
	<li>A 90 ° C, inyectar 1 mL de citrato de sodio 60 mM seguido de 1 mL de 25 mM HAuCl4 en la semilla que contiene la solución. Después de 30 minutos, la reacción es completa. Repita el paso de crecimiento de la semilla cinco veces hasta que se obtienen 40 nm nanopartículas, descrito por Bastús et al. 16
</li>
	<li>Medir la absorbancia de UV-vis de la solución final de nanopartículas para determinar el tamaño de las nanopartículas. 17 alternativamente, micrográfos de electrón de la transmisión (TEM) puede ser adquiridos y utilizados para determinar el tamaño de las nanopartículas.</li>
	<li>Preparar 90 nm AgNPs descrito por Rivero et al. 18 agregar brevemente, dimethylaminoborane (DMAB) a una solución agitada vigorosamente de poli (ácido acrílico, sal del sodio) (PAA) y AgNO3. El volumen final de la solución es 50 mL y la concentración final de DMAB, PAA y AgNO3 1,6 mM, 10 mM y 3,33 mM, respectivamente. Nota: 100 nm IONPs modificados con grupos carboxilos y 50 nm SiNPs modificados con grupos carboxilos fueron comprados.</li>
	<li>Funcionalizar las AuNPs con anticuerpos, siguiendo el protocolo descrito por Puertas et al. 19 brevemente, añadir 1 mg de COOH-PEG-SH (5000 g·mol−1) a una solución de 1.2x10-9 M AuNPs (10 densidad óptica, OD). Ajustar el pH a 12 con una solución de NaOH M 4.<ol>
<li>Deje que la solución de incubar durante la noche, a temperatura ambiente (~ 22 ° C), bajo condiciones de agitación suaves.</li>
		<li>Retirar el exceso de PEG por centrifugación de la solución a 13800 x g durante 15 minutos.</li>
		<li>Resuspender el sedimento con 500 μL de agua desionizada.</li>
		<li>Incubar las AuNPs PEG modificado con 5 μmol de N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-etilcarbodiimida clorhidrato (EDC) y 7.5 μmol N-hydroxysulfosuccinimide de sal de sodio (sulfo-NHS) en el pH del MES 10 mM 6 buffer durante 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Retirar el exceso de EDC y sulfo-NHS por centrifugación de la solución a 13800 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en 500 μl de tampón de pH 6 10 mM MES y añadir 100 g·mL-1 de anticuerpo. Deje que la solución a incubar por 2 h a 37 ° C.</li>
		<li>Retirar el exceso de anticuerpo por centrifugación dos veces la solución a 13800 x g por 10 min y resuspender el precipitado en 500 μL de 10 mM de fosfato de sodio pH 7.5, 0,3 M NaCl buffer. Deje que la solución a incubar por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Quitar el anticuerpo unido inespecífico por centrifugación dos veces la solución a 13800 x g por 10 min y resuspender el precipitado en 500 μL de 1% de albúmina sérica bovina (BSA) en tampón de pH 6 10 mM MES. Incubar las muestras a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Lave el exceso de BSA por centrifugación dos veces la solución a 13800 x g por 10 min y resuspender el pellet en 500 μL de tampón de pH 6 10 mM MES.</li>
		<li>Siga los pasos 2.5.1 por 2.5.9 para la modificación de 5 M AgNPs, 0,5 mg de IONPS y 0,5 mg de SiNPs con el anticuerpo, ajustando las cantidades de EDC y sulfo-NHS por consiguiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vertical de flujo ensayos basados en papel:
<ol><li>Preparar los microarrays depositando el gradiente de concentración de la proteína G de membrana de papel de nitrocelulosa una impresora robotizada. Después de la impresión, que los microarrays seque durante la noche a temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Llevar a cabo el análisis del flujo vertical con la membrana en un portafiltros. Flujo de una solución de 8 M de AuNPs modificado de IgG con una bomba de jeringa ultra a una tasa de 1 mL·min−1. Repita este paso con una solución de 17 M IgG-modificado AgNPs, 0,1 mg·mL−1 SiNPs IgG-modificado y 0,1 mg·mL−1 IONPs IgG-modificado.</li>
	<li>Deje que los microarrays secar a temperatura ambiente (~ 22 ° C) durante 30 min y digitalizarlos en un escáner con una resolución de 4800 dpi. Guardar las imágenes como archivos TIFF de 24 bits de color.</li>
</ol>4. referencia comercial cristal-ensayos:
<ol><li>Incube los portaobjetos de vidrio dos para 120 min para la detección de componentes alergénicos con 4 muestras de suero humano diferentes a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aclare las micromatrices con agua desionizada.</li>
	<li>Incubar una diapositiva con un anticuerpo de IgE anti humano conjugado fluorescente a temperatura ambiente (~ 22 ° C) durante 30 minutos incubar la segunda diapositiva con anti-human IgE Anticuerpos modificados AuNPs durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aclare las micromatrices con agua desionizada.</li>
	<li>Medir la intensidad de fluorescencia de los microchips que se incubaron con el anticuerpo de IgE humano fluorescente con un aparato de escaneo láser. Digitalizar el microarray que se incubó con el anti-human IgE AuNPs anticuerpo modificado con un escáner de sobremesa para adquisición de señales colorimétricas.</li>
	<li>Después de la digitalización, incubar el microarray con la solución de la mejora en la temperatura (~ 22° C) durante 5 minutos.</li>
	<li>Enjuagar el sensor con agua desionizada y deje que se seque durante 10 minutos a temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Digitalizar el microarray con un escáner de sobremesa con una resolución de 4800 dpi para adquisición de señales colorimétricas. Guardar las imágenes como en escala de grises 16-bit archivos TIFF.</li>
</ol>5. microarrays incubación con solución de mejora:
<ol><li>Mezcla preparada de antemano la misma cantidad de solución 1 y 2 o mezclarlos directamente sobre la superficie del sensor y asegurar que el área de interés sobre el microarray se cubre con la mezcla de solución.</li>
	<li>Deje que el sensor de incubar a temperatura ambiente con la solución de mejora para arriba a 5 minutos de incubación más largo el tiempo puede producir sensibilidad mejorado así como mayor relación señal/ruido, especialmente para los microarrays en papel.</li>
	<li>Lavar el microarray sumergiendo en agua desionizada una vez durante 5 s. dejar que se seque a temperatura ambiente. Nota: El tiempo de la etapa de secado depende del material de los microarrays. Para un microarray basados en papel, el paso de secado requiere aproximadamente 30 min. Para un microarray basados en vidrio, el paso de secado requiere aproximadamente 5-10 minutos.</li>
</ol>6. proyección de imagen de análisis:
<ol><li>Analizar las intensidades de fluorescencia con la herramienta de software. Considerar todos los resultados que son igual o mayor que 0,3 unidades de la estandarización Isac (ISU), siguiendo las instrucciones de uso (DfU) del fabricante del sensor.</li>
	<li>Analizar las intensidades colorimétricas utilizando una herramienta de software. Invertir los archivos de imagen, medir la intensidad de cada punto y calcular la intensidad del pixel media. Utilizar los valores de los puntos por triplicado para calcular el valor de la señal final como una media de las tres intensidades de píxeles de punto medio.</li>
</ol>

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<li>Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetically+controlled+seeded+growth+synthesis+of+citrate-stabilized+gold+nanoparticles+of+up+to+200+nm%3A+size+focusing+versus+Ostwald+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening.</a> Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).</li>
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<li>Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+optimization+of+gold+nanoparticle-based+silver-enhanced+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la actualidad, técnicas de realce de señal para ensayos con detección basada en nanoprobe son ya sea de base enzimática12, requieren un segundo conjunto de nanopartículas a destino la detección crónicas21 o, en el caso de técnicas de tinción, se limitan a el uso de AuNPs o AgNPs como sondas de detección. 22 aquí, un método simple, rápido y libre de enzima se describe para el realce de la señal del nanoprobe detección-ensayos. Con este método, fue posible mejorar la señal colorimétrica proporcionada por 4 tipos de crónicas: AuNPs, AgNPs, IONPs y SiNPs.
El factor de amplificación observada para cada conjunto de crónicas fue de 100-fold, excepto el SiNPs donde no fue posible debido a la falta de señales de mejora de la cuantificación del factor de mejora. Este factor mejora sugiere que la eficacia del protocolo es similar en todos los tipos de crónicas. Por otra parte, cuando el protocolo de realce se llevó a cabo sobre un soporte de papel donde se imprime una serie de diluciones de una suspensión stock de AuNPs, se observó un factor de 10000-fold amplificación. Anterior a la mejora, los puntos visibles con el menor número de AuNPs fueron donde se imprimieron aproximadamente 10000 nanopartículas, después mejora las manchas que nanopartículas de menos de 10 llegó a ser visibles. 20
Las condiciones establecidas para el protocolo de mejora aquí presentado han permitido tomar ventaja de la reducción de Au3 + Au0 para mejorar la señal, manteniendo el ruido de fondo a un mínimo. La mejora puede realizarse justo después de que el ensayo se realiza, así como microarrays que han sido almacenadas por hasta varios meses después el ensayo se realizó. La solución de mejora consiste en una mezcla 1:1 de solución 1 y 2. Ambas soluciones pueden ser previamente mezclados o directamente mezclados cuando se pipetea en el microarray. La diferencia entre la mezcla o mezcla directa afecta sólo la vida útil de la solución de mejora. Cuando premezclado la vida útil es de 5 a 7 días, aumentando a 30-45 días si no premezclada.
Análisis de los resultados ha demostrado que el método de mejora no interfiera con el análisis cuantitativo del biosensor. Una correlación lineal entre la intensidad observadas y la concentración del analito se mantuvo (tabla 1). Los datos obtenidos para 4 muestras clínicas previamente caracterizadas mediante el inmunoensayo de microarray de componente alérgeno basados en vidrio, con detección de fluorescencia estándar y detección colorimétrica, demostraron una buena concordancia entre los dos métodos de detección. Comparación de la intensidad de fluorescencia media (IFM) y la intensidad media de colorimétrica (MCI), una media R2 = 0.79 +-0.08 se obtuvo cuando los datos se registran 10 en ambos ejes. Este experimento demostró que el método de mejora puede aplicarse a un kit comercial, si utiliza el Nanosondas para detección o puede ser adaptado para la detección de nanoprobe.
La eficacia del método de mejora se basa en dos aspectos críticos. Es importante asegurar que la mezcla de la solución 1 y la solución 2 es homogénea. Sin una mezcla homogénea, el sensor estará en contacto con fracciones de la solución de mejora donde la solución 1 o 2 es predominante en relación con el otro. Reducirá la eficacia de la reducción de Au3 + Au0, dañando así la eficacia de la mejora. También es importante que toda la zona de interés de los microarrays en contacto con la solución de mejora durante el período de incubación.
Para lograr el realce ultrasensible de una señal, se requerirá un tiempo de incubación (aproximadamente 5 min) con la solución de mejora. Para evitar el desarrollo de ruido de fondo que puede interferir con la adquisición de la señal, la superficie de microarray debe estar previamente bloqueados (por ejemplo, BSA, PEG) para evitar la rápida deposición inespecífica de Au0 y consecuente formación de oro capa.
Una limitación al método del realce es la eficacia intrínseca del ensayo. El ensayo requiere tener controles positivos y negativos en cuanto a garantizar la mejora de la señal puede ser atribuido a los resultados positivos de verdad. Si hay una interacción no específica de las crónicas con el objetivo, las señales adquirieron después de mejora no será válida.
Otras técnicas de mejora son en base a cualquier agregación de nanopartículas o coloración de las nanopartículas con un material que permite la adquisición de señal mejorada. Promoviendo la recolección de la cantidad de nanopartículas en el sitio de detección, la adquisición de la señal será posible ya sea visualmente o medidas de UV-Vis. 5 estas técnicas de realce de la señal dependen de un sistema de detección de dos etapas, la detección inicial del analito de interés y una segunda etapa donde se requiere que el reportero se unen a la construcción de detección inicial. Tales estrategias carecen de universalidad debido a la exigencia de optimización de protocolo de mejora específicos para cada tipo de ensayo.
Las técnicas de mejora tinción, como la plata, tanto la coloración como el protocolo que aquí se presenta, permiten la mejora directa de las construcciones de detección de señal. Sin embargo, a diferencia del protocolo que se muestra aquí, plata ha sólo ha demostrado que aplicar a las AuNPs o AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
La aplicabilidad de este método es probable que podría abarcar cualquier ensayo que utiliza AuNPs, AgNPs, IONPs o SiNPs como agentes de detección. Trabajo se lleva a cabo para estudiar la aplicación del método de sensores consisten en otros materiales.

El uso de nanomateriales nanopartículas de oro (AuNPs) como nanopartículas de óxido de hierro (IONPs) ha permitido a las aplicaciones en biodetección con versatilidad y mejoras en la sensibilidad. 1 la gran cantidad de métodos desarrollados para la decoración de la superficie de las nanopartículas con diferentes ligandos, aprovechar de su alta superficie y volumen, han permitido el diseño de los sensores con sensibilidad mejorada. 2 sin embargo, una herramienta de biodetección depende el número de crónicas necesaria para lograr una señal detectable. Por ejemplo, en el caso de 40 nm AuNPs, para adquirir una señal a través de espectroscopía UV-vis, aproximadamente 90 × 106 crónicas es necesaria para detectar eficazmente el objetivo de interés. 3 esta limitación de densidad nanoprobe puede eludirse mediante el uso de amplificación de la señal. Tales estrategias4 puede basarse en la agregación entre partículas o aglomeración, donde se aumenta la densidad de Nanosondas inicial por acumular una segunda serie de crónicas sobre la primera. 5 aumentar el número de nanopartículas en un lugar determinado en una superficie de sensor permite visual o adquisición de la señal de UV-vis. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo se vincularán intrínsecamente a la capacidad de segmentación del segundo sistema de nanopartículas hacia el conjunto inicial de crónicas. Otras estrategias se basan en la tinción de crónicas ya sea oro y plata. 6 , 7 la tinción se logra a través de la reducción de los iones de plata sobre la superficie de las nanopartículas, lo que permite una visual o detección UV-vis. 8 estos métodos mejoran la señal existente de oro o plata crónicas por potenciar el plasmón de resonancia superficial de la señal, no dependiendo de eventos dirigidos a secundaria como en métodos de aglomeración entre partículas. Sin embargo, métodos de tinción de plata sólo han divulgado con uso de crónicas de oro o plata. 8 , 9
En 2005, Zayats et al. 10 informó de la reducción de los iones de la Au en la superficie de oro Nanosondas para aumentar la señal de resonancia de plasmón superficial. En este trabajo dependiente de la enzima, el peróxido de hidrógeno se generó por catálisis de oxidasa de glucosa y, junto con cloruro de cetiltrimetilamonio permitida la reducción del ácido chloroauric.
Más recientemente Wang et al. informó un método de mejora donde se produce una capa de oro sobre la superficie de crónicas existentes. 11 estas Nanosondas ampliadas muestran actividad catalítica de la peroxidasa-como contra el sustrato 3 ', 5, 5-tetrametilbencidina (TMB) que permite la visualización de un color azul brillante al ojo desnudo.
Stevens et al. reportado el desarrollo de un ensayo basado en ELISA plasmónica. 12 después de la detección de un antígeno prostático específico (PSA) a través de una estrategia tradicional de ELISA, un anticuerpo secundario marcado con la catalasa se incubó con el sensor después de que el sensor se sumerge en una solución que contiene peróxido de hidrógeno y ácido chloroauric. La presencia de la catalasa-modificado de anticuerpo secundario (resultado positivo) podría promover el consumo de peróxido de hidrógeno, reducción Reducción ácido chloroauric y rendimiento quasi-esférico monodispersados AuNPs con un color rojo. La ausencia de anticuerpos modificados catalasa (resultado negativo) permitió la concentración de peróxido de hidrógeno que permanecen intactas, promoviendo así la reducción de la chloroauric rápida y rendimiento AuNPs con morfologías mal responsables de un color azul/púrpura . La concentración de peróxido de hidrógeno, determinado por la actividad de catalasa, fue demostrada para ser correlacionado con la concentración del analito de interés. La necesidad de un anticuerpo secundario modificado de catalasa y el control de las condiciones de la actividad catalítica son dos factores que dificultan la universalidad de este método. Por otra parte, la formación de racimos de oro, independientes de las AuNPs existentes, puede presentar problemas de ruido de fondo a la estrategia de amplificación.
Las técnicas antes mencionadas, como así otros13,14,15, han hecho posible para biosensores basados en nanoprobe alcanzar límites de detección a la par con las técnicas tradicionales.
Aquí, se demuestra un método de mejora de oro novela, donde se amplifica la señal de un nanoprobe existente por potenciar o la introducción de una señal de resonancia de plasmón superficial. Después de la detección se lleva a cabo con el uso de oro, plata, sílice u óxido de hierro nanopartículas, el sensor se le permite incubar con una solución de una mezcla de peróxido de hidrógeno y ácido chloroauric en 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido buffer de pH 6 (MES). Se optimizaron las concentraciones de los componentes en la solución de mejora para favorecer la deposición de Au0 en la superficie de crónicas existentes. Para todos estudiaron nanoprobe tipos, es decir. AuNPs, nanopartículas de plata (AgNPs), nanopartículas de sílice (SiNPs) y IONPs, la formación de una capa mal rendido o había aumentado la dispersión de la luz que dio lugar a una señal visible perceptible o mayor. Se logró un aumento de señal con un factor de amplificación 100-fold para crónicas en papel y microarrays de vidrio y el proceso toma menos de 5 minutos para la adquisición de una señal. La adquisición de la señal puede hacerse por el ojo desnudo, espectroscopía UV-vis o proyección de imagen herramientas de gama bajos como una cámara digital o un escáner de sobremesa. Por otra parte, se demostró que el presente Protocolo de realce se puede aplicar fácilmente en un análisis diagnóstico de alergias disponibles en el mercado sin necesidad de optimización específico.

<table><tbody><tr><td>Ácido cloroáurico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilaminoborano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Poli(ácido acrílico, sal de sodio)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm nanopartículas magnéticas</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm nanopartículas de sílice</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&nbsp;</td><td>Polímero RAPP</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&nbsp; CLORHIDRATO</td><td></td></tr><tr><td>DE METILCARBODIIMIDA DE EMD N-(3-3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-Hidroxisulfosuccinimida sal sódica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)etanosulfónico hidrato de ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>VWR&nbsp;</td><td>422351S</td> Protein G Thermo Scientific 21193 Membrana de <td></td></tr><tr><td>papel nitrocelulósica</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 Impresora robótica</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portafiltros</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Bomba de ultrajeringa</td><td>Harvard</td> Escáner de cama plana CannonScan <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano IgE anti-humano anti-IgE AuNPs&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escaneo láser LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escáner de sobremesa Escáner de imágenes Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cristal ImmunoCAP ISAC sIgE 112 Thermofisher</td><td></td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo IgE humano conjugado con fluorescencia&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de imágenes de microarrays Phadia MIA 1.2.4&nbsp;</td><td>Termopescador</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mejora de señal rápida nanoprobe por síntesis de nanopartículas de oro in situ

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Puede habilitar el uso de crónicas tales como oro, plata, sílice o nanopartículas de óxido de hierro como reactivos de detección en los ensayos de bioanalítica alta sensibilidad y lectura colorimétrica conveniente. Sin embargo, altas densidades de nanopartículas típicamente son necesarios para la detección. Los protocolos de mejora disponible basada en síntesis son o nanopartículas limitadas al oro y plata o se basan en la optimización y control enzimático preciso. Aquí, presentamos un protocolo para mejorar la lectura colorimétrica de oro, plata, sílice y óxido de hierro crónicas. Se observó que la señal colorimétrica puede mejorarse hasta un 10000-fold factor. La base para las estrategias de mejora de la señal es la reducción química de Au3 + Au0. Hay varias reacciones químicas que permiten la reducción de Au3 + Au0. En el protocolo, se utilizan buffers y H2O2 de buena y es posible favorecer la deposición de Au0 en la superficie de las crónicas existentes, en detrimento de la formación de nanopartículas de oro nuevo. El protocolo consiste en la incubación de los microarrays con una solución de ácido chloroauric y H2O2 en 2-(N-morfolino) tampón de pH ácido 6 (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido siguiendo el ensayo de detección basada en nanoprobe. La solución de mejora puede aplicarse a sensores basados en vidrio y papel. Además, puede utilizarse en inmunoensayos disponibles comercialmente según lo demostrado por la aplicación del método a un microarray de alergenos comerciales. El desarrollo de señal requiere menos de 5 minutos de incubación con la solución de mejora y la lectura puede evaluarse por el ojo desnudo o dispositivos de adquisición de imagen de gama baja como una cámara digital o un escáner de sobremesa.

Después de un ensayo se lleva a cabo, usando crónicas como agentes de detección, área de detección del sensor puede equiparse con Nanosondas (figura 1a). Si el número de crónicas es por debajo del límite para una detección visual, la detección del analito será, inicialmente, considerada negativa. Utilizando el protocolo que presentamos (figura 1b), la señal de las crónicas se potencia mediante la introducción de una capa mal definida de Au (figura 1c).
Un inmunoensayo en papel diseñado para la detección de la proteína G se llevó a cabo en cuanto a mostrar la eficacia del Protocolo de realce (figura 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs y IONPs fueron modificadas con los anticuerpos de IgG y utilizados y agentes de detección. Microarrays de papel fueron preparados en cuanto a tener un gradiente de un número de moléculas de proteína G por punto.
Después de que el ensayo se llevó a cabo, se observó que AuNPs modificados (IgG-AuNPs) fueron capaces de detectar tan bajo como 2 moléculas de5 × 10 por punto (figura 2a) IgG, IgG AgNPs modificados (IgG-AgNPs) fueron capaces de detectar tan bajo como 2 × 104 moléculas por punto (figura 2c), IgG modificado IONPs (IgG-IONPs) fueron capaces de detectar tan bajo como 2 × 107 moléculas por punto (figura 2e) y modificado de IgG no fueron capaces de proporcionar una señal visual ( SiNPs (IgG-SiNPs) Figura 2g).
Por incubar los microarrays con la solución de mejora, fue posible incrementar la señal de 100-fold en todos los tipos de nanopartículas utilizados. En el caso de SiNPs, la solución mejora hizo posible observar una señal donde no se observó ninguna señal visual sin la solución de mejora (figura 2b, 2d, 2f y 2 h).
Se evaluó la posibilidad de aplicación del método a un inmunoensayo comercial existente. La mejora se llevó a cabo en un inmunoensayo de microarray componente alérgeno en base de vidrio. Un conjunto de 4 validado y caracteriza el suero con el microarray se evaluaron muestras de pacientes alérgicos (muestras fueron designadas como a, b, c y d). La detección fluorométrica estándar de este ensayo se comparó la tinción con anti-IgE marcado AuNPs seguido por la mejora de la señal (figura 3). Antes de la mejora, ningunos puntos fueron detectados en los microarreglos donde se llevó a cabo la detección con anti-IgE marcado AuNPs. Después de realce, varios puntos son visibles por el ojo desnudo y su intensidad fue registrada por digitalización de imagen (figura 3). Con la detección de la fluorescencia, una variedad de lugares fueron detectados (figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> Figura 1 . Ilustración de los pasos un microspot sufre de la detección del analito a la señal mejorada. (a) dos anticuerpos modificados crónicas después de la detección de un analito inmovilizado en un microspot, (b) incubación de microarray con el protocolo de realce y semilla-crecimiento subsecuente de las Nanosondas anticuerpo modificado y () microspot c) donde el tamaño de las Nanosondas aumentó después de incubar 5 min con la solución de mejora. Esta figura ha sido dapted de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> Figura 2 . Imagen digitalizada de los microarrays para la detección de la proteína G. A la izquierda de cada microarray son el microspots observados antes de la mejora de la detección con (un) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs ygSiNPs de IgG. A la derecha de cada microarray son el microspots después de realce (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs y (h) IgG-SiNPs. Cada concentración de la proteína G se depositó en el microarray en triplicado. Un cálculo de la cantidad de proteína que g se hizo basada en la concentración de la proteína impreso en cada microspot. Esta figura ha sido adaptada de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> Figura 3 . Correlación entre la intensidad fluorescente y colorimétrico intensidad obtenido para el análisis llevado a cabo con el análisis diagnóstico de alergia comercial. Significa intensidad de fluorescencia (IMF) y significa intensidad colorimétrico (MCI) de medida para la detección de alérgenos en las muestras a, b, c y d. inserciones son los datos de registro 10 transformado en los intervalos donde se observó una correlación lineal entre ambos métodos. La intensidad del microspots observado para la detección basada en el anticuerpo modificado fluoróforo (fluoróforo-Ab) es la emisión de fluorescencia. El brillo de los microspots observado para la detección basada en el ensayo de AuNPs Ab se obtuvo después de digitalizar el microarray y de invertir la imagen con software de imágenes. Microarrays están diseñados para tener triplicados vertical con controles positivos para la detección de fluorescencia en la parte inferior derecha. Las otras tres esquinas se utilizan para la evaluación del software. Se analizaron las imágenes en escala de grises de 16 bits. Esta figura ha sido adaptada de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Previa mejora de R2</td>
			<td>R2 después de la mejora</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNPs igG</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>AgNPs igG</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IONPs igG</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SiNPs igG</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. R2 valores para detección de proteínas G, antes y después de la mejora, utilizando diversos sistemas de nanopartículas. Los valores de R2 se obtuvieron tras correlacionar la intensidad de las manchas con la concentración del analito medido.

En este trabajo se presenta un protocolo para la mejora de la señal de biosensores basados en nanoprobe. El protocolo se basa en la reducción del ácido chloroauric sobre la superficie de crónicas ya existentes que consisten en oro, plata, sílice u óxido de hierro nanopartículas.

Mejora de señal rápida Nanoprobe por síntesis de nanopartículas de oro In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

El objetivo general de este procedimiento es amplificar las señales de las sondas basadas en nanopartículas en ensayos realizados en soportes de papel o vidrio. Con este método, puede adquirir una señal colorimétrica para manchas que contienen tan solo 10 nanopartículas. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad.Se puede aplicar sin grandes modificaciones a diferentes nanopartículas en papel, vidrio y, potencialmente, otros soportes. Para comenzar el procedimiento, prepare al menos 10 mililitros de una solución MES de 10 milimolares en agua desionizada. Ajuste el pH de la solución a seis con una solución de hidróxido de sodio de cuatro molares.A continuación, combine un mililitro de una suspensión de 1,2 por 10 a menos noveno molar de nanopartículas de oro de 40 nanómetros con un miligramo de alfa mercapto omega carboxy PEG y vórtice la mezcla. Ajuste el pH de la mezcla a 12 con una solución de hidróxido de sodio de cuatro molares. Revuelva suavemente la mezcla a temperatura ambiente durante la noche.A continuación, centrifugar la mezcla a 3.800 veces G durante 15 minutos y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de nanopartículas de oro modificado con PEG en 500 microlitros de agua desionizada mediante un pipeteo suave. A continuación, disuelva cinco micromoles de EDC en 250 microlitros del tampón MES de pH seis milimolares.Disuelva 7,5 micromoles de sulfo-NHS en otros 250 microlitros del tampón MES. Combine estas soluciones con las nanopartículas de oro modificadas con PEG e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Centrifugar la mezcla durante cinco minutos y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros del tampón MES. Añadir a la suspensión una cantidad suficiente de anticuerpo IgG para una concentración de anticuerpos de 100 picogramos por mililitro. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante dos horas.Centrifugar la mezcla durante 10 minutos y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros del tampón MES y repita la centrifugación. A continuación, resuspender el pellet en 500 microlitros de un tampón de pH 7,5 de fosfato sódico de 10 milimolares y cloruro de sodio 0,3 molar en agua desionizada.Incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Centrifuga la mezcla durante 10 minutos dos veces, como se ha descrito anteriormente. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de 1%BSA en tampón MES de pH seis milimolares e incube la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche.Centrifuga la mezcla durante 10 minutos dos veces. Finalmente, resuspender el pellet en 500 microlitros de tampón MES para obtener las nanopartículas de oro modificadas con IgG. Utilice una impresora robótica para depositar microarrays de un gradiente de concentración de proteína G en membranas de nitrocelulosa.A continuación, cargue un microarray en un portafiltros de acero inoxidable de un tamaño adecuado. Conecte una jeringa que contenga una suspensión de ocho picomolares de nanopartículas de oro modificado con IgG a la entrada del portafiltros. Monte la jeringa en una bomba de jeringa.Coloque un tubo de 50 mililitros para recoger el flujo de salida del portafiltros. Luego, haga fluir la suspensión a través del portafiltros a un mililitro por minuto. Después, deje que el microarray se seque durante 30 minutos a temperatura ambiente.Limpie y seque el portafiltros con agua y papel de filtro. Escanee el microarray seco en un escáner plano a 4.800 ppp y guarde la imagen como un archivo TIFF en color de 24 bits. A continuación, prepare una solución de ácido cloroáurico de cinco milimolares y una solución de peróxido de hidrógeno de 1,027 molares en un tampón MES de pH seis milimolares.Para premezclar la solución de mejora, coloque valores iguales de las soluciones de ácido cloroáurico y peróxido de hidrógeno en un tubo de microcentrífuga y mezcle bien las soluciones. Aplique la solución de mejora premezclada a la superficie del sensor de microarray. Alternativamente, aplique volúmenes iguales de las soluciones de ácido cloroáurico y peróxido de hidrógeno a la superficie del sensor y mézclelos bien directamente sobre el sensor.Incube el sensor con la solución de mejora durante un máximo de cinco minutos, luego sumerja el microarray en agua desionizada durante cinco segundos para enjuagar la solución de mejora. Deje que el microarray se seque al aire a temperatura ambiente. Repita este proceso para cada micromatriz que se vaya a mejorar.Escanee los microarrays mejorados y guarde las imágenes. En un inmunoensayo estándar basado en papel, las nanopartículas de oro, plata y óxido de hierro modificadas con IgG detectaron concentraciones de proteína G en dos veces 10 a la quinta, dos veces 10 a la cuarta y dos veces 10 a la séptima moléculas por punto, respectivamente. No se observó ninguna señal visual de las nanopartículas de silicio modificadas con IgG.La incubación de los microarrays en solución de mejora dio como resultado un aumento de 100 veces la señal en las nanopartículas de oro, plata y óxido de hierro. En el caso de las nanopartículas de silicio, esta mejora permitió observar una señal visual. Esta mejora se aplicó a un inmunoensayo comercial de microarrays de componentes de alérgenos a base de vidrio de cuatro muestras de suero humano.La tinción con nanopartículas de oro marcadas con anti-IgE y la mejora de la señal tuvieron resultados comparables a los del ensayo fluorométrico estándar. La correlación lineal media entre la intensidad media de fluorescencia y la intensidad colorimétrica media fue de 0,79. Una vez aprendida, esta técnica se puede realizar en menos de 10 minutos si se realiza correctamente.

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