Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

El objetivo general de este protocolo es generar copias de alta calidad de la biblioteca de mutantes de transposones ordenados y no redundantes de la cepa PA14 de Pseudomonas aeruginosa, denominada conjunto PA14NR. Este protocolo preserva la integridad del conjunto PA14NR durante la replicación, generando copias de alta calidad de esta biblioteca. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona una descripción detallada de todos los pasos involucrados en la replicación de bibliotecas, el control de calidad y el almacenamiento adecuado de mutantes individuales.

Aunque este protocolo fue diseñado para replicar el conjunto P14NR, se puede adaptar para replicar otras bibliotecas bacterianas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al riesgo de contaminación durante el proceso de replicación. Por lo tanto, este protocolo proporciona instrucciones detalladas paso a paso para reducir ese riesgo.

Nuestro laboratorio distribuye el set PA14NR a la comunidad científica mundial. Y recomendamos que las bibliotecas sean replicadas por el usuario final. Para proporcionar orientación, ofrecemos un protocolo que detalla cómo generar copias de alta calidad de la biblioteca.

La demostración visual de este protocolo es fundamental, especialmente los pasos diseñados para evitar la contaminación cruzada. Para la autoprotección, así como para la protección de los cultivos bacterianos, siempre se debe usar una bata de laboratorio, guantes y una mascarilla cuando se manipule la biblioteca de mutantes de inserción de transposones no redundantes de la cepa PA14 de P aeruginosa, designada como conjunto PA14NR. Prepare placas de agar LB vertiendo aproximadamente 60 mililitros de agar LB fundido en placas rectangulares.

Seque las placas en una campana estéril durante aproximadamente una hora antes de usarlas. Cree un campo estéril con un quemador bunsen sobre una mesa de trabajo con etanol. Y configure los contenedores con soluciones adecuadas para la esterilización de los pines del replicador.

Retire una placa maestra PA14NR del congelador a menos 80 grados centígrados y colóquela sobre hielo seco en una bandeja de hielo de 4 litros. Tome la placa maestra de 96 pocillos para replicarla del hielo seco y colóquela en el banco para permitir una breve descongelación. Alinee la placa maestra y la placa de agar con la coordenada A1 de ambas placas en la esquina superior izquierda.

Marque la posición de la coordenada A1 en la placa de agar rectangular. Para esterilizar los pines del replicador, sumerja los pines en 250 mililitros de hipoclorito de sodio al 0,3 al 0,5% durante 30 segundos. Golpee ligeramente el replicador para eliminar el exceso de líquido y sumerja los pines en 250 mililitros de agua ultrapura estéril durante 10 segundos, seguidos de 250 mililitros de etanol al 70% durante 30 segundos y 250 mililitros de etanol al 95% durante dos minutos.

Esteriliza la llama de los pines del replicador sosteniendo el replicador perpendicularmente a la llama del quemador bunsen, acercándote lentamente a la llama hasta que el etanol se encienda y luego retirándolo inmediatamente de la llama. La llama se extinguirá una vez que se queme todo el etanol. Enfríe los alfileres fijándolos a una placa rectangular sin usar que contenga agar LB estéril durante 30 segundos.

Mientras se enfrían los pines del replicador, caliente brevemente el sello de aluminio de la placa maestra del juego PA14NR con la mano y luego despéguelo con cuidado, asegurándose de que el sello no vuelva a tocar la placa. Use pinzas para despegar cualquier remanente del sello de aluminio. Inserte las clavijas del replicador en la placa maestra, empujando y balanceando suavemente el replicador en las cuatro direcciones para asegurarse de que las clavijas entren en contacto con los cultivos bacterianos congelados en cada uno de los 96 pocillos.

Preste especial atención a los pocillos ubicados en el borde exterior de la placa empujando los pines del replicador contra los cultivos congelados en los pocillos ubicados en el borde de la placa. Coloque suavemente los pines del replicador sobre la superficie de las placas de agar. Mueve el replicador con un ligero movimiento circular para formar muchos céspedes de aproximadamente cuatro a cinco milímetros por cada cepa mutante.

Selle la placa maestra del juego PA14NR con un nuevo sello de aluminio estéril. Use un rodillo de placa para asegurarse de que cada pocillo y los bordes de la placa estén completamente sellados. Regrese la placa maestra de 96 pocillos a hielo seco.

Después de manipular el juego PA14NR, limpie todas las superficies de trabajo con etanol al 70%. Transfiera la placa de agar replicada a una incubadora a 37 grados centígrados e incube durante la noche. Antes de comenzar este procedimiento, asegúrese de que la campana de flujo laminar esté libre de equipos innecesarios y encienda el soplador de la campana durante un mínimo de 10 minutos.

Limpie las superficies del capó y cualquier elemento colocado en el capó con etanol al 70%. Usando una pipeta electrónica de 12 canales de 50 a 1200 microlitros, llene cada pocillo de un bloque de pocillos de 12 mililitros de profundidad con 525 microlitros de caldo líquido LB que contenga los antibióticos adecuados. A continuación, selle el bloque de pozo profundo antes de retirarlo de la campana de flujo laminar.

A continuación, transfiera el bloque de pocillo profundo lleno de medios a una mesa de trabajo limpia con etanol. Cree un campo estéril con un quemador bunsen en la mesa de trabajo y configure los contenedores con soluciones adecuadas para la esterilización de los pines del replicador. Sumerja los pines del replicador en cada solución como se demostró anteriormente.

Esteriliza con llama los pines del replicador. A continuación, enfríe los alfileres fijándolos en un plato rectangular sin usar que contenga agar LB durante 30 segundos. Coloque suavemente los pines del replicador en la placa de agar que contiene cepas mutantes crecidas y verifique que los pines estén en contacto con los 96 mutantes en la placa de agar.

Luego sumerja los alfileres en los pozos profundos que contienen caldo líquido LB durante cinco a 10 segundos. Evite tocar los lados de los pozos con los alfileres. Selle el bloque de pozos profundos con una membrana de sellado estéril y transpirable.

Utilice un rodillo de placa para asegurarse de que cada pozo individual esté debidamente sellado. Limpie todas las superficies de trabajo con etanol al 70% después de manipular el juego PA14NR. Cultive los cultivos líquidos inoculados en un agitador de alta velocidad a 37 grados Celsius y 950 rpm durante 15 a 16 horas.

Comience limpiando la campana de flujo laminar y encendiendo el soplador de la campana durante un mínimo de 10 minutos. Limpie todas las superficies del capó y cualquier artículo colocado en el capó con etanol al 70%. Retire las placas de 96 pocillos de la envoltura de plástico.

Despegue la etiqueta de la placa de cada placa y colóquela a lo largo del borde de la placa más cercano a los pocillos A1 a H1 de la placa de destino. Levante ligeramente la tapa de la placa de destino y coloque la etiqueta en el borde inferior para mostrar la etiqueta cuando la placa esté cubierta con una tapa. Retire el bloque de pozo profundo del agitador de alta velocidad y transfiera el bloque a la campana de flujo laminar estéril.

Retire con cuidado la membrana de sellado transpirable y reemplácela con un sello de aluminio. Gire el bloque de pozo profundo a muy baja velocidad para recoger la condensación. Dado que la transferencia de los cultivos a las placas de destino presenta el mayor riesgo de posible contaminación entre pocillos, es fundamental seguir cuidadosamente todos los procedimientos para mantener la esterilidad.

Regrese el bloque de pozo profundo a la campana estéril. Usando una pipeta electrónica de 12 canales de 50 a 1200 microlitros y puntas filtradas estériles, agregue 525 microlitros de mezcla de caldo líquido de glicerol LB a cada pocillo. Mezcle pipeteando suavemente 300 microlitros hacia arriba y hacia abajo tres veces con una pipeta electrónica.

Toque las puntas a los lados de los pocillos, antes de inyectar las puntas para evitar el goteo. Vuelva a cargar la pipeta con nuevas puntas filtradas estériles y llene la siguiente fila de pocillos con la mezcla de caldo líquido de glicerol LB. Después de que todos los pocillos se hayan llenado con la mezcla de caldo líquido de glicerol LB, use la pipeta electrónica de 12 canales y las puntas filtradas para extraer 900 microlitros de mezcla de cultivo mutante de glicerol de cada fila del bloque de pocillos profundos, y dispense 150 microlitros en los pocillos de la fila correspondiente en las placas de destino para generar seis copias de la placa de biblioteca.

Use el sello de aluminio estéril para cubrir cada placa de destino de 96 pocillos, y use un rodillo de placa para sellar completamente los bordes de la placa y todos los pocillos. Asegúrese de no cubrir el identificador de la etiqueta con el sello de aluminio. Retire las placas selladas de la campana y colóquelas sobre una superficie plana y uniforme en un congelador a menos 80 grados centígrados.

Limpie todas las superficies de trabajo con etanol al 70% después de manipular la biblioteca. Utilizando el protocolo demostrado en este video, se replicaron 12 copias del conjunto de PA14NR, incluidas las placas de control, que consisten en pocillos de tipo PA14 inoculados y no inoculados intercalados en un patrón preestablecido. Las placas de control se inspeccionaron visualmente después de la replicación en placas de agar LB para garantizar la presencia de los patrones de crecimiento esperados.

Se seleccionaron aleatoriamente 38 cepas mutantes de una de las copias recién generadas del conjunto PA14NR, y se realizó una amplificación por PCR utilizando cebadores arbitrarios para confirmar la identidad de los mutantes transposónicos. La secuenciación posterior de los fragmentos de ADN confirmó la identidad mutante de 35 de los 38 mutantes analizados. Una vez dominada, la replicación de toda la biblioteca tarda aproximadamente 80 horas.

Al utilizar este protocolo, es importante tener en cuenta la esterilidad del área de trabajo en todo momento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar copias de alta calidad del conjunto P14NR u otras bibliotecas bacterianas. No olvide que trabajar con Pseudomonas puede ser peligroso y siempre se debe usar equipo de protección personal mientras se realiza este protocolo.

Este protocolo preserva la biblioteca de mutantes no redundantes de Pseudomonas aeruginosa PA14, que sigue siendo un recurso importante, no solo para el cribado de alto rendimiento, sino también como fuente de mutaciones individuales en la mayoría de los genes de Pseudomonas aeruginosa.