Name: Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprende a replicar la biblioteca de mutantes de transposones PA14NR de Pseudomonas aeruginosa preservando su integridad y minimizando la contaminación. Este protocolo detallado permite generar copias de alta calidad para investigación microbiológica.

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Nos gustaría agradecer a Lisa Philpotts de la Biblioteca Virtual de Treadwell de MGH para su orientación en la búsqueda de la base de datos. Este trabajo fue financiado por la Fundación de la Fibrosis Quística (YONKER16G0 y HURLEY16G0) y NIH NIAID (HBP y ADE: R01 A1095338).

Los autores no divulgan conflictos de intereses financieros. Eliana Drenkard y Frederick Ausubel participan en la creación de la biblioteca mutante PA14 transposon no redundante. Bryan Hurley y Lael Yonker actualmente de la casa y distribuyen la biblioteca mutante como parte del Departamento de Pediatría en el Hospital General de Massachusetts.

El P. aeruginosa PA14NR se encuentra un recurso valioso para la comunidad científica. Según el conjunto de datos marzo de 2017 de base de datos de indicadores fundamentales de la ciencia Clarivate Analytics, Liberati et al. (2006) ocupa el puesto 37, que describe la construcción del Set del PA14NR, en el 1% de las publicaciones de Microbiología. Google Scholar reporta más de 600 citas de Liberati et al. (2006) el manuscrito original a partir de agosto de 2017. L...

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa fenotípicamente y genotípicamente diversa y adaptable presente en suelo, agua y entornos más humanos, así como la microflora de la piel. Comparado a muchas especies bacterianas, p. aeruginosa tiene un genoma relativamente grande de 5.5-7 Mbp con alta G + C contenido (65-67%). Además, una proporción significativa de sus genes están implicada en la adaptación metabólica y forman parte de redes de regulación, permitiendo una gran flexibilidad en respuesta a estrés ambiental1. P. aeruginosa expresa una gran cantidad de factores de virulencia, exhibe la propensión de forma biofilms, posee la capacidad de coordinar las respuestas a través de múltiples quórum sensing vías y muestra una notable capacidad para desarrollar resistencia a los antibióticos y tolerancia2,3,4,5,6,7,8. Estos atributos presentan desafíos significativos para el tratamiento de infecciones causadas por p. aeruginosa.
Crónica infecciones de p. aeruginosa pueden ocurrir en numerosos Estados de la enfermedad. La fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética causada por la mutación del gen Regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) , resulta en secreciones inspissated, infectadas dentro de la vía aérea, bronquiectasia progresiva y, en última instancia, la muerte de insuficiencia respiratoria9. Por la edad adulta, la mayoría de los pacientes con FQ crónicamente infectada con p. aeruginosa, que juega un papel fundamental en la morbilidad y la mortalidad asociada con esta enfermedad10. Además, pacientes con quemaduras severas lesiones11, las traqueotomías12, reemplazo de la articulación13o residente catéteres14 están en riesgo de infección por p. aeruginosa relacionados con la capacidad de las bacterias para formar biofilms y escape host las respuestas inflamatorias15. Además, la colonización se produce sin competencia después de haber seleccionado una población tolerante o resistente a múltiples antibiótico a través de tratamiento antimicrobiano de amplio espectro, secuencial12,16,17 , 18. mejor comprensión de la patogenesia de p. aeruginosa tendrá implicaciones significativas para muchos Estados de enfermedad.
Varios aislados clínicos de p. aeruginosa , incluyendo cepas PAO1, PA103, PA14 y PAK, se han estudiado extensivamente para investigar diferentes aspectos de la patogenia de p. aeruginosa . Cepa PA14 es un aislante clínico que pertenece a uno de los grupos clónicos más común en todo el mundo19,20 y no ha sido extensivamente pasado en el laboratorio. PA14is altamente virulento en modelos de vertebrados de la infección, con una notable endotoxina perfil21, pili de la estructura22, patogenicidad de las islas23, tipo sistema de secreción III (TTSS), citotoxicidad hacia mamíferos células24 y perfiles de resistencia y persistencia antibiótico25. Además, también es altamente virulenta en numerosos sistemas de modelo huésped-patógeno PA14, incluyendo hoja de infiltración modelos26,27,elegans de Caenorhabditis infección modelos28, 29, insecto modelos30,31, así como neumonía de ratón modelos modelos de32,33 y quemaduras en la piel34.
Todo el genoma mutantes bibliotecas son colecciones de isogénicas mutantes en genes no esenciales que constituyen herramientas muy poderosas para entender la biología de un organismo permitiendo análisis de la función del gene en una escala genómica. Dos cerca de saturación transposon inserción mutante bibliotecas construidas en p. aeruginosa son actualmente disponibles para su distribución. Los sitios de inserción de los transposons han sido determinados para ambas bibliotecas. Estas bibliotecas no redundante supuestas facilitan estudios del genoma de las cepas bacterianas por disminuir considerablemente el tiempo y costo involucrados en investigación no caracterizados mutantes transposon al azar. La p. aeruginosa PAO1 transposon mutante biblioteca, construida en el MPAO1 aislar de la cepa PAO1 usando transposones esphoA/ hah eslacZy hah35, está comisariada por el laboratorio de Manoil, Universidad de Washington. La biblioteca consiste en una colección de mutantes de transposon 9.437 verificado de secuencia que ofrece una cobertura amplia de genoma e incluye a dos mutantes para la mayoría de los genes de36. Información sobre la biblioteca mutante de p. aeruginosa PAO1 transposón está disponible en la Web de laboratorio de Manoil, pública, accesible en la red, en http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. La p. aeruginosa cepa PA14 transposon no redundante inserción mutante biblioteca (conjunto PA14NR) construido en la cepa PA14 usando transposones MAR2xT7 y TnphoA37 actualmente es distribuido por el Departamento de Pediatría en el Hospital General de Massachusetts. El conjunto de PA14NR se compone de una colección de más de 5.800 mutantes con inserciones de transposones solo en genes no esenciales37. Detalles sobre la construcción del Set del PA14NR se describen en el sitio web público, accesible en la red http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, que también contiene una variedad de herramientas de búsqueda en línea para facilitar el uso de la PA14NR Conjunto.
El conjunto original de PA14NR compuesto por 5.459 mutantes, seleccionados a partir de una biblioteca de aproximadamente 34.000 transposon al azar inserción mutantes, que corresponden a 4.596 predijo genes PA14 representando el 77% de PA14 predijo todos los genes37. Desde la construcción de la biblioteca en el año 2006 se agregaron nuevos mutantes, y actualmente el PA14NR incluye más de 5.800 mutantes38 que representan aproximadamente 4.600 PA14 genes. La mayoría de los mutantes de transposon PA14 fueron generada en el fondo de tipo salvaje37. Detalles relativos a cada miembro de la biblioteca de mutantes, incluyendo antecedentes genéticos, están disponibles mediante una búsqueda en la base de datos en línea o descargando la hoja de cálculo de la biblioteca no redundante, ambas características en la Web de PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). La mayoría de los mutantes fueron creada usando el MAR2xT7 transposon (MrT7), con un pequeño grupo creado con el TnPhoA (phoA) transposón37. Cada transposón tiene una cinta de resistencia a los antibióticos, que permite la selección de mutantes con gentamicina (MrT7) o kanamicina (phoA). El conjunto PA14NR de mutantes se almacena en placas de 96 pocillos de sesenta y tres e incluye control de 96 pozos adicionales dos placas, que consisten en de tipo salvaje PA14 inoculadas y sin inocular pozos intercalan en un patrón preestablecido. El formato de la placa de 96 pocillos junto con las herramientas de búsqueda en línea grandemente facilita el desarrollo personalizado de investigación ensayos que permiten a los usuarios a identificar genes asociados a fenotipos mutantes. Las herramientas de búsqueda en línea también facilitan la búsqueda y selección de mutantes relevantes adicionales necesarios para estudios posteriores.
La PA14 PAO1 transposon mutante bibliotecas son recursos muy importantes para la comunidad científica, y se complementan en la validación de la función de genes desconocidos y las vías de este patógeno bacteriano. Coincidentemente, desde la construcción de las bibliotecas de mutación de transposon PAO1 y PA14, completo genoma DNA que ordenaba análisis de numerosos aislamientos de p. aeruginosa ha demostrado que PAO1 y PA14 pertenecen a diferentes grandes subclados de la P. aeruginosa filogenia7,39,40,41. Debido a aislamientos clínicos de p. aeruginosa se encuentran distribuidos a lo largo de la filogenia, el hecho de que PAO1 y PA14 pertenecen a p. aeruginosa de diferentes subgrupos aumenta el valor de las dos bibliotecas de mutación de transposon de comparativo estudios.
Publicaciones que describen la construcción y proyección de las bibliotecas mutantes bacterianas incluyendo p. aeruginosa bibliotecas35,37,42, están disponibles en la literatura. Sin embargo, al mejor de nuestro conocimiento, sin protocolos publicados que describen procedimientos y técnicas que se utilizan para la replicación, mantenimiento y validación de bibliotecas mutantes bacterianas están disponibles.
La metodología que se describe en esta publicación describe un conjunto de tres protocolos que faciliten el uso y mantenimiento de la PA14NR. El primer protocolo describe la replicación de la biblioteca como se recomienda a los destinatarios de la PA14NR. El segundo protocolo incluye directrices para rayas, cultivo y almacenamiento de mutantes individuales identificados usando el conjunto de PA14NR. El tercer Protocolo describe técnicas de control de calidad, incluyendo la amplificación por PCR de fragmentos de mutantes de transposon y secuenciación posterior para confirmar identidad mutante. Este conjunto de protocolos también puede ser adaptado para la replicación y el mantenimiento de otras colecciones o bibliotecas mutantes bacterianas. La replicación bacterianas mutantes bibliotecas o colecciones se recomienda altamente para preservar la integridad de la "copia maestra" (copia original recibido). Replicación de varias copias del juego de PA14NR para uso de laboratorio de rutina reduce al mínimo la probabilidad de contaminación interwell de la copia maestra.

<table><tbody><tr><td>Materiales para la replicación en bibliotecas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estéril de 96 pocillos Cultivo de tejidos tratado, caja de 50</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353072</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000&mu; L Placas de pozos profundos, caja de 25</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3960</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray (placas rectangulares), caja de 60</td><td>Thermo Scientific Rochester</td><td>242811</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Ice Pan rectangular, Midi (4L)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>432104</td><td>via Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Secure-Gard Cone Mask, caja de 300</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7509</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal, paquete de 100</td><td>Diversified Biotech</td><td>ALUM-100</td><td>a través</td></tr><tr><td>de la membrana Breathe-Easy de Fisher Scientific, paquete de 100</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Estéril, envuelto individualmente, 50 ml de canal de solución/depósito de reactivos, caja de 100</td><td>Sorenson</td><td>S50100</td><td>a través de Westnet Incorporated</td></tr><tr><td>Rodillo de placa</td><td>VWR</td><td>60941-118</td><td>a través</td></tr><tr><td>de VWR Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", paquete de 16 hojas</td><td>GA International</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>a través de Labtag.com (plantilla para impresión también disponible en Labtag.com)</td></tr> <tr><td>replicador de 96 pocillos</td><td>V & P Científico, Inc.</td><td>Custom 407C, diámetro de pin de 3,18 mm, 57 mm de largo</td><td>a través de V & P Científico, Inc.</td></tr><tr><td>Multitron Pro, incubadora de agitación de 3 mm</td><td>Infors HT</td><td>l10003P</td><td>a través de Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12 canales 50-1200&mu; L Pipeta electrónica</td><td>Sartorius</td><td>735491PR</td><td>a través</td></tr><tr><td>de las puntas de filtro Sartorius 50-1200&mu; L, paquete de 960</td><td>Biohit</td><td>14-559-512</td><td>a través de Fisher Scientific; utilice puntas electrónicas compatibles con múltiples canales</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Proveedor específico del usuario</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiales para el almacenamiento individual de mutantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubos de microcentrífuga premium: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>vía Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pipetas (P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>a través de Gilson</td></tr><tr><td>Materiales para el control de calidad PCR</td>Fisherbrand Tubos de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrífuga premium: 1,5 ml Fisher</td><td>Scientific</td><td>05-408-130</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>a través de ThermoFisher</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR Omnistrips con tapas abovedadas</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0404</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ART Boquillas de pipeta de baja retención ART Barrier (10 uL, 100 uL, 1000 uL)</td><td>Molecular BioProducts, Inc.</td><td>Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL)</td><td>a través de pipetas Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>a través de Gilson</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubos de microcentrífuga premium: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>a través de Fisher</td></tr><tr><td>Scientific MasterKit de purificación de ADN puro</td><td>Epicentre</td><td>MCD85201</td><td>a través de Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, listo para usar</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1333</td><td>a través de ThermoFisher</td></tr><tr><td>RediLoad Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>750026</td><td>a través de ThermoFisher</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals para almacenamiento de bibliotecas y mutantes individuales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol MB Grade, 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td></td><td></td><td>por 1 litro dH2O: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 1 ml de NaOH 1N (Protocolos actuales en biología molecular). Wiley, 1994.)</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB&nbsp; agar</td><td></td><td></td><td>Consulte la preparación anterior, agregue 15 g de Bacto Agar</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfato, 10g</td><td>Bioreagent</td><td>1405-41-0</td><td>a través de Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfato</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>a través de ThermoFisher</td></tr><tr><td>Ethanol, 190 proof</td><td>Decon</td><td>04-355-221</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chemicals for Quality Control PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones</td><td>Proveedor preferido por el usuario</td><td></td><td>Ver cebadores enumerados en la Tabla 3</td></tr><tr><td>Corning cellgro Agua de grado de biología molecular</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Buffer Invitrogen 10342020</td><td></td><td>a través de ThermoFisher</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase, Invitrogen recombinante</td><td></td><td>10342020</td><td>a través de ThermoFisher</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen 10297018</td><td></td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr></tbody></table>

replicación de la ordena, no redundante biblioteca de pseudomonas aeruginosa cepa pa14 mutantes de inserción de transposones

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa fenotípicamente y genotípicamente diversa y adaptable ubicua en ambientes humanos. P. aeruginosa es capaz de formar biopelículas desarrollan resistencia a los antibióticos, producen factores de virulencia y evolucionar rápidamente en el curso de una infección crónica. Así p. aeruginosa puede causar agudo y crónico, difícil de tratar infecciones, dando lugar a una morbilidad significativa en ciertas poblaciones de pacientes. P. aeruginosa cepa PA14 es un aislante clínico humano con una estructura de genoma conservadas que infecta una variedad de mamíferos y a anfitriones haciendo PA14 una variedad atractiva para el estudio de este patógeno. En 2006, se generó una transposon no redundante inserción mutante biblioteca 5.459 mutantes correspondientes a 4.596 genes predichos de PA14. Desde entonces, distribución de la biblioteca de PA14 ha permitido a la comunidad de investigación comprender mejor la función de genes individuales y complejas vías de p. aeruginosa. Mantenimiento de la integridad de la biblioteca a través del proceso de replicación requiere técnicas de correcta manipulación y precisa. Para ello, este manuscrito presenta protocolos que describen en detalle los pasos involucrados en la replicación de la biblioteca, biblioteca de control de calidad y almacenamiento adecuado de los mutantes.

Doce nuevas copias de la PA14NR se replicaron utilizando el Protocolo I y una evaluación de control de calidad de los ejemplares nuevos generados fue realizado usando Protocolo III.
PA14NR Set mutantes placas junto con el Control de placas, que consisten en de tipo salvaje PA14 inocularon y sin inocular pozos intercalados en un patrón preestablecido (Figura 4A), se replicaron siguiendo la metodologí...

Infección por Pseudomonas aeruginosa causa una morbilidad significativa en hosts vulnerables. La biblioteca mutantes de inserción de transposones no redundante de p. aeruginosa cepa PA14, designados como establece PA14NR, facilita el análisis de la funcionalidad del gen en numerosos procesos. Presentamos es un protocolo para generar copias de alta calidad de la biblioteca mutante PA14NR establecido.

Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

El objetivo general de este protocolo es generar copias de alta calidad de la biblioteca de mutantes de transposones ordenados y no redundantes de la cepa PA14 de Pseudomonas aeruginosa, denominada conjunto PA14NR. Este protocolo preserva la integridad del conjunto PA14NR durante la replicación, generando copias de alta calidad de esta biblioteca. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona una descripción detallada de todos los pasos involucrados en la replicación de bibliotecas, el control de calidad y el almacenamiento adecuado de mutantes individuales.Aunque este protocolo fue diseñado para replicar el conjunto P14NR, se puede adaptar para replicar otras bibliotecas bacterianas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al riesgo de contaminación durante el proceso de replicación. Por lo tanto, este protocolo proporciona instrucciones detalladas paso a paso para reducir ese riesgo.Nuestro laboratorio distribuye el set PA14NR a la comunidad científica mundial. Y recomendamos que las bibliotecas sean replicadas por el usuario final. Para proporcionar orientación, ofrecemos un protocolo que detalla cómo generar copias de alta cali

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Kazi, M. I., et. al., Generación de bibliotecas de inserción de transposones en bacterias gramnegativas para secuenciación de alto rendimiento. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la selección, cuantificación y preservación de bacterias receptoras Gram-negativas portadoras de inserciones de transposones basadas en la resistencia a la kanamicina.

Aislamiento de bacterias gramnegativas con inserciones de transposones genómicos

Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.

Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Uso de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; La mutagénesis mediada por transposón Mariner

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

Presentado aquí es un método simple para crear una biblioteca de inserción del transposón alta densidad en Escherichia coli o Shigella flexneri mediante Conjugación bacteriana. Este protocolo permite la creación de una colección de cientos de miles de mutantes únicos en bacterias por la inserción genómica al azar de un transposón.

Creación de un denso Transposon inserción biblioteca usando Conjugación bacteriana en cepas enterobacterianas tales como Escherichia Coli o Shigella flexneri

Aquí describimos una técnica que combina la mutagénesis de transposon con secuenciación de alto rendimiento para identificar y cuantificar a mutantes de transposon leptoespiral en tejidos después de un desafío de hámsters. Este protocolo puede utilizarse para mutantes de pantalla para la supervivencia y difusión en los animales y también se puede aplicar a estudios en vitro .

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

Aquí presentamos un método experimental para probar el papel de multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos.

Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Este protocolo presenta un método rápido y eficiente para identificar los factores genéticos involucrados en varios tipos de motilidades en Pseudomonas aeruginosa.

Método de alto rendimiento para observar fenotipos de motilidad en Pseudomonas aeruginosa

Protocolo que describe la aplicación de un sistema de celda de flujo para el cultivo y el análisis de biofilms microbianos para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Aprende a replicar la biblioteca de mutantes de transposones PA14NR de Pseudomonas aeruginosa preservando su integridad y minimizando la contaminación. Este protocolo detallado permite generar copias de alta calidad para investigación microbiológica.

Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

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