Name: Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a crear un modelo ortotópico sinérgico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración mediante inyección intra-prostática en ratones. Esta técnica permite estudiar la respuesta tumoral a tratamientos en un microambiente clínicamente relevante.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de subvenciones de salud Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Abdulkadir Sarki (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) y Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).

Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo deben realizarse conforme a las normas éticas y la aprobación de la correspondiente Universidad institucional Animal Care y Comité uso (IACUC).
1. preparación de materiales quirúrgicos y las células cancerosas
<ol><li>Antes del día de la cirugía, autoclave las tijeras de disección micro, pinzas Graefe, Graefe tejido pinzas, sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y el número apropiado de cortinas. Esterilizar una jeringa de 50 μl y agujas calibre 28 por gas de óxido de etileno (figura 1).</li>
	<li>Antes del día de la cirugía, las células de Myc-CaP de cultura en platos de 10 cm en RPMI suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina (P/S) en una incubadora de 37 ° C de 5% CO2 . Para el control de tumor bioluminiscente o fluorescente, transfectar las células 293T con los vectores apropiados y posteriormente transducir células Myc-CaP con 0.45 μm filtrado lentivirus31. Ordenar las células para generar una línea celular estable con 100% de positividad de transducción de señales. Nota: Realizar todos los cultivo de tejidos en condiciones estériles y verificar que todas las líneas de celular están libres de mycoplasma. La línea celular de cáncer de próstata murino utilizada en este estudio, Myc-CaP32, es transduced para estable expresan luciferasa de luciérnaga y mCherry. La iss de línea celular Myc-CaP aislada de un c-myc-expresando ratón Hi-myc y estas células contienen un receptor de andrógenos amplificado (AR), que son andrógeno dependientes32 y formar tumores CPRP después de castración murino33. Todos los ratones en este estudio son ratones FVB/NJ machos de 6 a 8 semanas de edad. Líneas celulares de cáncer de próstata murino alternativa pueden utilizarse con los ratones de fondo genético apropiado, así como líneas celulares de cáncer de próstata humano o las células de cáncer de próstata primario derivado de paciente con ratones inmunodeficientes. El número óptimo de células por inyección debe determinarse empíricamente para líneas celulares alternativos. Además, las modalidades de la proyección de imagen de alternativa puede ser utilizado para visualizar tumores, incluyendo la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET) o tomografía computada (CT), así como de GFP como alternativa a mCherry.</li>
	<li>La noche antes de la cirugía, colocar matrigel matriz de la membrana del sótano y sin rojo fenol en hielo a 4 º C para descongelar.</li>
	<li>En el día de la cirugía, recoge las células de lavado con tampón fosfato salino (PBS) y la extracción con 0.25% tripsina-EDTA. Neutralizar la tripsina con RPMI con 10% FBS y 1% P/S.</li>
	<li>Centrifugar las células a 400 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Lavar las células con 10 mL de RPMI sin FBS o P/S.</li>
	<li>Contar las células y resuspender las células en PBS a una concentración de 6.67x107 células/mL (1 x 106 células/15 μl).</li>
	<li>Añadir un volumen igual de matrigel crear una suspensión de células de PBS/matrigel 1:1 a una concentración final de 1 × 106 células/30 μl y mantener las células en hielo hasta la inyección para evitar la solidificación. Nota: Realizar inyecciones intra prostática dentro de 3 h de preparación de suspensiones celulares de matrigel. Si realizar inyecciones intra prostática en más de 5 ratones, repita los pasos anteriores para preparar una suspensión fresca de matrigel.</li>
</ol>2. preparación de mouse preoperatorio
Nota: ratones de la casa en la Universidad Animalario para por lo menos una semana antes de la cirugía para permitir la adecuada adaptación y minimizar el estrés animal. Los pasos 2.1-2.6 son realizados por el Asistente de cirujano. Todos los pasos quirúrgicos subsecuentes son realizados por el cirujano usando herramientas quirúrgicas y guantes estériles con técnica estéril.
<ol><li>Anestesiar los ratones con isoflurano (2-5% para la inducción a través de la cámara, 1-3% para el mantenimiento a través del cono de nariz). Verificar la inducción completa por la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie.</li>
	<li>Peso de los ratones y administrar por lo menos de 0,05 mg/kg de buprenorfina analgésico s.c. Nota: Ratón peso ≥ 20 g es ideal para las inyecciones intra prostática exitosas.</li>
	<li>Aplique lubricación ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar la sequedad corneal.</li>
	<li>Aféitese todos de piel del abdomen.</li>
	<li>Esterilizar el abdomen por tres rondas de aplicación circular de lavado quirúrgico usando teclas no adherentes estériles seguidos de toallitas de alcohol estéril. Permita que el abdomen se seque. Nota: Para el resto del procedimiento quirúrgico, instrumentos quirúrgicos y guantes estériles pueden póngase en contacto con el abdomen de ratón esterilizada.</li>
	<li>Transferir el ratón decúbito supino sobre una superficie limpia sobre una almohadilla de calefacción directamente en el objetivo de un microscopio quirúrgico limpio.</li>
	<li>Cubre el ratón con un paño estéril con un pequeño orificio sobre el abdomen.</li>
</ol>3. Intra prostática inyección
Nota: Realice todos los pasos quirúrgicos en condiciones estériles. Ajuste del microscopio, la colocación del ratón o cualquier otros objetos no estériles deben ser realizados por el Asistente de cirujano.
<ol><li>Realizar una incisión de aproximadamente 1 cm de la piel externa a lo largo de la línea media del abdomen superior a la del pene y las glándulas prepuciales (figura 1).</li>
	<li>Separar el tejido conectivo entre la piel abdominal y la musculatura abdominal interna abriendo las tijeras entre las capas.</li>
	<li>Realizar una incisión similar de la musculatura abdominal interna durante el uso de fórceps para levantar la musculatura para evitar perforar los intestinos o la vejiga (figura 1).</li>
	<li>Localizar una de las vesículas seminales bilaterales (figura 1A, blanco) / lóbulos de la próstata anteriores (figura 1A, negro), que son a menudo posterior, lateral y ligeramente superior a la vejiga (figura 1A, amarillo), pero esto pueden variar entre ratones . El lóbulos anteriores de la próstata son translúcidos y adjunto a la curvatura menor de las blanco las vesículas seminales.</li>
	<li>Suavemente Levante la punta de la vesícula seminal con el fórceps de tejido de Graefe para crear tensión en el tejido sin pinchar la vesícula seminal (Figura 1E).</li>
	<li>Mezcle la solución de matrigel de Myc-CaP transfiriendo gentile (realizada por el ayudante de cirujano), como las células pueden haber peleteado y aspirar lentamente 30 μl (1 x 106 células) dentro de la aguja para evitar burbujas de aire.</li>
	<li>Introduzca con cuidado el bisel de la URL de la aguja al eje largo del lóbulo anterior de la próstata. Lentamente inyecte 30 μL en el lóbulo y retraiga lentamente la aguja para evitar fugas (Figura 1F). Verificar adecuada inyección por congestión de próstata lóbulo anterior (figura 1).</li>
	<li>Mantener cuidadosamente la vesícula seminal y lóbulo prostático inyectado fuera de ratón de aproximadamente 30 s para permitir matrigel solidificar parcialmente dentro del lóbulo. Durante este tiempo, recoger cualquier fuga de solución de la célula en el abdomen usando un aplicador con punta de poliéster estéril para evitar desarrollo de tumor no ortotópico, sin presionar sobre el lóbulo prostático inyectado.</li>
	<li>Cuidadosamente regrese la vesícula seminal y lóbulo prostático inyectado en el abdomen sin ejercer presión sobre el lóbulo. Reemplazar cualquier tejido externalizada.</li>
	<li>Realizar sutura continua para cerrar la musculatura abdominal interna con suturas de 5-0 vicryl absorbible corte inversa aguja.</li>
	<li>Realizar suturas interrumpidas para cerrar la piel abdominal con suturas de aguja de corte inverso no absorbible de monofilamento de 4-0 nylon. Nota: Grapas esterilizada de 9 mm pueden utilizarse también para cerrar la piel abdominal externa. Sin embargo, en contraste con las suturas, interfieren con cualquier tumor bioluminiscente y fluorescente posterior señal de imagen.</li>
	<li>Limpie todas las herramientas con toallitas estériles etanol (abiertos por el Asistente de cirujano) y colocarlos en un esterilizador de bolas de cristal para permitir s. 30 herramientas para secar antes del uso del ratón siguiente.</li>
	<li>Enjuague la jeringa y la aguja con solución salina estéril (abierta por el Asistente de cirujano) para evitar que se obstruya por remanente matrigel. Nota: Un asistente del cirujano debe estar presente para todas las operaciones, realizar preparación preoperatoria ratón todo estéril y cuidado postoperatorio del ratón, así como para mezclar la solución de matrigel Myc-CaP antes de las inyecciones. Para minimizar el tiempo, como cada procedimiento intra prostática ratón requiere 20-30 min, el ayudante del cirujano puede comenzar a preparar el próximo ratón como el cirujano sutura el ratón actual.</li>
</ol>4. postoperatorio del ratón cuidado
<ol><li>Administrar 1 mg/kg de meloxicam analgésico s.c. inmediatamente, 24 h y 48 h después de la cirugía.</li>
	<li>Permiten ratones recuperar en una jaula con no ropa de cama colocado a mitad de camino en un cojín de calefacción. Controlar ratones durante al menos 30 minutos después de la cirugía hasta que recuperaran movilidad normal y la actividad, después de que coloque en una jaula limpia con alimento en el piso de la jaula.</li>
	<li>Monitor más ratones diariamente para la correcta cicatrización de heridas, peso corporal, aseo y paseo después de la cirugía. Ratones separados en jaulas individuales sobre cualquier evidencia de la lucha.</li>
	<li>Retire cualquier suturas restantes dentro de 14 días después de la cirugía.</li>
</ol>5. proyección de imagen de Tumor bioluminiscente
<ol><li>Preparar Na filtrado estéril+ o K+ D-luciferin, como descrito por el fabricante y protegido de la luz.</li>
	<li>Inyectar a ratones intra peritoneally con 10 μl/g de peso corporal de luciferin.</li>
	<li>Por lo menos 10 minutos más tarde, ratones de la imagen con un sistema de proyección de imagen de espectro de IVIS, como se describió anteriormente34,35.</li>
	<li>Analizar imágenes usando vida Software de imagen, como describió anteriormente34,35. Nota: IVIS análisis de imagen es útil para determinar éxito inyecciones intra prostática y el desarrollo de tumor inicial para normalizar la carga del tumor entre los grupos experimentales. Sin embargo, dependiendo de la intensidad de la señal fluorescente o bioluminiscente, saturación puede causar una meseta en la cuantificación de la imagen a pesar de un aumento en el tamaño tumoral real. Por lo tanto, en las últimas etapas del crecimiento del tumor, proyección de imagen de IVIS puede ser más útil para determinar las disminuciones en el tamaño del tumor al tratamiento acertado que aumenta de tamaño después de la saturación de la imagen.</li>
</ol>6. tumor colección, análisis del Tumor, supervivencia extremo
<ol><li>Si recoger el tumor para su análisis, humanamente eutanasia ratones por exposición a CO2 y dislocación cervical secundaria, o por métodos alternativos de IACUC aprobado y diseccionar los tumores del abdomen. Los tumores deben ser orthotopically situado en la próstata. Nota: Los tumores atado a la pared abdominal anterior o sembradas en todo el abdomen indican pobre o con fugas de inyección intra prostática y no deben considerarse como tumores ortotópicos.</li>
	<li>Peso de los tumores.</li>
	<li>Calcular el volumen del tumor como π/6 × L × W × H (L = longitud del eje mayor del tumor, W = ancho perpendicular, H = altura perpendicular).</li>
	<li>Los tumores pueden ser analizadas por la histología (arreglo en 10% formalina tamponada neutra), citometría de flujo (crear suspensiones celulares solo), proteína (preparar tejido lisado en almacenador intermediario RIPA), o el RNA (inmediatamente lugar tejido en RNAlater).</li>
	<li>Para análisis inmunológicos, también recogen los próstata tumor-drenaje paraaórticos ganglios linfáticos (figura 1B, naranja) y el bazo. Nota: Si después de ratones para la supervivencia, el punto final de este modelo se define como la aparición de ascitis abdominal hemorrágica36 o disminución de ambulación, grooming y piloerección37. Ratones para análisis de supervivencia reciban analgesia pre y postoperatoria (pasos de protocolo 2.2, 4.1) y deben ser vigilados regularmente. Ratones deben ser separados en jaulas individuales si cualquier lucha se produce y debe ser sacrificado humanitariamente a la aparición de cualquiera de las anteriores lecturas de punto final.</li>
</ol>7. quirúrgica castración a modelo CPRP
<ol><li>Para modelo CPRP, realizar el anterior protocolo de inyección intra prostática (pasos 1-5 del Protocolo).</li>
	<li>Por lo menos una semana más tarde, después del desarrollo del tumor, realizar castración quirúrgica mediante cauterización, como se describió anteriormente38.</li>
	<li>Monitorear regresión del tumor y la recurrencia de imágenes bioluminiscentes. Después de la castración, se producirá la regresión del tumor dentro de 3 días y recurrencia tumoral se producirá en aproximadamente 30 días, representando CPRP.</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

En este manuscrito Contorneamos el protocolo para realizar inyecciones de células de cáncer prostático intra quirúrgica. Utilizamos el andrógeno-dependiente y MYC -overexpressing (MYC sobreexpresión es vista a 80-90% de cáncer de próstata humano39) línea de celular del murino de cáncer de próstata, Myc-CaP, aislado originalmente de la Hi-Myc ratón32 ,33. Esta línea celular fue transduced estable para expresan luciferasa y mCherry, no invasivo en vivo imagen de tumor bioluminiscente y fluorescente, respectivamente. También se realizó la castración quirúrgica, más después del desarrollo de tumor dependiente de andrógenos, conduce a la regresión del tumor y la recurrencia posterior. Por ello, ofrecemos información para el cáncer de próstata andrógeno-dependiente ortotópico y CPRP en un anfitrión inmunocompetente.
MYC-CaP las células se inyectan en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. La próstata del ratón consiste en los lóbulos anteriores, ventrales y dorsolateral de próstata y la próstata humana consiste en una zona periférica, zona transicional y zona central dentro de un solo lóbulo40. Mientras que estudios anteriores han comparado anatómico e histológico del lóbulo dorsolateral del ratón al humano periférico de la zona, el sitio de la mayoría de los cánceres de próstata41y el lóbulo anterior del ratón a la zona central humano42, 43, más reciente y amplio análisis ha demostrado que el lóbulo anterior y lóbulo dorsolateral muestran patrones de expresión de genes estrechamente relacionados, en comparación con el lóbulo ventral. 44 además, desarrollo de cáncer de próstata se ha observado en el lóbulo anterior de gemas40y, para el procedimiento intra prostática, lóbulo anterior permite la inyección del volumen necesario de solución de la célula de cáncer con fuga mínima y variabilidad.
Utilizando s.c. y Gema transgénica modelos de cáncer tienen varios defectos y limitaciones. S.c. los tumores en un TME artificial tienen respuestas diferenciales a las quimioterapias, en contraste con ambos tumores ortotópicos de la misma línea celular y enfermedad humana20,21,22. Esto puede ser debido a la vasculatura alterada de tumores s.c., como ejemplificado por su diferencial respuesta a anti-angiogenic terapia18,19. Por el contrario, los tumores orthotopic desarrollan un TME adecuado drenaje de los ganglios linfáticos y vasculatura y pueden realizarse con líneas celulares murinas, de tal modo también permitiendo análisis de Inmunología tumoral y respuesta a las inmunoterapias.
Gemas de transgénicos desarrollan tumores con un TME apropiado en un anfitrión inmunocompetente, sin embargo, estos modelos normalmente oversimplify cáncer humano mediante el desarrollo de tumores con alteraciones genéticas solo o pocos29. Un análisis de Myc-CaP y otras líneas celulares de cáncer de próstata reveló que contenían mucho mayor alteraciones de número de copia somáticas y alteraciones cromosómicas que los tumores de los ratones Hi-Myc y otras gemas que eran derivados29. Además, gemas están limitadas por el aumento de los costos y el tiempo necesario para los ratones de cría para realizar experimentos de suficiente potencia. Modelado de orthotopic tumor puede superar estas limitaciones. Líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino contienen muchas alteraciones genéticas relevantes para la enfermedad humana29y, como cáncer en humanos, también muestran gran heterogeneidad entre las células individuales30. Tumores syngeneic murinos ortotópico permiten análisis inmunológicos, mientras orthotopic tumores xenogeneicos humanos permiten análisis de la terapéutica de células humanas. Finalmente, a diferencia de con gemas, célula líneas pueden ser modificadas antes de la inyección, lo que permite expresión de bioluminiscente o fluorescente de moléculas para controlar el crecimiento del tumor, normaliza la carga del tumor entre los grupos experimentales, vigilar la respuesta al tratamiento y a Siga la regresión del tumor y la recurrencia de CPRP después de la castración quirúrgica.
Pasos críticos en este protocolo incluyen localización y externalizar la vesícula seminal y el adjunto anterior lóbulo prostático sin dañar otros tejidos o punción de la vesícula seminal, realizar un acertado inyección intra prostática de 30 μl de células suspensión sin salida y recogida adecuadamente cualquier fuga para prevenir el desarrollo de tumor no orthotopic en todo el abdomen. La limitación principal de inyecciones intra prostática es lograr la habilidad técnica necesaria para minimizar la variabilidad de tumor entre ratones. Esto es especialmente importante para el modelado de CPRP, que tiene la variable agregada de la castración quirúrgica. Ratones intra-prostatically inyectados y castrados deben también ser seguidos de cerca para la recuperación y los eventos adversos, como han sometido a dos cirugías de mayor supervivencia. Otra limitación es el tiempo de cada inyección intra prostática. Esto se puede reducir a como bajo como 20 min y el cirujano asistente puede preparar el siguiente ratón como el ratón actual está siendo suturado. Por último, los tumores orthotopic Myc-CaP son agresivos, rápido crecimiento tumores que alcanzan el extremo de supervivencia en aproximadamente 46 días (y ya en 35 días) debido al tumor primario total. Estudios que requieren de más lento desarrollo del tumor o tratamientos a largo plazo deben optimizarse empíricamente para el régimen de cuenta y tratamiento de células de inyección inicial. En contraste con las limitaciones de tumores s.c. y joyas, todos de las limitaciones del modelo ortotópico tumor pueden superar, y pueden hacer modificaciones adicionales del protocolo basados en necesidades experimentales.
Como el trasplante orthotopic del modelo de tumor implica el uso de vitro-mango, estas células pueden ser modificadas dependiendo de las necesidades del estudio. Aquí, modificamos estas células para estable expresan luciferasa y mCherry en vivo seguimiento tumoral. También hemos realizado un nocaut en el Cas9 CRISPR del supresor del tumor PTEN, para generar una línea más agresiva, clínicamente relevante de la célula que crece más rápido como tumores ortotópicos (manuscrito en revisión). Con las ventajas del modelo ortotópico de tumor, la capacidad para el estudio de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP tanto el potencial de expresar modalidades de imágenes o caída o sobrexpresan genes selectos, este protocolo sirve como un valioso recurso para todos investigación de cáncer de próstata.

El cáncer de próstata se estima que la incidencia más alta (161.360 hombres) y causar las muertes de cáncer masculino más tercera (84.590 hombres) en 20171. Tras el diagnóstico, tumores de próstata son andrógeno dependientes y son tratados por cirugía prostatectomía, radioterapia o terapia de privación androgénica (ADT), sin embargo, cada tratamiento se asocia con múltiples principales morbilidades y complicaciones2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. a pesar de la regresión del tumor después de ADT, se repiten casi todos los tumores como el cáncer de próstata resistente a castración (CPRP). En esta etapa, tratamientos aprobados incluyen docetaxel, inmunoterapia Sipuleucel-T y el antiandrógeno pequeñas moléculas enzalutamide y abiraterona, sin embargo, no hay terapia individual confiere un beneficio de supervivencia de más de 5,2 meses11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. por lo tanto, los hombres en todas las etapas del cáncer de próstata necesitan opciones de mejora del tratamiento y manejo de enfermedades, para que la enfermedad preclínica óptima modelado es crucial.
Con el procedimiento correcto, las líneas celulares de cáncer de próstata pueden ser inculcadas quirúrgicamente dentro de la próstata murina, llevando al desarrollo de ambos tumores ortotópicos syngeneic o xenogeneicos. Modelado de tumor de orthotopic es ideal para todos tumor biología y drogas desarrollo investigación, lo que permite un desarrollo de tumores con un microambiente tumoral clínicamente representativos (TME). Estudios anteriores han demostrado que los tumores subcutáneos (s.c.) tienen una vasculatura tumoral alterado, llevando a diferencial y menos clínico precisas respuestas a anti-angiogenic terapias18,19. Además, varios estudios han observado la eficacia de aumento o disminución de varios quimioterápicos en el tratamiento de la misma línea celular, dependiendo de si es administrado s.c. o orthotopically, que representa mejor lo que se ve en humanos cáncer20,21,22. Además, sólo en un modelo ortotópico de cáncer de colon, pero no en el modelo de s.c., tumores producen las enzimas degradativas correcto necesarias para inducir la metástasis23. Por último, las inmunoterapias siguen apareciendo en la vanguardia de la terapia del cáncer, y especialmente deben proporcionar un beneficio significativo para el cáncer de próstata24,25, syngeneic modelos preclínicos con TME precisa y drenaje linfáticos en anfitriones inmunocompetentes son críticos.
Hay muchos factores responsables de estos resultados inconsistentes en el sitio del tumor. Con un TME diferentes, las células cancerosas están expuestas a diferentes tejidos específicos endotelio y alteración la angiogénesis, afectando tumor desarrollo26,27. Tumores ortotópicos con TME correcto permiten el suministro de medicamentos clínicamente relevantes, condiciones hipóxicas y evaluación de anti-angiogenic terapias28. Mientras que modelos genéticamente (GEMs) contienen un TME precisa, que requieren mucho tiempo épocas de cría, alto costo y son a menudo basan en manipulaciones de uno o pocos genes noqueado o sobre expresa más allá de niveles clínicamente relevantes. En contraste, las líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino utilizadas en tumores ortotópicos, como los tumores humanos, son genéticamente más complejas dentro de las células y en Mostrar heterogeneidad entre células29,30. También a diferencia de gemas, ortotópico líneas celulares de cáncer pueden ser diseñadas para expresar modalidades de imágenes o aumentadas o disminución de los niveles de otras moléculas de interés y in vitro e in vivo los resultados experimentales puede compararse directamente. Ortotópica de tumores también pueden ser formados de células derivadas del paciente primarias. Aquí, divulgamos la metodología para la realización de inyecciones intra prostática de las células de cáncer de próstata que forman tumores andrógeno-dependientes de orthotopic y, después de la castración, se repiten como orthotopic del CPRP.

<table><tbody><tr><td>Línea celular Myc-CaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3255</td><td>Verificar como libre de micoplasma antes de usar</td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graege</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de tejido Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas Olsen-Hegar con cortadores de sutura</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>50 y micro; L Jeringa 705 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>Esterilizar con gas de óxido de etileno</td></tr><tr><td>Agujas de calibre 28 Cubo pequeño RN</td><td>Hamilton</td><td>7803-02 Estilo de</td><td>punta 4, Ángulo 45&deg;, Longitud 0.75 in. Esterilizado por gas de óxido de etileno</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>18875-093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Matrigel sin fenol, sin rojo fenol, sin LDEV</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Descongele en hielo en 4 grados; C durante la noche antes de usar</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>11695-0500-2</td><td>Adquirido del Centro de Medicina Comparativa (CCM) de la Universidad Northwestern26</td></tr> <tr><td>Jeringa de calibre 5/8</td><td>BD</td><td>309597</td><td>Para inyecciones de meloxicam y buprenorfina</td></tr><tr><td>Pirocloruro de buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td></td><td>12496-0757-5</td><td>Sustancia controlada, adquirida de la Universidad Northwestern CCM</td></tr><tr><td>Ophthalmic lubricación de ungüento</td><td>Akron</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Exfoliante quirúrgico Betadine (povidona yodada, 7,5%)</td><td>Purdue Products</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas estériles no adherentes</td><td>Moore Medical</td><td>10775</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas estériles con alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores estériles con punta de poliéster</td><td>Puritan</td><td>25-806 1PD</td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl absorbible suturas de aguja de corte inverso</td><td>eSuturas</td><td>J493G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 monfilamento de nylon no absorbible suturas de aguja de corte inverso</td><td>eSutures</td><td>699H</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas de vidrio</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>solución salina estéril cloruro de sodio al 0,9%</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-02</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6925-1</td><td>Adquirido de la Universidad Northwestern CCM</td></tr><tr><td>D-luciferina Firefly, sal de sodio monohidratado</td><td>Goldbio</td><td>LUCNA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauery pluma quirúrgica</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>CD3 y épsilon; anticuerpo (clon 2GV6)</td><td>Ventana</td><td>790-4341</td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo contra el receptor de andrógenos</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9030-P1</td><td>dilución de tinción 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo sinaptofisina (clon Z66)</td><td>Life Technologies</td><td>18-0130</td><td>dilución de tinción 1:200</td></tr></tbody></table>

un modelo murino syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Ortotópico tumor modelación es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer de próstata clínico previo, ya que tiene múltiples ventajas sobre ambos subcutáneo y transgénicos genéticamente modificados modelos de ratón. A diferencia de los tumores subcutáneos, tumores ortotópicos contienen vasculatura más clínico exacto, microambiente tumoral y respuestas a las terapias múltiples. En contraste a los modelos de ratón modificados genéticamente, orthotopic del modelos pueden realizarse con menor costo y en menos tiempo, implican el uso de ratón altamente complejo y heterogéneo o líneas celulares de cáncer humano, algo solo alteraciones genéticas y estas células las líneas pueden ser genéticamente modificados, como express agentes de imagen. Aquí, presentamos un protocolo quirúrgico inyectar una línea de células expresan luciferasa y mCherry murino de cáncer de próstata en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. Estos ratones desarrollaron tumores de orthotopic que fueron monitorizados de forma no invasiva en vivo y más analizan en el volumen del tumor, peso, supervivencia del ratón y la infiltración inmune. Además, ratones con tumores de orthotopic fueron castrados quirúrgicamente, conduce a la regresión del tumor inmediata y posterior recurrencia, que representa el cáncer de próstata resistente a castración. Aunque la habilidad técnica es necesaria para llevar a cabo este procedimiento, este modelo de syngeneic ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración es de gran utilidad para todos los investigadores en el campo.

En este manuscrito, quirúrgicamente inyectamos la línea celular de cáncer de próstata murino, Myc-CaP, en el lóbulo anterior de la próstata (figura 1A), llevando al desarrollo de tumores de próstata ortotópico con un TME clínicamente relevante y la correcta próstata-drenaje linfáticos (figura 1B). Esto se realizó con tijeras micro disección Graefe fórceps, Graefe tejido pinzas, un sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y una jeringa de 50 μL con una aguja de calibre 28 (figura 1). Tras realizar una incisión aproximadamente 1 cm de la línea media abdominal por encima de las glándulas prepuciales (figura 1), una vesícula seminal y adjunto anterior lóbulo prostático fueron localizados y exteriorizado (Figura 1E) y 30 μl (1 x 106 células) de un Suspensión 1:1 PBS/matrigel se inyectó en la próstata (Figura 1F), verificada como inicialmente por la hinchazón de los senos del lóbulo y la falta de salida (figura 1).
Para supervisar el crecimiento del tumor ortotópico, nos estable transfected las células Myc-CaP para expresan luciferasa de luciérnaga y mCherry, permitiendo tumores seguida de invasiva en vivo bioluminiscencia (figura 2A) y fluorescencia (figura 2B), respectivamente. Una limitación de esta imagen es que, dependiendo de la intensidad de la señal, la cuantificación de la proyección de imagen puede saturar mientras que el tumor continúa creciendo en tamaño. Por lo tanto, con intensidades de la señal alto, esta en vivo la proyección de imagen es más útil para normalizar inicialmente carga tumoral a través de grupos experimentales y para más adelante determinar disminución en el tamaño del tumor después de tratamientos experimentales. Modalidades de imágenes adicionales también pueden ser utilizadas, como el pequeño animal PET y MRI y CT.
Tumores ortotópicos fueron disecados del abdomen en 30 días después de la inyección intra prostática (Figura 3A). Tumores ortotópicos deben estar ubicados en el sitio del lóbulo anterior de la próstata. Tumor de masas en el abdomen o fijada a la pared abdominal anterior indicar inadecuada inyección intra prostática y fugas. Con la técnica adecuada, se pueden grabar con error estándar relativamente pequeño volumen del tumor (figura 3B) y peso (figura 3). Sin embargo, como se observa, habrá cierta variabilidad con las masas de tumor pequeño y grande. Por lo tanto, su uso inicial de la cuantificación de imágenes de pretratamiento para igualar la carga del tumor entre los brazos experimentales es fundamental para todos los experimentos. Además, como estas células cancerosas murinas fueron inyectadas en ratones FVB/NJ inmunocompetentes, lo TME puede ser analizada por inmunohistoquímica (IHQ) (o citometría de flujo u otras técnicas) de las células de T de CD3 (figura 3D) (u otros tipos de células inmunes). Por último, este modelo proporciona un punto final objetivo de supervivencia, como el tumor primario grande causas masivo hemorrágico ascitis abdominal36 (figura 3E) o disminución de ambulación, grooming y piloerección37. En ocasiones, la muerte también puede ser causada por el crecimiento del tumor bloqueando la salida de la orina.
Por último, este modelo puede ser utilizado para estudiar el cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP, el último de los cuales confiere mal pronóstico y necesita opciones de nuevo tratamiento. Después del desarrollo de tumor de orthotopic, ratones fueron castrados quirúrgicamente, como se describió anteriormente38. Es la segunda cirugía mayor supervivencia, adicional debe tener cuidado con seguimiento de recuperación y cualquier eventos adversos o complicaciones. Dentro de 3 días después de la castración, se observó regresión del tumor fuerte, seguido de posteriores recidivas después de aproximadamente 30 días, representando el CPRP (Figura 4A). Tumores CPRP pueden disección y análisis histológico y no muestran ninguna diferenciación neuroendocrina, ya que mantienen altos niveles de AR y son negativos para el marcador neuroendocrino, sinaptofisina (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig1.jpg"> Figura 1: lóbulo Anterior próstata, drenaje de los ganglios linfáticos y representante técnica de inyecciones de células intra prostática. Imágenes del lóbulo prostático anterior derecha (A) (negro, *), une la vesícula seminal derecha (blanco), derecha testículo y cojín gordo (verde) y vejiga (amarillo), (B) bilateral próstata drenaje paraaórticos ganglios linfáticos (naranja), (C) tijeras disección micro, Graefe pinza, Graefe tejido pinzas, un sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y 50 μl jeringa con aguja de calibre 28 (de izquierda a derecha), incisiones de la línea media (D) , (E) la vesícula seminal y anterior del lóbulo prostático externalización, (F), inyección intra prostática y congestión (G) del lóbulo anterior de la próstata. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig2.jpg"> Figura 2: En vivo bioluminiscente y fluorescente tumor proyección de imagen de. (A) (B) y luciferasa mCherry-expresar tumores ortotópicos Myc-CaP se reflejada mediante un sistema de proyección de imagen de espectro de IVIS. Bioluminescence se cuantificó por flujo total (fotones/s). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig3.jpg"> Figura 3: Análisis de tumor ortotópico por peso, volumen del tumor, histología de infiltración inmune y la supervivencia. Tumores ortotópicos se diseca el día 30 después de la inyección intra prostática y se analizaron por (A) proyección de imagen, (B) tumor volumen bruto (π/6 × L × W × H; L = longitud del eje mayor del tumor, W = ancho perpendicular, H = altura perpendicular), (C) peso del tumor, (D) CD3 IHC (barra de escala = 100 μm) y (E) la supervivencia, con el criterio de valoración objetiva como la aparición de hemorrágico abdominal ascitis. (A-B) Datos representados como media ± error estándar de la media. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig4.jpg"> Figura 4: inyecciones Intra prostática posterior castración quirúrgica para cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP. (A) ratones tumores expresan luciferasa ortotópico fueron reflejadas por bioluminiscencia pre y post castración (Cx), y (B) se repitió CPRP tumores fueron disecados (negro = orthotopic del tumor de la próstata; amarillo = vejiga) y analizadas por H &amp; E, IHC AR y el synaptophysin IHC (con control positivo murino) (barra de escala = 50 μm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El objetivo de este protocolo es demostrar la inyección intra prostática de las células de cáncer de próstata, con la posterior castración. Modelos preclínicos ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración son críticos para el estudio de la enfermedad en el contexto de un microambiente tumoral clínicamente relevante y un anfitrión inmunocompetente.

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar una inyección intraprostática de células cancerosas murinas para inducir la formación de tumores ortotópicos singénicos que puedan modelar tanto el cáncer de próstata dependiente de andrógenos como el resistente a la castración. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de próstata, como qué impulsa el desarrollo del cáncer de próstata y qué tratamientos funcionan mejor para eliminar estos tumores. Las principales ventajas de esta técnica son que los tumores ortotópicos son genéticamente más complejos, se desarrollan en un microambiente tumoral clínicamente representativo y pueden ser modificados genéticamente antes de la inyección.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer de próstata humano, ya que los tumores ortotópicos responden a las terapias de manera similar a la observada en pacientes humanos. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco de los dedos de los pies, aplique ungüento en los ojos del ratón y afeite todo el pelaje del abdomen del animal. Esterilice la piel expuesta con tres rondas de exfoliante quirúrgico usando almohadillas estériles no adherentes seguidas de toallitas estériles con alcohol.Cuando la piel esté seca, coloque el ratón en posición supina sobre una superficie limpia sobre una almohadilla térmica directamente debajo del objetivo de un microscopio quirúrgico limpio. Y cubra al animal con una cortina estéril con un pequeño agujero cortado sobre el abdomen. Realice una incisión de un centímetro en la piel externa y la musculatura abdominal interna a lo largo de la línea media del abdomen superior al pene y las glándulas prepuciales.Localice una de las vesículas seminales bilaterales y los lóbulos de la próstata anterior adjuntos, que suelen ser posteriores, laterales y ligeramente superiores a la vejiga. Pídale a un asistente que mezcle la solución de células cancerosas MIC-CAP Matrigel con un pipeteo suave y que aspire lentamente 30 microlitros de células en una aguja de calibre 28 conectada a una jeringa de 50 microlitros. Luego, con las pinzas de tejido Graefe, levante suavemente la punta de una vesícula seminal para crear tensión en el tejido sin perforar la vesícula e inserte con cuidado el bisel de la aguja paralelo al eje largo del lóbulo prostático anterior. Inyecte lentamente todo el volumen de células en el lóbulo, seguido de una retracción lenta de la aguja para evitar fugas.Una inyección exitosa será aparente por una congestión del lóbulo prostático anterior. Mantenga con cuidado y de manera constante la vesícula seminal y el lóbulo prostático inyectado fuera del ratón durante aproximadamente 30 segundos para permitir que el Matrigel se solidifique parcialmente dentro del lóbulo. Use un aplicador estéril con punta de poliéster para recolectar cualquier fuga de solución celular en el abdomen para prevenir el desarrollo de tumores no ortotópicos.Una inyección intraprotésica precisa es fundamental para el desarrollo de tumores no ortotópicos. Tener especial cuidado para evitar perforar la vesícula seminal, inyectar lentamente la suspensión de células cancerosas y recoger cualquier fuga celular aumentará el éxito de este procedimiento. Ahora, regrese suavemente la vesícula seminal y el lóbulo inyectado al abdomen sin ejercer presión sobre el lóbulo y reemplace los tejidos externalizados.Utilizando suturas de aguja de corte inverso absorbibles 5-0 vicryl, cierre la musculatura abdominal interna con puntos continuos seguidos de un cierre de la piel abdominal externa con puntos interrumpidos utilizando suturas de aguja de corte inverso no absorbibles de monofilamento de nailon 4-0. A continuación, administre analgesia postoperatoria y coloque al ratón en una jaula sin cama a mitad de camino sobre una almohadilla térmica con monitorización hasta la recuperación completa. La transfección estable de las células Myc-CaP para la luciferasa de luciferasa de luciérnaga y la expresión de mCherry permite que los tumores de próstata sean seguidos por bioluminiscencia y fluorescencia no invasivas in vivo.Aquí se muestran tumores representativos diseccionados del abdomen el día 30 después de la inyección intraprostática. Con la técnica adecuada, el volumen y el peso del tumor se pueden registrar con un error estándar relativamente pequeño, aunque se espera cierta variabilidad entre las masas tumorales pequeñas y grandes. Las células cancerosas murino inyectadas por vía intraprostática también se pueden analizar mediante inmunohistoquímica para detectar la presencia de células T CD3 positivas infiltrantes del tumor u otras células inmunitarias de interés.Además, este modelo proporciona un criterio de valoración objetivo de supervivencia, ya que la gran masa tumoral primaria causa ascitis abdominal hemorrágica y/o disminución del acicalamiento de la deambulación y/o piloerección. La castración tres días después de la inyección intraprostática da como resultado una regresión tumoral robusta, seguida de una eventual recurrencia tumoral después de aproximadamente 30 días, representativo del cáncer de próstata resistente a la castración. La disección y el análisis histológico de los tumores de cáncer de próstata resistentes a la castración no revelan diferenciación neuroendocrina, ya que los tumores mantienen niveles altos de receptores de andrógenos y son negativos para el marcador neuroendocrino sinaptofisina.Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 20 a 30 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar administrar analgésicos pre y postoperatorios y realizar todas las cirugías con técnica estéril y con la ayuda de un asistente quirúrgico. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica, la citometría de flujo y la evaluación del volumen y el peso del tumor y la supervivencia de los animales para responder preguntas adicionales sobre las respuestas a las inmunoterapias y otras terapias experimentales.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inyectar células de cáncer de próstata en el lóbulo anterior de la próstata de ratones para una eventual castración quirúrgica y análisis de regresión y recurrencia tumoral. No olvide que trabajar con células cancerosas puede ser extremadamente peligroso y hay precauciones como usar el equipo de protección personal correcto, siempre se debe tomar mientras se realiza este procedimiento.

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Este video muestra un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que utiliza Matrigel para la administración celular localizada e imágenes de bioluminiscencia in vivo para el monitoreo no invasivo de la progresión tumoral. El modelo ortotópico es adecuado tanto para modelos singénicos como de xenoinjertos y podría utilizarse en ensayos preclínicos para investigar el impacto de nuevas terapias contra el cáncer en el crecimiento del tumor pancreático primario y la metástasis.

Modelo de ratón ortotópico bioluminiscente para cáncer de páncreas: una técnica no invasiva para monitorear la progresión del cáncer en ratones

En este video, demostramos el procedimiento para administrar la inyección intraprostática de células de cáncer de próstata en un modelo de ratón. Los modelos murinos ortotópicos se pueden utilizar para estudiar el origen de la enfermedad y la respuesta a las terapias de tratamiento en un entorno no invasivo y clínicamente relevante.

Inyección intraprostática de células cancerosas: una técnica para administrar células cancerosas para establecer un modelo ortotópico de cáncer de próstata en ratones

Para demostrar la imagen molecular del cáncer de MR con un pequeño péptido agente de contraste de MRI específica a las proteínas plasmáticas coagulados en estroma tumoral en un modelo de cáncer de próstata de ratón dirigido.

MR Imagen Molecular del cáncer de próstata con un agente de contraste dirigidos Pequeño Molecular CLT1 Péptido

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Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

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Este manuscrito describe los protocolos de próstata micro-disección y la castración quirúrgica en el ratón de laboratorio. También se representan los resultados representativos producidos por estos protocolos. Finalmente, se discuten las ventajas y utilización de estos protocolos.

Murino de próstata micro-disección y la castración quirúrgica

El cáncer de próstata es la segunda causa más común de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Un modelo ortotópico de cáncer proporciona un enfoque útil para comprender la biología del cáncer de próstata y evaluar la eficacia de los regímenes terapéuticos. Este protocolo describe los pasos detallados necesarios para establecer un modelo ortotópico de cáncer de próstata en ratones.

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

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Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección

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Presentamos un modelo de cáncer de mama Murino ortotópico y mastectomía radical modelo con tecnología de bioluminiscencia para cuantificar la carga del tumor para imitar la progresión del cáncer de mama humano.

Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino

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Aprende a crear un modelo ortotópico sinérgico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración mediante inyección intra-prostática en ratones. Esta técnica permite estudiar la respuesta tumoral a tratamientos en un microambiente clínicamente relevante.

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración (Video) | JoVE Journal

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

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