Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos
20 de abril de 2018
Aquí presentamos un método para un modelo humano en vitro de estiramiento lesiones en un formato de 96 pozos en una escala de tiempo pertinente al trauma de impacto. Esto incluye métodos para la fabricación de placas estirables, cuantificar el insulto mecánico, cultivo y lesionar las células, la proyección de imagen y alto contenido análisis para cuantificar daños.
El objetivo general de este modelo es crear un fenotipo de neurotrauma clínicamente relevante en un formato de 96 pocillos para facilitar la comparación eficiente y simultánea de las lesiones sufridas en múltiples condiciones experimentales. El objetivo principal de este modelo es permitir el descubrimiento de fármacos fenotípicos de alto contenido en neurotraumatismos, con neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las placas utilizadas en este modelo conservan la geometría de placa de 96 pocillos estándar de la industria, manteniendo su compatibilidad con la maquinaria de cribado de alto contenido existente, como los brazos robóticos y los microscopios automatizados.
Para comenzar, coloque una placa sin fondo de 96 pocillos, con la parte inferior hacia arriba, dentro de un limpiador de plasma de 200 vatios durante 60 segundos a alta potencia. A continuación, coloque la placa en 200 mililitros de 1,5% APTES recién preparado en agua desionizada, con la parte inferior hacia abajo, durante 20 minutos en una campana extractora. A los 10 minutos de la incubación, use pinzas para colocar una membrana de silicona tratada con plasma sobre un rectángulo de papel pergamino de 7,5 por 11 centímetros y alinee una losa de aluminio de 7,5 por 11,05 centímetros en la parte inferior de la abrazadera de fabricación de placas.
Luego, use pinzas para alinear la membrana de silicona y el papel pergamino en la losa de aluminio. Al final del período de recubrimiento, retire la placa sin fondo del baño APTES y sacuda el exceso de solución. Sumerja la placa sin fondo en dos baños consecutivos de agua desionizada de 200 mililitros durante cinco segundos cada inmersión y sacuda el exceso de agua.
Después de completar el secado con aire comprimido, coloque la placa sin fondo en la parte superior de la abrazadera de fabricación de placas y cierre suavemente la abrazadera para presionar la placa sin fondo y la silicona. Para alinear el bloque indentador, use abrazaderas de platina para asegurar la placa en la platina del dispositivo de estiramiento debajo de una cámara con transmisión en vivo y coloque una luz de domo sobre el dispositivo. Inicie el software de control de instrumentos en la computadora conectada al dispositivo de lesiones y haga clic en la ventana Iniciar para ejecutar el proyecto de neurotrauma in vitro.
Desde la ventana del proyecto, haga doble clic en los instrumentos virtuales de control de movimiento y seguimiento de posición. Cierre la jaula que rodea el dispositivo de lesiones y haga clic en la flecha en el instrumento virtual de control de movimiento para ejecutar el instrumento. Haga clic cerca de la parte inferior para bajar la platina a menos de dos milímetros del contacto con los indentadores, luego haga clic en detener para detener el instrumento virtual.
En la ventana del proyecto, haga clic con el botón derecho en Axis One y haga clic en Panel de prueba interactivo. Introduzca 500 unidades en el campo Posición de destino de la ventana que aparece para establecer el tamaño del paso en 50 micrómetros. A continuación, haga clic en Ir repetidamente, hasta que la placa haga contacto por primera vez con los indentadores, comprobando si hay contacto en la imagen en vivo mostrada por la cámara.
La posición vertical de la platina se informará en la parte superior izquierda de la ventana del panel de prueba interactivo. Baje la placa más hasta que cada pocillo haya hecho contacto con los indentadores, moviendo la cámara y la platina según sea necesario para ver toda la placa. Observe la posición vertical del escenario informada cuando todos los postes están en contacto y cierre el panel de prueba interactivo.
A continuación, ejecute el instrumento virtual de control de movimiento y haga clic en Arriba para elevar el escenario, utilizando el botón de parada para detener el instrumento virtual cuando el escenario esté en posición. Abra la puerta para desactivar el dispositivo, luego afloje el tornillo de posición en la esquina que hizo contacto primero para bajar la esquina y apriete el tornillo opuesto para levantar la esquina que hizo el contacto al final. Repita el bloque bajando, observando y ajustando hasta que la placa haga contacto con todos los indentadores simultáneamente.
La alineación cuidadosa del bloque del indentador es importante para lograr una lesión uniforme en todos los pocillos de la placa. Abra la puerta para desactivar el dispositivo nuevamente e inserte los tornillos de amarre en sus orificios en el bloque del indentador. A continuación, apriete los tornillos en su posición y observe la posición de la etapa informada por el panel de prueba interactivo cuando la placa hace contacto.
Para estirar la placa, cambie el nombre del archivo en el campo Ruta del archivo en el instrumento virtual de verificación de posición a un nombre de archivo único y haga clic en la flecha Ejecutar. Establezca la profundidad y la duración de la sangría y los campos Lesión y Duración de la lesión en el instrumento virtual del panel de control de movimiento. Con la placa en la posición cero, ejecute el instrumento virtual del panel de control de movimiento y haga clic en Lesionar para sangrar la placa.
Haga clic en Superior para mover la etapa hacia arriba, haga clic en detener cuando la placa esté en la posición superior y abra la puerta para desactivar el dispositivo de lesiones. A continuación, inspeccione el historial de desplazamiento de la etapa presentado en el instrumento virtual de seguimiento de posición para confirmar que se aplicó el desplazamiento máximo especificado y exporte los datos a un programa de hoja de cálculo adecuado. Para evaluar el estiramiento de la membrana de silicona, después del tratamiento con plasma, coloque la placa sobre una superficie blanda y cebe la pequeña protuberancia en un sello con tinta de un rotulador permanente.
Inserte el sello en el primer pocillo que se va a probar y golpee para asegurar una buena transferencia de tinta. Cuando se hayan estampado todos los pocillos, coloque la cámara de alta velocidad en un soporte de pluma sobre el dispositivo de lesiones con la lente ajustada al número F más pequeño para que el campo de visión contenga 12 indentadores en una cuadrícula de tres por cuatro. Con el lugar en la posición de punto cero, haga clic en el botón de grabación en el software de la cámara para que lea el disparador y encienda la luz axial difusa brillante.
A continuación, indentar la placa como se acaba de demostrar y apagar la luz axial. Para dañar un cultivo celular, agregue 100 microlitros de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos tratadas con laminina a cada pocillo de la placa tratada con plasma, y deje que las células se adhieran al fondo de la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de colocar la placa en la incubadora de cultivo celular. Después de dos o tres días de cultivo, sujete la placa en la etapa del dispositivo de lesión y ajuste la posición de la tapa para asegurar la placa sin exponer los cultivos al aire ambiente.
Luego, con la placa en la posición del punto cero, sangra la placa como se acaba de demostrar. Un cultivo óptimo sin lesiones tendrá pocos o ningún grupo de más de cinco células, y las neuritas serán individuales, largas, delgadas y curvas, con poco o ningún cordón. En condiciones ideales, la viabilidad de los cultivos debe acercarse mucho a la viabilidad especificada en la ficha técnica del fabricante, y los cultivos en silicona deben parecerse a los mantenidos en sustratos de cultivo rígidos convencionales.
El aumento de la densidad celular aumenta el número y el tamaño de los grupos que se forman en cultivo, mientras que el aumento de la concentración de laminina suele contrarrestar este efecto. En cultivos lesionados con una deformación máxima del 57%, cuatro horas después de la lesión, las neuritas están acortadas o faltan, y algunas tienen perlas con aglomeración demostrada por las células viables restantes. En particular, los tratamientos con laminina a dosis más altas reducen la gravedad de la lesión en los cultivos celulares de manera dependiente de la concentración, como lo demuestran los aumentos en la longitud de las neuritas y la viabilidad celular en los cultivos tratados con laminina en dosis más altas.
Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta los plazos de entrega. Por ejemplo, la desintoxicación de la membrana tarda tres días y las placas fabricadas deben curarse durante la noche antes de su uso. No olvide que el dispositivo de lesiones contiene una poderosa bobina móvil para impulsar su movimiento, y siempre se debe mantener alejado del dispositivo cuando está activo, y solo apagar el dispositivo cuando el escenario esté en la parte superior de su recorrido.
Resumen
Este estudio presenta un método para crear un modelo humano in vitro de lesión por estiramiento, utilizando un formato de 96 pocillos, relevante para traumatismos por impacto. El modelo permite ensayos de descubrimiento de fármacos fenotípicos de alto contenido mediante neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas, al posibilitar la comparación de lesiones bajo múltiples condiciones experimentales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Modelos In Vitro
Antecedentes
- El creciente interés en la investigación de neurotraumatismos requiere modelos eficientes para la selección de fármacos.
- Los modelos actuales pueden no replicar con precisión las condiciones de neurotraumatismo humano.
- Este método introduce un modelo clínicamente relevante para estudiar la lesión neuronal.
- La utilización de placas de 96 pocillos mantiene la compatibilidad con equipos de cribado de alto contenido.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo que imite el neurotrauma en un formato de alto rendimiento.
- Facilitar comparaciones de lesión neuronal entre diversos montajes experimentales.
- Acelerar el descubrimiento fenotípico de fármacos en la investigación del neurotrauma.
Métodos Utilizados
- El estudio emplea un modelo de cultivo celular en placas de 96 pocillos para simular lesiones por estiramiento.
- La lesión se induce mediante un dispositivo personalizado que aplica estrés mecánico.
- Se describen procedimientos detallados para la preparación de placas elásticas y el cultivo de neuronas humanas.
- La cuantificación de la lesión se realiza mediante imágenes y análisis de alto contenido.
Resultados Principales
- El modelo genera eficazmente una lesión uniforme en todos los pocillos.
- Se han establecido protocolos claros para la fabricación de placas y la cuantificación de lesiones.
- La aplicación de esta metodología permite la evaluación sistemática de las respuestas neuronales a la lesión.
- Los resultados respaldan la utilidad del modelo en estudios de cribado farmacológico y neurotrauma.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método sólido para replicar neurotrauma in vitro.
- La plataforma puede adaptarse para cribado de alto contenido con el fin de identificar posibles terapéuticas.
- Los hallazgos contribuyen a una mejor comprensión de los mecanismos de lesión neuronal y de los procesos reparativos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite el cribado fenotípico de alto rendimiento de terapias para neurotraumatismos mediante el uso de neuronas derivadas de iPSC humanas en un formato de 96 pocillos, abordando la brecha traslacional en el descubrimiento de fármacos para la lesión cerebral traumática (TBI). Al replicar perfiles de deformación mecánica clínicamente relevantes, facilita la desvinculación mecanicista y la confianza predictiva en la validación temprana de dianas. La plataforma se integra con la infraestructura existente de cribado de alto contenido, mejorando la preparación del ensayo y la eficiencia en la selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en sistemas neuronales humanos bajo condiciones controladas de lesión mecánica.
- Valor operativo: Proporciona métricas cuantitativas y reproducibles de lesión para la clarificación de vías y la reducción de riesgos en dianas terapéuticas.
- Valor estratégico: Apoya la confianza predictiva en la selección de dianas mediante la modelización de la fisiopatología humana del impacto en la cabeza cerrada.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera modelos estandarizados y escalables de lesión neuronal compatibles con flujos de trabajo automatizados de imagen y análisis.
- Valor operativo: Facilita la comparación simultánea de múltiples condiciones experimentales en 96 pocillos, optimizando el uso de reactivos y células.
- Valor estratégico: Permite cribados fenotípicos de alto contenido para la identificación de compuestos iniciales en el descubrimiento de fármacos para el tratamiento del neurotrauma.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante el uso de neuronas derivadas de humanos y dinámicas de lesión relevantes clínicamente.
- Valor operativo: Permite un rendimiento continuo del ensayo desde la confirmación de hits hasta la optimización de fármacos líderes, gracias a la inducción estandarizada de lesiones.
- Valor estratégico: Mejora la continuidad traslacional y reduce la variabilidad biológica en la toma de decisiones preclínicas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, permitiendo un cribado mecanicista antes del compromiso preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y el análisis de vías en neuronas humanas sometidas a estrés mecánico definido.
- Tamizaje: Ofrece preparación para ensayos, reproducibilidad y lecturas fenotípicas de alto contenido para la evaluación de compuestos.
- Analítica: Proporciona métricas cuantitativas basadas en imágenes de lesión que permiten comparaciones estadísticas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene la relevancia biológica mediante neuronas derivadas de iPSC humanas y perfiles de deformación alineados con aplicaciones clínicas.
- Reutilización Empresarial: Diseñado como una plataforma reutilizable, compatible con manipulación robótica y sistemas de microscopía automatizados.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la modelización de la fisiopatología humana y reducción de la ambigüedad mecanicista en neurotraumatismos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante formato de 96 pocillos y cuantificación automatizada del daño.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo de fracaso en fases avanzadas en programas de lesión cerebral traumática.
- Impacto en la cartera: Priorización y avance ajustados al riesgo basados en datos de respuesta al daño neuronal humano.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en diferenciación de células madre, cultivo neuronal y modelado de lesiones mecánicas.
- Acceso a equipos de tratamiento con plasma, dispositivos personalizados de indentación y sistemas de imagen de alta velocidad.
- Normalización de la preparación de membranas, siembra celular y ejecución del protocolo de lesión entre distintos equipos.
- Consideraciones para la adaptación a otros tipos celulares o perfiles de lesión más allá de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCNs) y la deformación equibiaxial.
- Las limitaciones prácticas incluyen los tiempos previos necesarios para la desintoxicación de las membranas y los requisitos de curado nocturno antes de su uso.
