Protocolo de aguda y crónica pruebas de ecotoxicidad de los killis turquesa Nothobranchius furzeri

El objetivo general de este experimento es estudiar los efectos de los tóxicos en el killi turquesa Nothobranchius furzeri. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecotoxicología, como los efectos a largo plazo de los factores estresantes en rasgos importantes de la historia de vida, ya sea el tiempo de maduración, el crecimiento o la fecundidad. La principal ventaja de este experimento es que utilizamos un vertebrado con un ciclo de vida muy rápido, lo que resulta en experimentos eficientes en tiempo y costo.

Estos killis son modelos ideales para estudiar el impacto de los efectos a largo plazo y multigeneracionales de los factores estresantes. En última instancia, contribuirán a una mejor comprensión del impacto ambiental de los tóxicos. Aunque este método puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los efectos combinados de los tóxicos y la temperatura, también se puede aplicar a otros factores estresantes como la radiación UV, la privación de alimentos y las alteraciones del PH.

Es difícil trabajar con killis, porque son un nuevo sistema modelo en ecotoxicología, y porque su sensibilidad a muchos contaminantes aún se desconoce. Desarrollamos la idea de este método experimental cuando nos enteramos por primera vez de la excepcional y corta vida útil de los killis y su capacidad para producir huevos inactivos que pueden almacenarse durante años en la estantería. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el tipo de experimento, así como el manejo de los individuos, pueden alterar los resultados.

Para empezar, seleccione huevos de gona ray zoo, o GRZ, en la etapa D3, que son reconocibles por la presencia de ojos dorados. Y use un par de pinzas suaves para transferirlos suavemente a un tanque de plástico de dos litros. Agregue un centímetro del medio de incubación a 12 grados centígrados y deje que la temperatura del agua se ajuste gradualmente a la temperatura ambiente.

Después de 24 horas, alimente a las crías con una dosis concentrada de nauplios de artemia recién eclosionados y aumente la profundidad del agua a cinco centímetros agregando medio para peces. 48 horas después de la eclosión, transfiera las larvas sanas y flotantes a recipientes individuales con medio de exposición y concentraciones de tóxico como se describe en el protocolo de texto. Cada mañana y cada noche, revise los peces para detectar mortalidad, estrés y enfermedad, y calcule los valores de CL50 de acuerdo con el protocolo de texto.

Realice una prueba de exposición crónica llenando recipientes individuales con el medio de exposición correcto y agregue un tubo de aire para airear el frasco. Transfiera el pescado a los frascos durante el resto del experimento. De dos a 23 días después de la eclosión o DPH, alimente a los peces con nauplios de artemia dos veces al día ad libitum.

Luego, después de suplementar con larvas de quironomus picadas hasta 37 DPH, use larvas de chironomus congeladas para alimentar a los peces ad libitum dos veces al día, todos los días, en adelante. Para determinar el crecimiento, mida el tamaño del cuerpo semanalmente, transfiriendo los peces a una placa de Petri llena de medio del depósito. Tome cuatro o cinco fotografías de vista dorsal calibradas por tamaño del pez a una altura fija.

Y utilizar un programa de medición espacial para analizarlos digitalmente. A partir de los 15 DPH, inspeccione visualmente la coloración del pez macho para determinar la maduración. Revise las aletas en busca de los primeros signos de coloración nupcial y use el día en que la coloración del puño fue visible como un indicador del tiempo de maduración del macho.

A partir de los 30 DPH, se controla la fecundidad instalando un tanque de desove de un litro para la pareja de machos y hembras maduros dentro de cada tratamiento, utilizando el medio de exposición del acuario del macho, y comppleméntelo con sustrato de desove. Transfiere tanto al macho como a la hembra al tanque de desove. Y mientras minimiza la actividad humana o las molestias alrededor de los contenedores de desove, permítales desovar durante dos horas.

Después, sin mezclar innecesariamente el agua, que haría que los huevos se arremolinaran en el sustrato de desove, transfiera suavemente los peces a sus contenedores de alojamiento originales. Filtre los huevos vertiendo el sustrato de desove sobre una malla de 500 micrómetros. Cuente los huevos y use una pipeta para transferirlos a turba húmeda en placas de Petri.

Retire los huevos muertos todos los días. Después de una semana, use una película de sellado para sellar la placa de Petri. Y almacenarlo en una incubadora a temperatura controlada a 28 grados centígrados, con un ciclo de luz a oscuridad de 14 a 10, para su desarrollo inmediato a la fase D3.

Para la conservación a largo plazo, almacene los huevos en oscuridad constante a 17 grados centígrados, momento en el que los huevos entran en la fase de latencia, y permanecen viables durante varios años. Para reclutar peces de los huevos latentes, transfiera los huevos a 28 grados centígrados y un ciclo de luz a oscuridad de 14 a 10, durante aproximadamente tres semanas, para permitir que se desarrollen a la fase D3. Para medir el máximo térmico crítico, o CT máx. de los peces adultos, comience con un baño de agua que circula continuamente, calentado a una velocidad constante de 0,33 grados centígrados por minuto.

Agregue varios acuarios de un litro, para cada pez individual. Comience el camino agregando los peces al acuario, cuando el agua haya alcanzado la temperatura experimental de cría de los peces. Utilice un termómetro digital para controlar la temperatura en los acuarios de un litro del baño CT max, cada cinco minutos.

Cuando el pez no logra mantener una posición vertical ventral dorsal, o comienza a temblar pesadamente, mida la temperatura en el acuario de un litro, que es la temperatura máxima crítica. Luego, transfiera el pez de regreso a su alojamiento experimental para su recuperación. Como se muestra en este gráfico, la exposición aguda de enfurzeri a diferentes concentraciones de cobre, causó un aumento en la mortalidad con el aumento de la concentración de tóxicos.

Los valores de CL50 disminuyen con el tiempo, lo que significa que con concentraciones decrecientes, pasa más tiempo antes de que el 50% de las réplicas mueran. En el ensayo de exposición crónica, utilizando cobre nacido en el agua, los peces son más cortos en longitud, medidos después de tres semanas cuando se crían a la concentración más alta probada. En este experimento utilizando clorpirifós o CPH transmitido por el agua, cuando se criaron a 28 grados centígrados, los peces produjeron menos huevos cuando se expusieron a la concentración más alta de CPF, sin embargo, a 30 grados centígrados, los peces de control produjeron más huevos que los peces expuestos a cualquiera de las concentraciones de CPF, lo que indica que la combinación de CPF y un aumento de la temperatura afectó la fecundidad más que cada factor estresante por separado.

Aquí se presenta la edad media en la que aparecieron los primeros signos de coloración en los machos enfurzeri, expuestos a la CPF a 28 y 30 grados centígrados. Después de la exposición a cuatro microgramos por litro de CPF, los peces machos tardaron un 18% más en madurar que los peces de control. La medición de la CT máx. de los peces criados a 24 o 28 grados centígrados y la exposición al contaminante 3, 4-DCA reveló que la natación errática, el aumento del movimiento opercular y la pérdida de la capacidad de permanecer en posición dorsoventralmente erguida, ocurrieron a una temperatura más baja cuando los peces se criaron a 24 grados centígrados.

Una vez dominado, este protocolo, incluidos los efectos sobre la fecundidad, se puede medir en dos meses. Para medir los efectos en todo el período reproductivo o incluso en una generación posterior, el protocolo se puede extender, pero aún se puede realizar en seis meses.