Name: Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprende a incorporar pericitos en un ensayo de brotación angiogénica in vitro usando células endoteliales y fibrinogel. Este método permite estudiar interacciones celulares heterotípicas en biología vascular.

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Agradecemos a los Drs. Victoria Bautch y Joshua Boucher para discusiones útiles y asesoramiento en la optimización de cuentas estándar brotación las condiciones analíticas y una brotación prueba de protocolo de tinción. S.H.A. fue apoyado en parte por una subvención de la Instituto Nacional de General médica Ciencias bajo concesión de GM007092 de 5T32.

Día 1:
1. transitorios de la transfección de las células endoteliales
<ol><li>Si lo desea, realizar una transfección transitoria de humano Umbilical vena Endothelial células (HUVEC) usando oligonucleótidos gene-regulatorios (por ejemplo micro-ARN o ARN interferente pequeño (siRNA)) y el reactivo lipofectamine apropiado según instrucciones del fabricante. Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito realizando inversas transfecciones con secuencias de siRNA personalizado y un reactivo de transfección comercial (véase tabla de materiales). Los autores no han probado otros protocolos de la transfección y reactivos con este ensayo. Los pasos para la transfección inversa utilizando los reactivos enumerados son los siguientes:</li>
	<li>Reconstituir el liofilizado siRNAs o microRNA (s) a una concentración de 20 μm en agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Hacer soluciones de transfección en la siguiente proporción: 1 mL de cualquier medios libres de suero con 9 μl de siRNA o microRNA.</li>
	<li>Agitar la solución y déjelo incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 18 μL de reactivo de transfección para la solución y agitar.</li>
	<li>Deje que la solución de incubar a temperatura ambiente durante 20-40 min, agitando la solución cada 10 a 15 minutos para la duración de la incubación.</li>
	<li>Mientras que la incubación de la solución de transfección, separar HUVEC con una solución de la separación de la célula (e.g., Accutase). Para un frasco de T175, lavar el matraz con 10 mL de fosfato tampón salino (PBS) y añadir 5 mL de solución de separación celular e Incube el frasco a 37 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio completo al matraz T175, retire la suspensión de células del frasco y centrifugar a 1200 rpm durante 3 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío y resuspender el precipitado de células en una densidad de 1 X 106 células / mL en EGM2. Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito usando medio de crecimiento celular endotelial (EGM2) que contiene el kit de bala estándar del factor de crecimiento, así como un 10% FBS.</li>
	<li>Una vez que la solución de transfección ha terminado de incubar, 1 mL de solución en una placa de 10 cm de la placa y agregar 1 mL de la suspensión HUVEC en la parte superior.</li>
	<li>Añadir un mL 7 adicional de medios completo para llevar el volumen final de la placa de 10 cm a 9 mL.</li>
	<li>Hacer al menos dos placas de 10 cm vale la pena de células para cada condición de transfección asegurar que se dispone de suficientes células para pasos posteriores en el ensayo. Nota: Estas condiciones resultan en una concentración final de trabajo de oligonucleótidos regulación gen de 20 nM. Los autores han encontrado estas condiciones para resultar en una caída de 60-80% de la expresión génica para sus objetivos de interés. Otros investigadores deba optimizar condiciones de transfección según sus necesidades experimentales.</li>
	<li>Intercambio de medios 4-6 h post añadir complejos de siRNA con medios mas frescos. Nota: Este protocolo fue desarrollado usando paso HUVEC 1-2.</li>
</ol>Día 2
2. capa de granos de la potencia con las células endoteliales
<ol><li>Reconstituir potencia granos (por ejemplo, 3 Cytodex) a una concentración de granos de 60.000/mL en PBS y autoclave. Nota: potencia los granos vienen en una concentración de aproximadamente 3 x 106 granos por gramo. Reconstituir los granos en una proporción de 20 mg de perlas por mL de PBS para obtener una densidad de grano de aproximadamente 60.000 cuentas/mL.</li>
	<li>Alícuota 1 mL de medio completo en el número de tubos de fluorescencia activada célula clasificación (FACS) de fondo redondo.</li>
	<li>Pipetear 20 μl de la suspensión de grano potencia en cada tubo (tenga cuidado de asegurar que la solución de grano bien serán suspendida antes de pipetear). Nota: Probablemente habrá dramática variabilidad en la concentración de trabajo final de granos presentes en una suspensión de grano potencia dada. Granos pueden adherirse fácilmente a las paredes de contenedores de plástico y vidrio que pueden alterar enormemente la concentración de grano en la solución. El volumen más adecuado de grano solución agregar al tubo FACS para cada lote de suspensión de grano potencia tendrá que ser determinado empíricamente por el investigador. Los números presentados aquí están destinados a servir más como punto de partida. Idealmente, deben optimizarse las condiciones por lo que hay incrustados en el gel de fibrina por pozo en la placa bien 24 al final del ensayo los granos 10-20. Vea discusión adicional en la sección de discusión abajo sobre optimización de números de cuentas para el ensayo.</li>
	<li>Separar transfected HUVEC 24 h post transfección mediante la solución de la separación de células como sigue:<ol>
<li>Lave cada placa de 10 cm de las células con 5 mL de PBS, añadir 2 mL de la solución de la separación celular e Incube las células a 37 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Resuspender las células a una concentración de 1 X 106 células/mL en los medios de comunicación completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 1 mL de la suspensión celular (es decir 1 X 106 HUVEC) a cada tubo de FACS que contiene granos.</li>
	<li>Frote suavemente los tubos FACS cada 20 min durante 4 h a 37 ° C (si proceder a paso 3.4) o 2.5 a 3 h (si procede al paso 3.2). Nota: Esta duración y frecuencia de agitación ha sido empírico determinado por investigadores anteriores que han optimizado el grano básico análisis de germinación. 4 Otras frecuencias de agitación y duración del paso de la capa de grano no ha sido probados por los autores.</li>
</ol>3. secuencial capa del pericitos en granos recubiertos de HUVEC potencia
<ol><li>Comenzar a separar las células 10T1/2 (pericitos) mediante la solución de la separación de la célula (tripsina) como sigue:<ol>
<li>Lavar un frasco T175 con 10 mL de PBS, luego añadir 5 mL de tripsina e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Resuspender 10T1/2 en una concentración de 2 X 105 células/0.5 mL en los medios de comunicación completa. Nota: Las células fueron compradas de la American Type Culture Collection (ATCC). Nota: 10T1/2 células en cultivo en medio esencial mínimo (MEM) habían suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de 2.5 a 3 h de agitar el grano + solución HUVEC, esperar 5 minutos para permitir que los granos y HUVEC flotante colocar en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Extraer 0,5 mL de medio completo de cada tubo, utilizando una pipeta P1000 y añadir 2 x 105 10T1/2 en media completa en un volumen de 0,5 mL a cada tubo de FACs. Agite la solución de la célula y el grano y luego continuar a incubar a 37 ° C. Seguir agitar cada 20 minutos hasta que los granos han sido agitados para un total de 4 h. Nota: La proporción de HUVEC 5: 1 pericyte en los granos es esencial para mantener pericyte adecuada cobertura de los vasos. Nota: Los siguientes pasos alternativos pueden seguirse en su lugar en este punto el protocolo:</li>
	<li>Agitar los granos y HUVEC sólo durante 4 horas.</li>
	<li>Una vez que las 4 h de la capa de HUVEC de los granos de la potencia, agitar los tubos una vez, espere 30-60 s, luego inmediatamente saque el tubo de FACS 1.5-1.75 mL de solución. Nota: Esto debe permitir tiempo suficiente para la mayoría de los granos para resolver mientras se eliminarán muchos HUVEC flotan libremente en los medios de comunicación.<ol>
<li>Añadir 2 X 105 10T1/2 en los medios de comunicación completa y llevar el volumen de la FACS tubo hasta 2 mL.</li>
		<li>Frote suavemente los tubos FACS cada 20 min durante una hora adicional.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez la agitación completa, suavemente agite los tubos una vez y quitar inmediatamente la solución entera (2 mL) y añadir a una placa de 6 cm. Añadir un adicional 3 mL de medio completo a cada plato y colocar las placas en la incubadora de 37 ° C durante la noche.</li>
</ol>Día 3
4. preparación de soluciones de Gel de fibrina
<ol><li>Preparar soluciones de trabajo de aprotinina en una concentración de 1 mg/mL en PBS y trombina 50 unidades/ml. Nota: Un amplio stock de cada una de estas soluciones puede ser hecho y almacenado a 4 ° C durante al menos un año.</li>
	<li>Hacer una solución fresca del fibrinógeno en una concentración de 2 mg/mL. Hacer suficiente solución para tener 2,5 mL de solución por el agitado tubo de FACS.<ol>
<li>Calentar la solución en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos permitir a todos el fibrinógeno en solución.</li>
		<li>Añadir 37.5 μl de solución de aprotinina por 1 mL de solución de fibrinógeno.</li>
		<li>Filtro estéril la solución y reservar a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. preparación de granos para el implante de Gel
<ol><li>Examinar los platos que contienen los granos recubiertos de potencia bajo el microscopio utilizando el objetivo 20 X para asegurar que todos los granos han sido suficientemente cubiertos por las células endoteliales.</li>
	<li>Pipetear enérgicamente la solución plateada de las células para separar de la placa de 6 cm y colocar la solución en un tubo. Lave la placa 2 veces más de X con los medios de comunicación completa y transferencia al tubo para recoger todos los granos residual que pueden ser adheridos a la placa.<ol>
<li>Evitar la introducción de burbujas de aire y utilizar una pipeta p1000 para minimizar el estrés de cizalla en los granos recubiertos de células endoteliales.</li>
		<li>Si evaluación de la eficiencia de precipitación de siRNA en las células endoteliales es necesario, en el paso 2, asegúrese de tener un plato de granos recubiertos sólo HUVEC. Durante este paso (5.2), separar los granos y recoger el residuo que HUVEC conectada a la placa para aislamiento de RNA y el análisis de qPCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esperar 3 minutos para permitir que los granos en la solución para colocar en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Eliminar tanto el sobrenadante como sea posible sin perturbar el sedimento de grano usando una punta de pipeta p1000 (no utilice un aspirador de vacío).</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio completo a cada tubo y resuspender los granos.</li>
	<li>Espere 30-60 s para permitir que los granos para instalarse en la parte inferior. Quite tanto el sobrenadante como posible utilizando una pipeta P1000 sin perturbar el sedimento de grano. No utilice un aspirador de vacío como la probabilidad de eliminar accidentalmente el sedimento de grano se incrementa considerablemente.</li>
	<li>Repita los pasos dos veces más de 5.5 y 5.6. El objetivo es eliminar tanto la HUVEC flotante que puede esté desconectada de la placa de 6 cm como sea posible, al no eliminar demasiados granos recubiertos de HUVEC, que deben instalarse en el tubo de FACS más rápidamente que las células flotan libremente.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio completo a los granos.</li>
</ol>6. incrustación cubrió los granos en un Gel de fibrina
<ol><li>Eliminar tanto los medios como sea posible sin perturbar el sedimento de grano en cada tubo, FACS utilizando una pipeta P1000.</li>
	<li>Resuspender los granos en 2,5 mL de solución de fibrinógeno.</li>
	<li>Pipetee 13 μl de solución de trombina en cada uno desea de una placa de 24 pocillos con fondo de cristal. Siembra en una placa con fondo de vidrio es esencial para permitir la proyección de imagen óptimo de los brotes. Nota: No deje sentado en un pozo de más de 5-10 min antes del siguiente paso de la trombina.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de solución de grano/fibrinógeno a cada pocillo.<ol>
<li>Cerciórese de agite la solución grano bien antes de pipetear la solución cada vez.</li>
		<li>Tenga cuidado al Pipetear cuidadosamente directamente a la trombina ya presente en el pozo. Pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces para mezclar bien la solución, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.</li>
		<li>Asegúrese de cambiar la punta de la pipeta entre pozos.</li>
		<li>Tener precaución para no mover o alterar la placa en cualquier punto durante la fibrina inicial coagulación, como cualquier movimiento puede alterar la formación del gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dejar la placa en el capó durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cuidadosamente, transferir la placa a una incubadora de 37 ° C para un adicional 1.5-2 h permitir que el gel solidifique completamente</li>
</ol>7. galjanoplastia fibroblastos sobre el Gel de fibrina
<ol><li>Durante los últimos 30 min de la solidificación del gel, separar fibroblastos de pulmón humanos normales (NHLF) como sigue:<ol>
<li>Lavar un frasco T175 de células con 10 mL de PBS, añada 5 mL de solución de separación celular e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Suspender NHLF a una concentración de 20.000 células/mL en los medios de comunicación completa. Nota: Las células NHLF pueden cultivarse con Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS y 1% penicilina estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL de la suspensión de células NHLF en el gel de cada pocillo de la placa y volver a colocar en la incubadora.</li>
	<li>Cambiar medios completo cada otro día durante la duración del ensayo.</li>
</ol>8. observar brotes en el transcurso de 2 a 7 días después de la implantación del grano en el gel de fibrina. La longitud de tiempo requerido para la germinación depende del pasaje y mucho número de HUVEC.
9. fijación del ensayo de germinación
<ol><li>Una vez ha ocurrido la germinación suficiente poder determinar una diferencia fenotípica entre grupos de tratamiento, lavar todos los pocillos uno con 2 mL de PBS.</li>
	<li>Agregar 0,5 mL de solución de separación celular en cada pocillo y colocar la placa en una incubadora de 37 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Retire la placa de la incubadora y toque los lados de la placa. Nota: El propósito de este paso es eliminar muchas de las células NHLF creciendo en la parte superior del gel de fibrina como sea posible facilitar la penetración del anticuerpo en el gel como la proyección de imagen del gel. El tiempo total de incubación con solución de separación celular puede necesitar ser ajustado para optimizar la eliminación de NHLF. Los investigadores se advirtieron no incubar el gel durante períodos excesivos de tiempo como la solución de la separación de células puede penetrar en el gel y comience a perturbar las estructuras endoteliales dentro.</li>
	<li>Una vez que han eliminado una cantidad suficiente de células NHLF, saciar la solución de la separación de células con 1 mL de medio completo.</li>
	<li>Aspirar la independiente NHLF y medios de comunicación utilizando un aspirador de vacío y lavar los pozos una vez con 1 mL de PBS.</li>
	<li>Añadir 300 μL de solución de paraformaldehído al 2% en PBS a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Retirar la solución de paraformaldehído al 2% y lavar cada pozo 3 veces con 1 mL de PBS durante 3 minutos a temperatura ambiente. Nota: Por favor, disponga de 2% paraformaldehído solución apropiadamente conforme a las directrices de salud ambiental y seguridad (EHS).<ol>
<li>Añadir 1 mL de PBS a cada bien y almacenar a 4 ° C hasta el momento la mancha o los brotes de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. tinción del ensayo de germinación
<ol><li>Añadir 300 μL de 0.5% Triton-X 100 en PBS a cada bien e incube durante 30 a 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizando un aspirador de vacío, retire X100 Triton y lavar 3 veces en PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Agregar 500 μl de solución a gel de bloqueo e incubar durante la noche a 4 ° C. Nota: La solución de bloqueo se compone de los siguientes componentes: 1% de albúmina sérica bovina (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 y antisuero 1% (uso de la misma especie de donde se derivan sus anticuerpos secundarios) en PBS.</li>
	<li>Eliminar la solución de bloqueo de cada pozo y agregar 300 μL de solución de tinción con anticuerpo primario a cada pocillo. Nota: La solución de tinción es el mismo como la solución de bloqueo, pero sin el antisuero presente. Los autores han tenido éxito incubar con anticuerpos primarios en diluciones de 1: 200 a 1: 400.</li>
	<li>Incubar los anticuerpos primarios en la coloración de la solución por 24 h a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirar solución de anticuerpo primario y lavar 3 veces en TBS con 0.5% tween 20 min a temperatura ambiente con el suave balanceo. Después del tercer lavado, reemplace con tampón de lavado fresco otra vez y almacenar a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Incubar con el anticuerpo secundario fluorescente diluido 1: 1000 en la coloración de la solución por 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Solución de tinción de anticuerpo secundario de quitar y lavar 5 veces de 20 minutos con TBS que contiene entre 0.5% a temperatura ambiente con el suave balanceo.</li>
	<li>Diluir la mancha nuclear en PBS e incubar durante una noche a 4 ° C. Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito con 1:10000 Hoechst diluido en PBS. Nota: No hay para quitar la solución de tinción nuclear antes de la proyección de imagen.</li>
	<li>Imagen en unos pocos días de terminar la tinción para captura óptima de la señal fluorescente.</li>
</ol>11. cuantificación del ensayo de germinación
<ol><li>Después de los brotes han sido reflejados, importar los archivos de imagen en ImageJ y utilice la herramienta de conteo para contar el número de brotes, o la herramienta de línea para medir longitudes de brote. Nota: Brotes se definen como protuberancias endoteliales con una longitud mayor o igual al diámetro del grano que están brotando. 11 longitud de brote puede medirse como la distancia desde el punto en que el brote comienza que sobresale desde el talón hasta la punta de los brotes. Promedio de brotes longitud por grano y número promedio de brotes por grano es parámetros útiles para evaluar los efectos fenotípicos de silenciamiento génico en brotación angiogénesis. El número promedio de granos que contienen al menos un brote por grupo de tratamiento también puede utilizarse como una medida para evaluar la robustez de las brotaciones.</li>
</ol>

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<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo presenta un método para la caracterización de las etapas complejas e interacciones celulares heterotípicos de brotación angiogenesis por lo que permite al investigador a emplear enfoques genéticos y proyección de imagen completa investigaciones mecanicistas. Cuando se realiza el ensayo, es esencial que eficiente recubrimiento endotelial de los granos ocurre durante la cuenta pasos de agitación. Pobre capa endotelial se hará evidente, si los granos no aparecen tienen una superficie áspera de la bola como de...

Angiogénesis es vital para la embriogénesis apropiado y la cicatrización de heridas, y también desempeña papeles claves en numerosas enfermedades incluyendo cáncer progresión1 y la arteria coronaria de la enfermedad. 2 , 3 tener una mejor comprensión de cómo se produce la angiogénesis en el desarrollo normal, y cómo se reactiva en contextos patológicos, es fundamental para el desarrollo de la novela, la terapéutica eficaz. Modelos fieles en vitro que recapitulan las etapas importantes y tipos de células implicados en la angiogénesis en vivo son necesarios para permitir que los investigadores mejor caracterizar los mecanismos moleculares conduce angiogénesis y hacer nuevos descubrimientos en la regulación endotelial.
Nakatsu y Hughes han optimizado un ensayo de grano brotes que han demostrado sufre el conocido muchas etapas de brotación angiogénesis. 4 , 5 el propósito del método presentado aquí es aprovechar el análisis optimizado por Nakatsu y Hughes con la incorporación de perictyes en el ensayo, para que las funciones paracrinas y juxtracrine de mural células en células endoteliales brotación pueden ser incorporadas en estudios de novela de la angiogénesis. Pericitos son células murales que se definen por su función como células que mantienen contacto físico con las células endoteliales debido a ser incrustados en la membrana basal vascular. 6 células endoteliales y pericitos participan en complejo la diafonía mediante vías incluyendo muesca de señalización señalización, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ y muchos otros. 7 , 8 modelos de ratón deficientes en estas vías de señalización demuestran pericyte pobre cobertura del desarrollo de la vasculatura en la embriogénesis, conduce a la remodelación vascular pobre y disfuncional vasculatura. 7 además, el papel del pericitos en la angiogénesis patológica es importante pero a menudo subestimada. Por ejemplo, una característica única de la vasculatura del tumor es que los vasos son más inmaduros, con fugas y disfuncional debido a la pobre pericyte cobertura. 9 se ha propuesto que la presencia o ausencia del pericitos dramáticamente afecta el fenotipo de los vasos sanguíneos tumorales y es un importante mediador de las respuestas a las terapias antitumorales y antiangiogénicos. 9 así, incluyendo el papel del pericitos en ensayos en vitro es clave captar más completamente los mecanismos importantes de regulación endotelial.
Aunque hay muchos ensayos in vitro y ex vivo actualmente empleados para estudiar la angiogenesis, hay defectos a considerar en cada uno. Algunos, como la proliferación endotelial y ensayos de migración endotelial, son excesivamente simplificados y se centran en una función endotelial en un entorno aislado en cultivo de tejidos de plástico. 10 otros ensayos ocurren en un entorno (3D) tridimensional 3 más, como el ensayo de formación de tubo de Matrigel,10 pero estos ensayos son todavía excesivamente y centran más en la capacidad de las células endoteliales migran y forman de novo vascular estructuras, en lugar de brotar de la vasculatura preexistente. Además, ninguno de estos ensayos incorporan tipos celulares mural. Hay ex vivo la modelos tales como el ensayo de aorta anillo que incorporan pericitos presentes en el órgano anfitrión, pero manipulación genética de estos modelos es mucho más difícil debido a la necesidad de generar modelos transgénicos o knockout del ratón de la rutas de interés. El grano del ensayo de germinación es ideal porque modelos brotación endotelial, proliferación, migración y formación incluso anastomosis y lumen en una matriz 3D. 4 el ensayo fielmente permite evaluación mecanicista de las muchas diferentes etapas de rebrote, permitiendo aún la modificación genética directa del pericitos en un entorno más controlado o de las células endoteliales. Los coágulos de fibrina que contiene los granos brotes pueden fácilmente fijarse, manchados y reflejados en las diferentes etapas de brotación; Estos brotes pueden también colocarse en una cámara de proyección de imagen vivo para realizar la proyección de imagen en tiempo real de las brotaciones. La metodología presentada aquí es ideal para el estudio de mecanismos básicos de la angiogénesis en fenotipado de profundidad y un análisis exhaustivo de las vías que se activan durante la angiogénesis.

<table><tbody><tr><td>Puntas de pipeta estériles</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>HUVEC Media</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>11095114 10T1/2 Media</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>NHLF</td></tr><tr><td>Media PBS de grado de cultivo de tejidos</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Sin magnesio ni calcio</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Para el levantamiento HUVEC</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Life Technologies</td><td>15050065</td><td>Para el levantamiento de 10T 1/2 y NHLF</td></tr><tr><td>Customs siRNAs</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>10T 1/2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHLF</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 3 microportadores</td><td>Sigma</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 y 10 cm recubiertas de cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma</td><td>t9549</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>a3428</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de fondo redondo</td><td>Incubadora</td> y campana de cultivo de tejidos Corning <td></td><td></td></tr><tr><td>Placas</td> con fondo de vidrio de 24 pocillos MatTek P24G1.513F Las placas con fondo de vidrio solo se necesitan si se van a obtener imágenes de los brotes.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> De lo contrario, el plástico para cultivo de tejidos también es aceptable.</td></tr><tr>Dispositivo <td></td><td></td><td></td>de <td>filtración estéril</td></tr></tbody></table>

incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogénesis es la formación de nuevos vasos de vasculatura preexistente y es un componente importante de muchos procesos biológicos, incluyendo la embriogénesis y desarrollo, la cicatrización de heridas, crecimiento tumoral y metástasis y enfermedades oculares y cardiovasculares. Se necesitan modelos eficaces en vitro que recapitulan la biología de la angiogénesis adecuadamente este proceso de estudio e identificar mecanismos de regulación que pueden ser objeto en definitiva de nuevas estrategias terapéuticas. El análisis de la angiogénesis de grano ha demostrado previamente para recapitular las etapas múltiples de brotes endoteliales in vitro. Sin embargo, una limitación de este ensayo es una falta de endotelial – interacciones célula mural, que son fundamentales para la regulación molecular y fenotípica de células endoteliales función en vivo. El protocolo aquí presenta una metodología para la incorporación de las células murales en el ensayo de grano angiogénesis y muestra una asociación estrecha de las células endoteliales y pericitos durante brotación in vitro. El protocolo también detalla una metodología eficaz silenciamiento de genes de la blanco usando siRNA en las células endoteliales para estudios mecanísticos. En conjunto, este protocolo proporciona un análisis en vitro que más apropiadamente modelos de los tipos de células distintos implicados en brotes de angiogénesis y proporciona una plataforma más fisiológicamente relevantes para la evaluación terapéutica y nuevo descubrimiento de mecanismos de regulación de la angiogénesis.

Este protocolo permite una estrecha asociación de la dos celda tipos in vitro, y la presencia del pericitos complementa la ocurrencia de brotes (figura 1A, B). El protocolo también permite la eficaz silenciamiento (p. ej. mediante ARN de interferencia) de un gen de interés en un tipo de células de interés como (VEGFA específicamente en las células endoteliales) o PDGFRβ en pericitos7,<sup c...

Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.

Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

El objetivo general de este ensayo es incorporar interacciones celulares heterotípicas in vitro que encapsulen la complejidad de la angiogénesis in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular sobre la importancia de las interacciones de las células endoteliales de los pericitos durante la angiogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que integra las diferentes etapas de la angiogénesis germinal, incluyendo la proliferación, la migración y la anastomosis, permitiendo el estudio de las interacciones de los pericitos de las células endoteliales.Comience reconstituyendo las perlas microportadoras a una concentración de seis veces 10 a la cuarta perlas por mililitro en PBS, seguido de la esterilización en autoclave de la suspensión de perlas microportadoras. A continuación, alícuota un mililitro de medio completo en el número apropiado de tubos de clasificación de células activadas por fluorescencia de fondo redondo, o FACS, y agregue 20 microlitros de suspensión de perlas de microportadores esterilizadas en autoclave y enfriada a temperatura ambiente a cada tubo. Agregue un mililitro de células a cada tubo.Agite los tubos e incube los tubos a 37 grados centígrados durante 2 1/2 a tres horas con agitación suave cada 20 minutos. Al final de la incubación, descanse las células en perlas a temperatura ambiente durante cinco minutos para permitir que las celdas y las perlas se asienten en el fondo de los tubos. A continuación, utilice una pipeta P1000 para sustituir 0,5 mililitros de medio de cada tubo por dos pericitos de 10 a la quinta y 0,5 mililitros de medio completo.Agite la suspensión de perlas y devuelva las celdas a la incubadora a 37 grados centígrados con agitación suave cada 20 minutos hasta que las perlas se hayan agitado durante un total de cuatro horas. Al final de la incubación, agite suavemente los tubos por última vez e inmediatamente transfiera todo el volumen de dos mililitros de solución de cada tubo a placas individuales de seis centímetros. Luego, agregue tres mililitros adicionales de medio completo a cada placa e incube las placas a 37 grados centígrados durante la noche.A la mañana siguiente, examine las placas de perlas recubiertas de microportadores bajo el microscopio con un aumento de 20 veces para confirmar que todas las perlas han sido suficientemente recubiertas por las células endoteliales. Transfiera las placas a una campana de flujo laminar y utilice una pipeta P1000 para aspirar y dispensar enérgicamente las soluciones de perlas recubiertas para separar las células de los fondos de las placas y transferir los sobrenadantes a tubos individuales. Deje que las cuentas se asienten en la parte inferior de los tubos durante tres minutos.A continuación, utilice la pipeta P1000 para eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadantes sin alterar los grupos de perlas. Vuelva a suspender las cuentas en un mililitro de medio completo por tubo y deje que las cuentas se asienten durante 30 a 60 segundos. Utilice la pipeta P1000 para aspirar de nuevo el sobrenadante y lave las células endoteliales que flotan libremente de la suspensión de perlas con medio completo fresco dos veces más, como se acaba de demostrar.Después del tercer lavado, vuelva a suspender las perlas en 2,5 mililitros de solución de fibrinógeno. Agregue 13 microlitros de solución de trombina por pocillo en una placa de 24 pocillos con fondo de vidrio. A continuación, añada 0,5 mililitros de la solución de fibrinógeno de perlas a cada pocillo, teniendo cuidado de pipetear cuidadosamente las perlas directamente en la trombina, y pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces para mezclar bien las soluciones.Cuando se hayan sembrado todos los pocillos, deje que la solución de trombina-fibrinógeno se coagule en la campana de flujo laminar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, transfiera con cuidado la placa a una incubadora de 37 grados centígrados durante 1,5 a dos horas adicionales. Cuando el gel se haya solidificado completamente, vuelva a suspender los fibroblastos pulmonares humanos normales a una concentración de dos veces 10 a la cuarta células por mililitro en medio completo, y agregue un mililitro de fibroblastos a cada pocillo.A continuación, devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares. El cumplimiento estricto del protocolo de recubrimiento dará como resultado cuentas recubiertas de células con una apariencia rugosa, similar a una pelota de golf, como se ilustra en esta imagen representativa de cuentas suficientemente recubiertas que están listas para la implantación de gel de fibrina. Además, este protocolo facilita una estrecha asociación de los dos tipos de células in vitro con la presencia de los pericitos que complementan la aparición de brotes.Al intentar este procedimiento, es importante recordar cubrir completamente las perlas con células durante los pasos de agitación, y incrustar cuidadosamente las perlas en el gel de fibrina sin introducir burbujas durante la implantación del gel. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros análisis, como los estudios de angiogénesis en ratones, para responder a preguntas adicionales, como ¿cuál es la relevancia in vivo de los mecanismos y fenotipos explorados en el ensayo de germinación de perrocitos in vitro? Esta técnica será útil para los investigadores en el campo de la biología del cáncer y para explorar las interacciones y funciones del pericito de las células endoteliales en un modelo in vitro de angiogénesis más relevante fisiológicamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el protocolo de un ensayo de angiogénesis in vitro que recapitula varias etapas de la angiogénesis. Time-lapse imágenes de germinación, la formación del lumen, ramas y anastomosis - las características clave de la angiogénesis - se muestran.

Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis

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Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

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Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Aprende a incorporar pericitos en un ensayo de brotación angiogénica in vitro usando células endoteliales y fibrinogel. Este método permite estudiar interacciones celulares heterotípicas en biología vascular.

Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

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