Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel

El objetivo general de este experimento es generar bibliotecas de secuenciación de próxima generación a partir del ADN y el ARN de pequeñas poblaciones de células sin dividir la muestra en ningún punto. Este método proporciona a los investigadores un nuevo enfoque para estudiar las variaciones estructurales del ADN en la expresión de genes. Cuando pensamos por primera vez en Gel-seq, no había protocolos para secuenciar simultáneamente el ADN y el ARN de la misma muestra.

Afortunadamente, ahora hay tres enfoques publicados que resuelven este problema. La principal ventaja de esta técnica es que tanto la información genómica como la transcriptómica se pueden obtener del mismo conjunto de células con un coste añadido insignificante. Gel-seq se desarrolló originalmente con casetes verticales, sin embargo, este protocolo se puede adaptar para trabajar con cualquier casete de electroforesis en gel estándar.

Prepare el relleno, las mezclas precursoras de alta densidad y baja densidad en tres tubos. Agregue los reactivos en el orden descrito y agite la mezcla. No agregue prematuramente APS o Temed.

Espere hasta que se le indique. A continuación, desgasifique cada solución de monómero en gel insertando primero una aguja a través de la tapa. A continuación, conecte la aguja a una línea de vacío doméstica y sumerja este conjunto en un baño ultrasónico.

Espere aproximadamente un minuto hasta que no salgan más burbujas del líquido. A continuación, a la mezcla de precursores de relleno, agregue el Temed y el APS y el vórtice brevemente. En tres minutos, use una pipeta de un milímetro para agregar seis milímetros a cada casete de gel sin derramar.

Asegúrese de que el fluido esté nivelado colocando los casetes en posición vertical sobre una mesa nivelada. Luego, llene gradualmente los casetes con agua ionizada desgasificada, teniendo cuidado de minimizar la mezcla de polimerización con el agua. Luego, deje que el polímero se cure durante una hora o toda la noche.

Una vez que el polímero esté curado, vierta la capa de agua y, a seis pulgadas de distancia, use un chorro suave de aire comprimido para secar la superficie del gel. A continuación, agregue Temed y APS al precursor de gel de alta densidad y vórtice brevemente. En tres minutos, transfiera 320 microlitros a cada casete y extiéndalo sobre la capa de gel de relleno balanceando el casete hacia adelante y hacia atrás varias veces.

Luego, rellene los casetes con agua desionizada y desgasificada y deje que el polímero se cure durante aproximadamente una hora. Una vez curado, seca el polímero como antes. Finalmente, agregue Temed y APS a la mezcla de precursores de gel de baja densidad y vórtelo.

Luego, llene rápidamente el resto de los casetes con esta mezcla e inserte los peines de gel antes de que comience a curarse. Ahora, agregue el exceso de precursor de reserva sobre el peine para que se adsorba durante la polimerización. Después del curado, el casete está listo para su uso.

Después de convertir el ARN en ADNc, use un gel para recuperar la fracción de interés. En primer lugar, limpie a fondo la cámara de electroforesis con varios mililitros de un producto de eliminación de ADN y una toallita sin pelusa. Luego, llene la cámara con XTBE limpio de punto cero cinco y coloque todo el aparato en un horno de reticulación UV de 254 nanómetros y esterilice durante 15 minutos.

Ahora, inserte un casete Gel-seq en la cámara de electroforesis y bloquéelo en su lugar. A continuación, retire lentamente el peine de gel tirando suavemente hacia arriba sin rasgar el gel. Ahora, cargue las muestras con una pipeta.

Inserte completamente la punta en los pocillos cuando cargue muestras para minimizar la posibilidad de contaminación entre pocillos. Aplique un campo eléctrico de 250 voltios a través del casete Gel-seq durante 30 minutos para separar el ADNg de los híbridos ADNc/ARN. Después de cargar, correr y recolectar el gel, use un bisturí para cortar el gel por la mitad, justo debajo de la capa de alta densidad, y deseche la mitad del gel de relleno.

A continuación, despegue suavemente el gel restante del casete utilizando con cuidado una herramienta de raspado. Después de verificar la separación con un documento de gel, use un transiluminador para extirpar las bandas. El ADNg debe estar ubicado al comienzo del gel de baja densidad, y el ADNc debe estar en la interfaz de las regiones de baja y alta densidad.

Ahora, usa un bisturí para cortar las regiones del gel que contienen ADNg y ADNc. Elimine también las mismas secciones del carril de control negativo. Con pinzas desafiladas, transfiera suavemente las secciones del gel a tubos de tira.

Si el gel se rompe, busque y transfiera todas las piezas rotas al tubo. A continuación, triture cada gel con movimientos circulares y presione con la punta de una pipeta. Antes de retirar las puntas, añada 40 microlitros de agua sin nucleasas al ADNg y 80 microlitros a las muestras de ADNc.

Luego, retire con cuidado y deseche las puntas. Ahora, asegure los tubos de tira a un mezclador de vórtice a 37 grados centígrados y agítelos durante ocho a 12 horas. De este modo, el ADN se escapará del gel.

Después de agitar, pipetee las muestras en una placa de filtro de malla de ocho micras. A continuación, gire la placa a 2.600 g durante cinco minutos para colar los fragmentos de gel. A continuación, levante la placa de filtro de malla de la placa de la carcasa y utilice una pipeta para transferir las muestras sin gel de la placa a los nuevos tubos de tiras de 200 microlitros.

A cada muestra que contenga ADNg, agregue un microlitro de proteasa y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Luego, incube las muestras a 50 grados centígrados durante 15 minutos. Siga con una activación de calentamiento a 70 grados centígrados durante 15 minutos.

Este paso de agotamiento de nucleosomas es crítico. A continuación, utilice una aguja de calibre 18 para hacer un agujero en la tapa de cada tubo de muestra. Luego, use una aspiradora para reducir las muestras de ADNg a cinco microlitros y las muestras de ADNc a 10 microlitros.

Si el volumen cae por debajo del objetivo, agregue agua sin nucleasa según sea necesario. Los híbridos de ADNg y ADNc/ARN se separaron físicamente utilizando el dispositivo Gel-seq. El control negativo no tiene autofluorescencia del gel en las interfaces.

Las escaleras de ADN muestran solo una banda oscura en la interfaz entre las membranas de baja y alta densidad, lo que revela que pequeños fragmentos pueden pasar a través del gel de baja densidad. Una muestra biológica de 500 células PC3 muestra la separación deseada de ADN genómico e híbridos de ADNc/ARN. Una banda oscura en la parte superior de la membrana de baja densidad es ADN genómico a escala de megabase, mientras que los híbridos ADNc/ARN se apilan en la interfaz de las regiones de baja y alta densidad.

Los pequeños fragmentos de pares de bases sub-100 son productos fuera del objetivo generados a partir de oligonucleótidos cebadores durante la transcripción inversa y son de esperar. Las bibliotecas se generaron a partir de 500 células PC3 o 750 células HeLa. Las distribuciones de fragmentos de las bibliotecas coincidentes generadas a partir de Gel-seq se compararon con muestras no coincidentes generadas con protocolos estándar.

La distribución de los fragmentos de nucleótidos fue similar con ambos métodos. Los resultados de la secuenciación de la biblioteca de células PC3 se compararon con los métodos tradicionales. Se compararon las variaciones en el número de copias de todo el genoma.

Estadísticamente, los dos métodos obtuvieron resultados similares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar bibliotecas de secuenciación de próxima generación emparejadas para ADN y ARN a partir de la misma muestra inicial. Al igual que con cualquier experimento de secuenciación de baja entrada, es imperativo recordar mantener un entorno de trabajo limpio.

Debe prestar mucha atención a la esterilización de los tubos y a los guantes de limpieza. Incluso con estas precauciones, los experimentos ocasionalmente fracasan debido a la contaminación. Una nota importante, la ubicuidad y seguridad de los geles de poliacrilamida hace que sea fácil olvidar que los precursores de fabricación son neurotoxinas peligrosas.

Siempre debe trabajar con estos reactivos en una campana extractora y limpiar inmediatamente cualquier derrame. Diseñamos Gel-seq para que sea fácil de implementar para los investigadores en sus propios laboratorios, y esperamos que esto facilite la rápida adopción de esta tecnología.