Name: Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende a preparar bibliotecas de secuenciación de DNA y RNA simultáneamente con Gel-seq utilizando matrices de hidrogel. Este método permite estudiar variaciones estructurales del genoma y su impacto en la expresión génica desde pequeñas poblaciones celulares.

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Fondos para este trabajo fue proporcionado por la Universidad de San Diego, el programa nacional de ciencia Fundación postgrado investigación beca, concesión de NIH R01-HG007836 y por el Ministerio Coreano de la ciencia, TIC y planeación de futuro.
Versiones anteriores de varias figuras fueron publicadas primero en "Hoople, G. D. et al. Gel-seq: todo el genoma y transcriptoma ordenando por la simultánea baja ADN y ARN biblioteca preparación utilizando barreras semipermeables hidrogel. Laboratorio en un Chip 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Laboratorio en un Chip ha sancionado la reutilización de figuras en esta publicación.

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</ol>

KZ es cofundador y asesor científico de Singlera Genomics Inc.

Hay varios pasos críticos asociados con la fabricación de dispositivo seq Gel así como el propio protocolo. Durante la fabricación, recomendamos a partir de los espesores de capa prescritos para las distintas regiones del gel. Pasamos mucho tiempo prueba opciones de fabricación diferentes y el protocolo descrito aquí produce los mejores dispositivos para los cassettes enumerados en la tabla de materiales y reactivos. Si los investigadores utilizan un sistema de cassette alternativos, pueden encontrarlo n...

Próxima generación sequencing (NGS) ha tenido un impacto profundo en la manera en que se lleva a cabo la investigación genética. Cuando los investigadores se centraron una vez en secuenciar el genoma de una especie entera, ahora es posible secuenciar el genoma de un solo tumor o incluso una sola celda en un experimento. 1 NGS también ha hecho rentable a los transcritos de RNA encontrados dentro de una célula, un conjunto de datos conocidos como el transcriptoma de la secuencia. La capacidad de amplificar y la secuencia de DNA o RNA de pequeñas muestras partidas sólo se ha logrado en los últimos cinco años. 2 , 3 , 4 Desafortunadamente, protocolos estándar son incompatibles y los investigadores deben optar por la secuencia de DNA o RNA de una muestra determinada. Cuando una partida muestra es suficientemente grande, puede dividirse por la mitad. Sin embargo, en escalas más pequeñas, pérdida de material debido a la división de las muestras puede afectar la calidad de la biblioteca, y puesta en común de las muestras puede promedio de variaciones interesantes entre las células. 5 además, los investigadores están cada vez más interesados en el examen de las muestras que no pueden dividirse, como las células o las biopsias de pequeño tumor heterogéneo. 6
Para resolver este problema, tres protocolos recientemente se han desarrollado para la secuencia de ADN y ARN de la misma muestra partida: Gel-seq7, G &amp; T-seq8y DR-seq9. Este artículo presenta un protocolo detallado para Gel-seq, que puede utilizarse al mismo tiempo generar bibliotecas de ADN y ARN desde tan sólo 100 células en el insignificante costo adicional. El aspecto novedoso de Gel-seq es la capacidad para separar el ADN y el ARN basado exclusivamente en el tamaño utilizando matrices de hidrogel de bajo costo. La innovación principal del protocolo Gel-Seq es la separación física de la DNA del RNA. Esta separación se logra utilizando electroforéticamente una combinación de membranas de poliacrilamida que se aprovechan de las diferencias de tamaño entre estas moléculas. Para poner estas diferencias de tamaño en contexto, considerar cómo son imágenes de ADN y ARN: ADN existe en la escala de micrones y puede verse con los microscopios tradicionales, ARN existe en la escala de nanómetros y debe ser reflejada mediante técnicas complejas como cryo-electrón microscopia. 10
El enfoque a la separación de ADN y ARN en este protocolo se muestra en la figura 1. El panel izquierdo muestra ADN y ARN liberan flotando en la solución cerca de una membrana. Cuando se aplica un campo eléctrico, como se muestra en el panel derecho, DNA y RNA experimentan una fuerza electroforética que induce la migración a través de la membrana. Ajuste las propiedades de la membrana, hemos creado una membrana semipermeable que separa el ADN del ARN. Las moléculas de ADN son empujadas contra la membrana, pero se enredaron en el borde debido a su gran tamaño. Pequeñas moléculas de ARN, por otra parte, pueden reconfigurar y tejer su camino a través de la membrana. Este proceso, conocido como reptation, es similar a la forma de que una serpiente se mueve a través de la hierba. Eventualmente estas moléculas de RNA son detenidas por una segunda membrana alta densidad que es demasiado difícil para los polímeros más pequeños (&gt; 200 pares de bases) a retorcerse a través. Una vez separadas físicamente, ADN y ARN pueden recuperado y procesado para generar información sobre el genoma y el transcriptoma. Mientras que podemos separar el ADN y el ARN, hemos encontrado mejores resultados se obtienen si el ARN es revés transcrito a cDNA antes de la separación. Los híbridos de ARN cDNA son más estables que el RNA solo y todavía pueden pasar a través de la membrana de baja densidad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig1.jpg"> Figura 1 . Principio de funcionamiento de gel-seq. El principio subyacente que se utiliza para separar físicamente los ADN y ARN. En un campo eléctrico aplicado, las moléculas de ARN pequeñas migran a través de la membrana baja densidad pero grandes moléculas de ADN están atrapadas en la superficie. Esta figura fue reproducida de ref. 7 con permiso de la Real Sociedad de química. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Este documento describe en detalle tanto la fabricación del dispositivo de Gel-seq y el protocolo biológico para generar emparejado bibliotecas de DNA y RNA. Un resumen de ambos se muestra en la figura 2. El dispositivo es fabricado por capas tres diferentes densidades geles de poliacrilamida uno encima del otro en un proceso similar a la creación de geles de apilamientos estándar. 11 el protocolo biológico comienza con 100-1000 células suspendidas en PBS. Las células son sometidas a lisis y el ARN se convierte en ADNc antes de que el dispositivo se utiliza para separar el ADN genómico de los híbridos de ARN cDNA. Después de la separación y recuperación, genómico y transcriptómicos bibliotecas son preparadas mediante un proceso que sigue de cerca el protocolo de kit de preparación de biblioteca estándar de todo el genoma. Mayores detalles sobre el desarrollo y validación de Gel-seq se pueden leer en el laboratorio en una publicación de Chip "seq Gel: todo el genoma y transcriptoma ordenando por la simultánea baja ADN y ARN biblioteca preparación utilizando barreras semipermeables hidrogel ." 7 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57315/57315fig2.jpg"> Figura 2 . Protocolo de gel-seq. Un resumen de los pasos para fabricar el dispositivo de Gel-seq y el protocolo generados bibliotecas pares de ADN y ARN. Porciones de esta figura fueron reproducidas de 7 Ref. con permiso de la Real Sociedad de química. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57315/57315fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para generar bibliotecas de ADN y ARN de las células, los investigadores deben considerar el uso de G &amp; T-seq o siguientes Dr. G &amp; T-Seq, como Gel-seq, se basa en una separación física del ARN de la DNA genomic. Este enfoque se basa en ARN mensajero (ARNm) 3′ cofia cola como Diana abatible. El mRNA es capturado en una tira magnética utilizando una cartilla de oligo-dT biotinilado. Una vez que el ARNm se ha capturado las cuentas se sujetan con un imán y el sobrenadante que contiene el ADN genómico se puede quitar y transfirió a otro tubo. Después de esta separación física es completa, se pueden generar bibliotecas separadas del mRNA y de ADN. 8 este enfoque funciona bien si el ARN de interés es la cofia, sin embargo no puede utilizarse para el estudio de transcripciones no cofia, como ARN ribosomal, tRNA o ARN de procariotas.
DR-seq se basa en un paso de amplificación previa donde se amplifican ADN y ADNc derivado del RNA en el mismo tubo. La muestra es entonces dividida en dos y procesada paralelamente preparar bibliotecas de DNA y RNA-seq. Para distinguir entre ADN genómico y cDNA derivada del RNA, DR-seq tiene un enfoque computacional. Secuencias que están presentes sólo los exones computacionalmente se suprimen en los datos de ADN genómicos, como los pudieran haber originado de DNA o RNA. 9 una ventaja de este enfoque es que el DNA y cDNA del ARN necesitan no ser físicamente separados como se hace en Gel-seq y G &amp; T-SS. El inconveniente, sin embargo, es que DR-seq requiere un conocimiento a priori del genoma y transcriptoma (es decir, exons y introns), puede no ser ideal para aplicaciones como secuenciación de núcleos, en que muchas transcripciones no son aún completamente empalmado y todavía contienen intrones. 12
El aspecto novedoso de Gel-seq es la capacidad para separar el ADN y el ARN en cientos de células basadas exclusivamente en el tamaño. Este método requiere de ningún conocimiento a priori del genoma o transcriptoma, es robusta contra empalme incompleto y no se limita a las transcripciones de poli-adenylated. Para aplicaciones donde un investigador puede comenzar con por lo menos 100 células, seq Gel proporciona un enfoque sencillo utilizando materiales baratos y extensamente disponible.

<table><tbody><tr><td>Reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida Monómero</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887-100G</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Referido en el texto como perlas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI)</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Referido en el texto como tinte de carga 6X</td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Kits qRT-PCR de un solo paso</td><td>Kapa BioSystems</td><td>7959613001</td><td>Referido en el texto como 2X qPCR mix</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methylenebis(acrylamida)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072-100G</td><td>También conocido como bis-acrilamida Kit de</td></tr><tr><td>preparación de la biblioteca de ADN NexteraXT (referido en el texto como kit de preparación de la biblioteca)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Incluye: TD (referido en el texto como tampón de transposasa), ATM (referido en el texto como transposasa), NT (referido en el texto como tampón de parada de transposasa) y NPM (referido en el texto como mezcla de PCR de preparación de biblioteca)</td></tr><tr><td>Agua</td> <td>libre de nucleasaMillipore</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit (referido en el texto como kit de amplificación de transcripción completa (WTA)</td><td>Takara/Clontech</td><td></td><td>634888 Incluye: Tampón de lisis, inhibidor de RNasa, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (referido en el texto como RT primer), 5X Ultra Low First Phand Buffer (referido en el texto como first phand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referido en el texto como oligonucleótido de cambio de plantilla (TSO)), SMART-Scribe Transcriptasa inversa (referido en el texto como transcriptasa inversa) y PCR Primer II A (referido en el texto como cDNA PCR cebador)</td></tr><tr><td>Hexámero aleatorio con adaptador WTA&nbsp;</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>5&prime;-AAGCAGTGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3&prime;</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA AWAY Descontaminante</td><td>de superficies ThermoFisher Scientific</td><td>7010PK&nbsp; &nbsp;</td><td>Referido en el texto como producto de eliminación de ADN</td></tr><tr><td>Tampón Tris-Borato-EDTA (concentración 10X)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4415-1L</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Tinción de gel de ácido nucleico (concentrado 10,000X en DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Referido en el texto como tinción de gel</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Precisionglide&nbsp; agujas de jeringa, calibre 18</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192554</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Baño ultrasónico de la serie CPX de Branson</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769363</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Casetes de gel vacíos, mini, 1,0 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2010</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Placa de filtro de malla - Corning&nbsp; HTS Transwell 96 soportes bien permeables - 8.0 y micro; m tamaño de poro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3374</td><td>Referido en el texto como 8 mmm Placa de filtro de malla</td></tr><tr><td>PowerPac HC Fuente de alimentación</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Concentrador de vacío</td><td>Eppendorf</td><td>22822993</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>XCell SureLock Sistema Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96 Touch Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195&nbsp;</td><td>Cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Amersham UVC 500 Reticulante ultravioleta</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>UVC500-115V</td><td>Descontinuado, cualquier hardware equivalente es aceptable</td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ Sistema de documentación de gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>Referido en el texto como generador de imágenes en gel</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR89</td><td>Referido en el texto como transiluminador UV</td></tr> <tr><td>&nbsp; Ultrasonidos&nbsp; Baño</td><td>Bransonic</td><td>1207K35</td><td>Cualquier baño ultrasónico equivalente es aceptable.</td></tr></tbody></table>

gel-seq: un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de dna y rna utilizando matrices de hidrogel

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

La capacidad de amplificar y la secuencia de DNA o RNA de pequeñas muestras partidas sólo se ha logrado en los últimos cinco años. Desafortunadamente, los protocolos estándar para generar genómica o transcriptómicos bibliotecas son incompatibles y los investigadores deben optar por la secuencia de DNA o RNA de una muestra particular. Gel-seq soluciona este problema permitiendo a los investigadores a preparar simultáneamente las bibliotecas de DNA y RNA a partir de 100-1000 células usando un dispositivo simple de hidrogel. Este artículo presenta un enfoque detallado para la fabricación del dispositivo así como el protocolo biológico para generar bibliotecas emparejadas. Hemos diseñado Gel-seq para que pudiera ser fácilmente implementado por otros investigadores; muchos laboratorios de genética ya tienen el equipo necesario para reproducir la fabricación de dispositivo seq Gel. Nuestro protocolo emplea comúnmente utilizado kits para ambos toda transcripción amplificación (WTA) y preparación de la biblioteca, que también es probable que sean familiares a los investigadores ya versados en la generación genómicos y transcriptómicos bibliotecas. Nuestro enfoque permite a los investigadores a llevar el poder de la secuenciación de ADN y ARN en una sola muestra sin dividir y con insignificante coste añadido.

La separación física de los híbridos gDNA y cDNA del ARN en el dispositivo de Gel-seq puede visualizarse a través de la proyección de imagen de gel fluorescente; un resultado representativo se muestra en la figura 3. Panel A muestra el dispositivo fabricado de Gel-seq; falso color se ha agregado para distinguir las regiones diferentes del gel. Panel B muestra un cierre de cuatro separaciones diferentes utilizados para la validación. El tercer carril, un contr...

Gel-seq permite a los investigadores a preparar simultáneamente las bibliotecas de ambos ADN - y RNA-seq en el insignificante costo adicional a partir de 100-1000 células usando un dispositivo simple de hidrogel. Este artículo presenta un enfoque detallado para la fabricación del dispositivo así como el protocolo biológico para generar bibliotecas emparejadas.

Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

El objetivo general de este experimento es generar bibliotecas de secuenciación de próxima generación a partir del ADN y el ARN de pequeñas poblaciones de células sin dividir la muestra en ningún punto. Este método proporciona a los investigadores un nuevo enfoque para estudiar las variaciones estructurales del ADN en la expresión de genes. Cuando pensamos por primera vez en Gel-seq, no había protocolos para secuenciar simultáneamente el ADN y el ARN de la misma muestra.Afortunadamente, ahora hay tres enfoques publicados que resuelven este problema. La principal ventaja de esta técnica es que tanto la información genómica como la transcriptómica se pueden obtener del mismo conjunto de células con un coste añadido insignificante. Gel-seq se desarrolló originalmente con casetes verticales, sin embargo, este protocolo se puede adaptar para trabajar con cualquier casete de electroforesis en gel estándar.Prepare el relleno, las mezclas precursoras de alta densidad y baja densidad en tres tubos. Agregue los reactivos en el orden descrito y agite la mezcla. No agregue prematuramente APS o Temed.Espere hasta que se le indique. A continuación, desgasifique cada solución de monómero en gel i

gel-seq-method-for-simultaneous-sequencing-library-preparation-dna

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