Name: Adaptación de 3 amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende el protocolo 3' RACE para mapear secuencias de ARN mensajero en líneas celulares de cáncer. Este método identifica el marco de lectura abierto, el codón de parada y la región 3' UTR de los transcritos.

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Nos gustaría reconocer a Bettine Gibbs por su ayuda técnica.

Usar una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad en todo momento mientras se realizan todos los procedimientos en el presente Protocolo. Asegúrese de que envases y tubos que contienen el reactivo de fenol y guanidina isotiocianato sólo se abren en una capilla certificada y disponer de los residuos de fenol en un contenedor designado. Utilizar reactivos, puntas y tubos estériles libre de DNasa/Rnasa.
1. cultivo celular
<ol><li>Crecer la línea celular HeLa y dos suspensión manto linfoma de la célula líneas celulares, Granta-519 y Jeko-1, en DMEM con 10% FBS y 100 U/mL penicilina/estreptomicina en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C. Diluir las células 1:10 y contar con un contador de partículas14.</li>
	<li>Para la extracción de RNA, la placa de 500.000 células/pocillo de una placa bien 6 (media de 2 mL por pozo). Después de la incubación por 24 h, recoger RNA de las células.</li>
</ol>2. extracción de RNA
<ol><li>Recolección de células Nota: Con excepción de la etapa de centrifugación, realice todos los pasos enumerados en una campana de cultivo de tejidos para mantener la esterilidad.<ol>
<li>Para las células de suspensión (Jeko-1 y Granta-519):<ol>
<li>Transferencia de las células (junto con 2 mL de medio) a un tubo de 15 mL y centrifugue a 1.725 x g por 5 min aspirar los medios de comunicación y dejar el precipitado de células en la parte inferior del tubo.</li>
			<li>Resuspender el pellet celular en 50 μl de 1 x de tampón de fosfato salino (PBS). Añadir 500 μl del reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mezclar bien y dejar a temperatura ambiente (RT) por 5 min al invertir el tubo de microcentrífuga cada 1 minuto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para células adherentes (HeLa):<ol>
<li>Aspire los medios de cultivo celular de cada pocillo. Añadir 1 mL de PBS a cada pocillo para limpiar escombros.</li>
			<li>Retirar el PBS y agregar 500 μl de reactivo de isotiocianato de fenol y guanidina monofásicos a cada pocillo.</li>
			<li>Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con suave balanceo. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lisis de la célula<ol>
<li>Congelación de la mezcla de células isotiocianato fenol y guanidina a-20 ° C durante 1 h. Nota: Puede dejar la mezcla a-20 ° C durante la noche o hasta que se necesite.</li>
		<li>Descongelar el fenol y guanidina isotiocianato celular la mezcla en hielo. Añada 100 μl de cloroformo en el tubo de microcentrífuga en una campana PCR. Vórtice de la muestra para s 10-15 hasta que la mezcla es color rosa y opaco. Incubar la muestra en hielo (a 4 ° C) durante 15 minutos.</li>
		<li>Centrifugue la muestra durante 15 min a 20.800 x g a 4 ° C. Cuidadosamente Remueva la fase acuosa incolora superior (~ 200 μL) y traslado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Precipitación de RNA<ol>
<li>Añadir un volumen igual de isopropanol a cada muestra. Añadir 1 μl de coprecipitant (véase Tabla de materiales) a cada uno para actuar como un portador para el RNA de la muestra y ayuda a visualizar el ARN en los pasos posteriores. Incubar la muestra a-80 ° C durante al menos 4 h. Para mejores resultados, incubar durante una noche a-80 ° C.</li>
		<li>Transferir la muestra a una centrífuga refrigerada. Centrifugar durante 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; el RNA aparece como una mota azul en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el isopropanol de la muestra. Añadir 500 μl de etanol al 80% y resuspender el precipitado con brevemente un vórtex durante 3 s.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 20.800 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos eliminar el etanol de la muestra. Dejar la muestra secar por unos 10 minutos volver a suspender la muestra en 35 μl de agua libre de ARNasa. Colocar en un bloque de calor (65 ° C) durante 5 minutos para que el ARN sea completamente en solución y coloque inmediatamente el tubo en hielo.</li>
		<li>Determinar la concentración de ARN total usando un espectrofotómetro como se describió anteriormente, excepto usar 1,5 μl de la muestra de RNA en lugar de 1 μl15. Opcionalmente, ejecute 1 μg de ARN total en gel de agarosa al 1% para determinar la integridad del RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNasa tratamiento
<ol><li>Después de la cuantificación del ARN, realizar tratamiento de DNasa en el ARN total para degradar cualquier DNA genomic. Para cada muestra, añadir los siguientes reactivos del kit libre de Rnasa DNasa al hacer una reacción total de 20 μl mezclar en un tubo de microcentrífuga separados:<ol>
<li>Mezcle 2 μl de DNasa 10 X buffer de reacción con 4,4 μg de ARN total. Llevar a un total de 14 μl con agua.</li>
		<li>Añadir 2 μl de DNasa Rnasa-libre. Incubar a 37 ° C por 30 min en presencia de 2 μl de inhibidor de la Rnasa (desde el Kit de transcripción inversa).</li>
		<li>Añadir 2 μl de solución de parada y calor en un bloque de calor 10 min a 70 ° C para inactivar la enzima DNasa. Nota: El tratamiento de DNasa es opcional.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. síntesis de cDNA
Para un volumen final de reacción de 50 μl:
<ol><li>Para un volumen final de reacción de 50 μl: transferencia 22 μL de la ADNsa tratados RNA a un tubo nuevo o transferencia 4 μg de ARN total con agua hasta un volumen total de 22 μL a un tubo nuevo. Añadir 2 μl del primer T7 oligo dT25 solución de imprimación de 10 μm. La secuencia de la cartilla de T7 oligo dT25 es 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>De la transcripción reversa kit añadir 2 μl de inhibidor de la Rnasa (20 U/μL), 8 μl del buffer de reacción de 5 x, 4 μL de 10 mM dNTPs y 2 μl de la transcriptasa reversa (200 U/μL). Nota: Configurar una reacción sin transcriptasa inversa para actuar como un control negativo.</li>
	<li>Incubar a 42 ° C por 1 h. transferencia directamente al hielo. Calentar el tubo a 75 ° C por 5 min y coloque el tubo en hielo.</li>
</ol>5. primer búsqueda de transcripción del gen de fusión
<ol><li>
Primer diseño
	<ol>
<li>Descargar la secuencia de cDNA desde el navegador de genoma conjunto (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificar una región dentro de la ORF de la transcripción blanco (ANKHD1) aguas arriba del codón de parada. Copiar y pegar toda la región (hasta 700 nucleótidos) que contienen secuencias aguas arriba del codón de parada en la región de entrada de secuencia de lo software de diseño de la cartilla (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Seleccione la opción Mostrar todos los particulares y 10 para el número de cartillas que el sistema debe generar (resultados a devolver) y salen todos los otros parámetros fijados por defecto.</li>
		<li>Elija cinco cartillas hacia adelantados y dos cartillas inversos que no se superponen. Iniciadores de la orden y reconstituir con agua libre de DNasa/Rnasa a una concentración final de 10 μm. Más detalles sobre el diseño de la cartilla general de PCR están cubiertos en otra parte16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR para identificar potenciales cebadores para su uso en posteriores 3' RACE Nota: Para determinar los iniciadores avance finales en la reacción, pruebe los cebadores diseñados por establecer diferentes combinaciones de cebadores de adelante y atrás para regular PCR en una campana PCR.<ol>
<li>Transferir el cDNA (2 μL) a un tubo PCR de 0.5ml dulce. Añadir 1 μl del primer delantero y 1 μl del primer inverso (de una solución de imprimación de 10 mM). Hacer hasta 12.5 μl agregando 8,5 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 12.5 μl de 2 x Gel de PCR Master Mix.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de ciclismo térmicas PCR: 95 ° C por 2 min seguida de 29 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 1 minuto Seleccione el final a 68 ° C por 7 min.</li>
		<li>Después de la polimerización en cadena, ejecute los productos en un gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio. Detalles de la electroforesis se describen previamente con unas cuantas modificaciones17.<ol>
<li>Disolver 1 g de agarosa en 100 mL de tampón Tris acetato (TAE) en un matraz de 250 mL. Hervir en el microondas.</li>
			<li>Dejar enfriar durante 1 minuto y agregar 7,5 μl de solución de bromuro de etidio (bolsa de 10 mg/mL) en una campana de humos. Mezclar bien agitando el frasco y vierta en un aparato de gel horizontal. Dejar a temperatura ambiente en la campana por lo menos 30 minutos permitir que el gel se solidifique.</li>
			<li>Cubrir el gel con 1 x TAE tampón y cargar 10 μl del producto PCR en el gel de agarosa con 3-5 μl de la escala del peso molecular de ADN. Corren 175 V para 10 minutos visualizar los productos usando a un sensor y si se necesita más separación de productos, ejecutar el gel para un 5-10 minutos adicionales.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selección de primers anidados para 3' RACE
	<ol>
<li>Analizar los resultados del gel de agarosa PCR para seleccionar los iniciadores que tienen una banda distinta, fuerte, sola de PCR. Utilice la cartilla más 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') junto con la cartilla de25 oligodT T7 en la primera PCR ejecutar.</li>
		<li>Seleccione la cartilla anidada que se encuentra aguas abajo de la primera cartilla (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') y con la cartilla de T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') en el segundo conjunto de las reacciones de PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. optimización de 3' de carrera a los 3' UTR mediante dos enzimas diferentes
Nota: Ha habido un aumento en la diversidad de las polimerasas de la DNA utilizada para PCR; por lo tanto, quisimos determinar condiciones estándar que pueden aplicarse incluso cuando se utiliza diferentes enzimas para 3' reacciones de PCR de raza. Los cebadores de reversos para cualquier transcripción se mantienen constantes; los únicos cambios son en los cebadores anidados adelantados que son específicos para la transcripción de destino.
<ol><li>
Protocolo 1:3 ' usando una ADN polimerasa modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu) de la raza
	<ol>
<li>Primera PCR<ol>
<li>1 μl de cDNA de transferir a un tubo PCR y añadir 5 μl de tampón de reacción de Pfu de x 10. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada, 1 μl del primer T7 oligodT25 y 1 μl de dNTPs (de una solución 10 mM).</li>
			<li>Hacer hasta 49 μl total volumen añadiendo 40 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu y mezclar bien. Ejecute la polimerización en cadena usando el perfil de la polimerización en cadena en la tabla 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segunda PCR<ol>
<li>Transferir 2 μl de los productos de la PCR primer a un nuevo tubo PCR y mezclar con 5 μl de 10 x PfuUltra II reacción tampón. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada, 1 μl del primer T7 y 1 μl de dNTPs (solución 10 mM).</li>
			<li>Hacer hasta 49 μl reacción total volumen añadiendo 39 μl de agua. Añadir 1 μl de polimerasa de la DNA de Pfu . Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo 2:3 ' carrera usando una ADN polimerasa quimérica que consiste en un dominio de unión a ADN fusionado a un Pyrococcus-como corrección de la mezcla principal de la polimerización en cadena de polimerasa
	<ol>
<li>Primera PCR<ol>
<li>Transferencia de 1 μl de cDNA en un tubo PCR. Añadir 1 μl de la primera cartilla adelante anidada y 1 μl de la cartilla de25 oligodT de T7. Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua.</li>
			<li>Añadir 25 μl de 2 x PCR Master Mix y mezclar bien. Utilizar las condiciones PCR ciclo descritas en la tabla 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segunda PCR<ol>
<li>Transferencia de 2 μl de los productos de la PCR primera a un nuevo tubo PCR. Añadir 1 μl de la segunda cartilla PCR anidada junto con 1 μl del primer revés T7.</li>
			<li>Hacer hasta 25 μl añadiendo 22 μL de agua. Añada 25 μl de 2 X PCR Master Mix. Ejecute la polimerización en cadena usando el mismo perfil PCR como la primera instalación PCR (tabla 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Verifique que el segundo producto PCR de 3' de carrera.
<ol><li>Tomar 5-10 μl de la segunda producto de la polimerización en cadena (como producto de la primera ronda de PCR si la transcripción se expresa abundantemente) y correr en un gel de agarosa. Configurar el gel y correr la electroforesis como se describió anteriormente (pasos 5.2.3.1 a 5.2.3.3). Visualizar los resultados en un reproductor de imágenes.</li>
</ol>8. secuenciación y purificación del producto
<ol><li>Purificar los productos PCR del gel de la segunda polimerización en cadena usando el Gel y sistema de limpieza de ADN PCR fragmento según protocolo del fabricante.</li>
	<li>Realizar Sanger secuenciación (alternativamente, enviar el gel purificada muestras de productos PCR y secuenciación adecuados primers a un laboratorio de secuenciación). Analizar los datos de la secuencia después Sanger secuenciación.</li>
	<li>Descargar software de análisis de secuencia (véase Tabla de materiales) e importar los archivos de trazas en el software. Uso el QVs individuales de Base puro (valores de calidad) para obtener la Base llamada información18. Descargar el cromatograma con rastros de alta calidad para la visión. Opcional: El producto purificado de gel puede ser clonado utilizando un kit de clonación adecuado y los clones aislados para Sanger secuenciación.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

A pesar del advenimiento de las tecnologías de secuenciación masiva en paralelo, sobre una base de gen por gen, 3' carrera sigue siendo el método más fácil y más económico para identificar la PAS y nucleótidos adyacentes a la cola de poly(A). La adaptación descrita aquí expande utilizando 3' carrera a amplificar tanto mapa secuencias que incluyen una porción del ORF, el codón de parada y el entero 3' UTR de la transcripción del mRNA de ANKHD1 . Una ventaja de 3' RACE es que con algunas adaptaciones menores, prod...

La formación del extremo 3' es un paso crítico en la maduración del ARNm que comprende el clivaje del pre-mRNA aguas abajo de un paso seguido por la adición de 250 untemplated adenines, que forman parte de la cola de poly(A)1,2. La proteína poly(A) (PABP) se une a la cola de poly(A), y este protege la transcripción del mRNA de la degradación y facilita la traducción1.
Las estimaciones actuales sugieren que el 70% de genes humanos tiene PASs múltiples y así experimentar la poliadenilación alternativa, resultando en múltiples 3' extremos3. Por lo tanto, es importante identificar donde la cola de poly(A) se fija al resto de los 3' UTR, así como identificar el PAS utilizado por cualquier transcripción dada. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha dado como resultado la identificación simultánea de 3' UTRs y el paso de miles de genes. Este aumento en la capacidad de secuenciación ha requerido el desarrollo de algoritmos bioinformáticos para analizar los datos que implica alternativa poliadenilación del extremo 3'. Para la detección de novo o validación del PAS y por lo tanto, mapeo del extremo 3' de los genes individuales de datos de secuenciación a gran escala, 3' carrera sigue siendo el método de elección4,5. Las secuencias incluidas en productos de cDNA de 3' raza normalmente incluyen sólo una parte de los 3' UTR que contiene la cola de poly(A), el sitio de la hendidura, el PAS y las secuencias aguas arriba del PAS. A diferencia de la polimerización en cadena, que requiere el diseño y uso de iniciadores específicos de avance y retroceso de gen, 3' RACE sólo requiere iniciadores adelante anidados específicos de dos genes. Por lo tanto, la PCR requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de nucleótidos de una región grande del gen está amplificado4,6. 3' carrera utiliza el mismo invertir cartilla que metas la poly(A) de la cola para todos contra RNA transcripciones, sólo los iniciadores hacia adelantados tienen que ser gene específico, así, que solo requieren conocimiento de una región significativamente menor del mRNA. Esto permite la amplificación de regiones cuyas secuencias no están completamente caracterizadas4,7. Esto ha permitido 3' carrera a utilizarse no sólo para determinar el extremo 3' de un gen, sino para también determinar y caracterizar grandes regiones corriente arriba del PAS que forman una parte importante de los 3' UTR. Al combinar la carrera con el modificado 3' carrera que incluye grandes porciones de 3' UTR y regiones flanqueantes 5', es posible totalmente la secuencia o clonar una toda transcripción de mRNA del extremo 5' a sus 3' extremo8.
Un ejemplo de esta aplicación del modificado 3' RACE es la reciente identificación de una novela CCND1 MRCK transcripción del gene de fusión de líneas de células del manto linfoma y pacientes con cáncer. El 3' UTR consistió en secuencias de genes CCND1 y de MRCK y era recalcitrante a miRNA Reglamento9. Los dos anidados CCND1 específicos hacia adelante fueron complementarias a la región inmediatamente adyacente y aguas abajo del codón de parada CCND1 . Aunque transcriptoma toda la secuencia junto con herramientas bioinformáticas específico se puede utilizar para detectar fusiones de genes dentro de los 3' UTR10, muchos laboratorios pueden carecer los recursos financieros o conocimientos de bioinformática para hacer uso de esta tecnología. Por lo tanto, 3' RACE es una alternativa para novo de identificación y validación de genes de fusión novedosa que implica el 3' UTR. Teniendo en cuenta el drástico aumento del número de genes de fusión reportado como Lee las transcripciones, 3' RACE se ha convertido en una poderosa herramienta en la caracterización de secuencias de genes11,12. Además, estudios recientes han demostrado que diferentes secuencias dentro de los 3' UTR como la longitud de los 3' UTR puede afectar estabilidad transcripción ARNm, localización, traducción y función13. Debido en parte a un creciente interés en la cartografía el transcriptoma, ha habido un aumento en el número de diferentes polimerasas de la DNA ser desarrollado para su uso en el laboratorio. Es importante determinar qué tipos de modificaciones pueden hacerse a los 3' protocolo de la raza en el fin de utilizar el repertorio disponible de polimerasas de la DNA.
Este trabajo informes de adaptación de raza para asignar los enteros 3' UTR 3', el PAS y el 3' final sitio de la hendidura de la transcripción de ANKHD1 utilizando anidados primers dentro de la sección ANKHD1 de la transcripción y dos diferentes polimerasas de la DNA.

<table><tbody><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2 Línea celular de cáncer de</td><td>cuello uterino.</td></tr><tr><td>Células Jeko-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Línea celular de linfoma de células del manto.</td></tr><tr><td>Granta-519 células</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Línea celular de linfoma de células del manto.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Suero fetal bovino para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiótico y antimicótico.</td></tr><tr><td>Coprecipitante GlycoBlue</td><td></td><td>Ambion AM9545</td><td>.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>medios de cultivo celular de la marca Gibco con GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Agua libre de ADNasa y ARNasa de Ambion (no tratada con DPC).</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma&nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Solución de bromuro de etidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Reactivo monofásico de fenol e isotiocianato de guanidina.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&nbsp; que contiene colorante de carga utilizado en ensayos rápidos de PCR de rutina y búsqueda de cebadores.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNasa libre de RNasa</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Kit de tratamiento de dnasa.</td></tr><tr><td>Tinte de carga de gel naranja (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion PCR de alta fidelidad Master Mix con tampón HF</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix que contiene una ADN polimerasa quimérica que consiste en un dominio de unión al ADN fusionado con una polimerasa de corrección similar a Pyrococcus y otros reactivos.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS ADN polimerasa</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>ADN polimerasa modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa RevertAid RT</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Se utiliza para la transcripción inversa de ARNm en la síntesis de ADNc. El kit incluye&nbsp; Inhibidor de la ARNasa Ribolock, transcriptasa inversa RevertAid M-MuLV y otros reactivos enumerados en el manuscrito.</td></tr><tr><td>Tamaño perfecto 1Kb escalera</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Escalera de ADN de peso molecular.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Se utiliza para visualizar gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.</td></tr><tr><td>Escalera de bajo peso molecular</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Escalera de ADN de peso molecular.</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Baño seco</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Espectrofotómetro.</td></tr><tr><td>Mini-Submarino Ancho&nbsp; Cell GT Sistema de Electroforesis Horizontal</td><td>BioRad 1704469</td><td></td><td>Equipo-aparato de electroforesis para configurar gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Fuente de alimentación para electroforesis en gel.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR termociclador.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Sistema de limpieza de ADN en gel y fragmentos de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning, con un solo disparo&nbsp; TOP10 células de E. coli químicamente competentes</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>Estación de preparación MyPCR Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Capucha dedicada al trabajo de PCR.</td></tr><tr><td>Campana extractora Hamilton SafeAire II</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>campana extractora.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&nbsp; partícula&nbsp; Contador</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Contador de partículas. Para contar celdas antes de enchapar&nbsp; para la extracción de ARN.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (a través de ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software para analizar datos de secuenciación de Sanger.</td></tr></tbody></table>

adaptación de 3' amplificación rápida del cdna termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Maduración de los mRNAs eucarióticos consiste en 3' final de formación, que consiste en la adición de una cola de poly(A). Para asignar el extremo 3' de un gen, el método tradicional de elección es 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE). Protocolos para 3' raza requieren el cuidado diseño y selección de primers anidados dentro de la región 3' no traducida (3' UTR) del gen Diana de interés. Sin embargo, con algunas modificaciones, el protocolo puede utilizarse para incluir el entero 3' UTR y secuencias dentro del marco de lectura abierto (ORF), proporcionando una visión más comprensiva de la relación entre el ORF y el 3' UTR. Se trata además de identificación de la señal de poliadenilación (PAS), así como el escote y poliadenilación sitio provisto por convencional 3' RACE. Ampliado 3' RACE puede detectar inusual 3' UTRs, incluyendo fusiones de genes dentro de los 3' UTR, y la información de secuencia puede utilizarse para predecir potenciales sitios de unión de miRNA como AU rica desestabilizar elementos que puedan afectar la estabilidad de la transcripción.

Búsqueda anidada Primer avance:
El gel de agarosa de La figura 1 muestra dos distintas gel productos de la PCR (carriles 1 y 2) que utilizan la misma adelante cartilla pero diferentes primers inversas. Carril 3 tiene un producto PCR distinto y distinto primer avance y retroceso. Los iniciadores ideal a utilizar para la reacción de PCR basado en son los que dan un producto PCR diferente...

La dos diferentes 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3' UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.

Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar las secuencias de transcripciones de ARNm desde el extremo de los tres primos hasta las regiones dentro de la región codificante de proteínas mediante el uso de cebadores anidados específicos de la transcripción en dos PCR posteriores y la secuenciación de los productos de PCR purificados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo genético, como la determinación de la señal de poliadenilación, el codón de parada y la secuencia de la región no traducida de tres primos de la transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a cualquier transcripción si la secuencia de la pequeña región del marco de lectura abierto es La implicación de esta técnica se extiende hacia el diagnóstico del cáncer, ya que puede detectar genes de fusión específicos del tumor y variantes de empalme.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando identificamos transcripciones novedosas con regiones no traducidas de tres primits previamente no caracterizadas. Para comenzar el protocolo, descongele la mezcla de células de fenol e isotiocianato de guanidina en hielo. Una vez descongelado, agregue

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Investigación

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Genetics

Genética

Debido a la naturaleza transitoria de la pre-ARNm, que pueden ser difíciles de aislar y...

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja...

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

Este protocolo describe un método para asignación pre-mRNA 3' final sitios de procesamiento.

Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

El manuscrito describe un ensayo PCR digital basado en el chip para detectar una variante rara de transcripción CDH1 (CDH1a) en congelado normal y los tejidos del tumor obtenidos de pacientes con cáncer gástrico.

Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

ATAC-seq es un método de secuenciación de ADN que utiliza la transposasa mutante hiperactiva, Tn5, para mapear los cambios en la accesibilidad de la cromatina mediada por factores de transcripción. ATAC-seq permite el descubrimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a las alteraciones fenotípicas en las células cancerosas. Este protocolo describe los procedimientos de optimización para ATAC-seq en tipos de células epiteliales, incluidas las células cancerosas.

Optimización ATAC-SEQ para la investigación epigenética del cáncer

Este protocolo detalla una metodología para la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas en secciones de tejido incluidas en parafina fijadas en formalina.

Cartografía molecular de doble modalidad: integración de la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas

Los eventos de empalme en tándem ocurren en sitios a menos de 12 nucleótidos de distancia. La cuantificación de las proporciones de dichas variantes de empalme es factible utilizando un enfoque de PCR cuantitativo absoluto. Este manuscrito describe cómo se pueden cuantificar las variantes de empalme del gen STAT3, en las que dos eventos de empalme dan lugar a la inclusión/exclusión de Serina-701 y a α/β C-terminal.

La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

Aprende el protocolo 3' RACE para mapear secuencias de ARN mensajero en líneas celulares de cáncer. Este método identifica el marco de lectura abierto, el codón de parada y la región 3' UTR de los transcritos.

Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

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