Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

El objetivo general de este procedimiento es determinar las secuencias de transcripciones de ARNm desde el extremo de los tres primos hasta las regiones dentro de la región codificante de proteínas mediante el uso de cebadores anidados específicos de la transcripción en dos PCR posteriores y la secuenciación de los productos de PCR purificados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo genético, como la determinación de la señal de poliadenilación, el codón de parada y la secuencia de la región no traducida de tres primos de la transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a cualquier transcripción si la secuencia de la pequeña región del marco de lectura abierto es La implicación de esta técnica se extiende hacia el diagnóstico del cáncer, ya que puede detectar genes de fusión específicos del tumor y variantes de empalme.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando identificamos transcripciones novedosas con regiones no traducidas de tres primits previamente no caracterizadas. Para comenzar el protocolo, descongele la mezcla de células de fenol e isotiocianato de guanidina en hielo. Una vez descongelado, agregue 100 microlitros de cloroformo al tubo de microcentrífuga en una campana de PCR.

Agite la muestra durante 10 a 15 segundos hasta que la mezcla esté rosada y opaca. A continuación, incube la muestra en hielo durante 15 minutos. Después de la incubación, centrifugar la muestra durante 15 minutos a 20,800 g y cuatro grados centígrados.

Retire con cuidado la fase acuosa incolora superior y transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego, pase a la precipitación y agregue un volumen igual de isopropanol a la muestra. Agregue un microlitro de coprecipitante a la muestra para que actúe como portador del ARN y para ayudar a visualizar el ARN en los pasos posteriores.

Incubar las muestras a 80 grados centígrados durante al menos cuatro horas. Después de la incubación, transfiera la muestra a una centrífuga enfriada y centrifuga durante 35 minutos a 20, 800 g y cuatro grados centígrados. Después del giro, el ARN aparecerá como una mancha azul en la parte inferior del tubo.

Retire con cuidado el isopropanol de la muestra. Agregue 500 microlitros de etanol al 80% y vuelva a suspender el pellet mediante un breve vórtice durante tres segundos. Vuelva a centrifugar la muestra.

Retire todo el etanol de la muestra y deje que la muestra se seque al aire durante unos 10 minutos. Una vez que la muestra esté seca, vuelva a suspenderla en 35 microlitros de agua libre de RNasa. Luego, coloque la muestra en un bloque de calor.

Ajuste a 65 grados Celsius durante cinco minutos para asegurarse de que el ARN esté completamente en solución. Después de calentar, coloque inmediatamente el tubo sobre hielo. Para un volumen de reacción final de 50 microlitros, agregue cuatro microgramos de ARN total con agua agregada a un volumen total de 22 microlitros a un tubo nuevo.

Agregue dos microlitros del cebador Oligo dT 25 de la solución de cebador de 10 micromolares. Del kit de transcripción inversa, agregue dos microlitros del inhibidor de la RNasa, ocho microlitros del tampón de reacción 5x, cuatro microlitros de dNTP de 10 milimolares y dos microlitros de la transcriptasa inversa. Configure una reacción sin transcriptasa inversa para que actúe como un control negativo.

Incubar el tubo a 42 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, transfiera el tubo directamente al hielo antes de transportarlo al bloque calefactor. Luego, calienta el tubo a 75 grados centígrados durante cinco minutos.

Después de calentarlo a 75 grados centígrados, coloque el tubo sobre hielo. Transfiera dos microlitros del ADNc a un tubo de PCR nuevo de 0,5 mililitros. Agregue un microlitro del cebador directo y un microlitro del cebador inverso de una solución de cebador de 10 milimolares.

Haga hasta 12,5 microlitros agregando 8,5 microlitros de agua sin nucleasas y agregue 12,5 microlitros de la mezcla maestra de PCR 2x al gel. A continuación, introduzca las condiciones de ciclo térmico de PCR enumeradas en la pantalla y ejecute el PCR. Después de la PCR, prepare un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.

Disolver un gramo de agarosa en 100 mililitros de triacetato o tampón TAE en un matraz de 250 mililitros. Hervir el contenido en el microondas. Deje que el gel se enfríe durante un minuto y agregue 7,5 microlitros de solución de bromuro de etidio en una campana extractora.

Mezclar bien agitando el matraz. Vierta el contenido en un aparato de gel horizontal y deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente en la campana extractora durante al menos 30 minutos. Cubra el gel con 1x tampón TAE y cargue 10 microlitros del producto PCR en el gel de agarosa junto con tres a cinco microlitros de la escala de peso molecular del ADN.

Deje correr el gel a 175 voltios durante 10 minutos. Para la primera PCR, transfiera un microlitro de ADNc a un tubo de PCR y agregue cinco microlitros de tampón de reacción 10x Pfu. Agregue un microlitro del primer cebador delantero anidado, un microlitro del cebador T7 Oligo dT 25 y un microlitro de dNTP de una solución de 10 milimolares.

Haga hasta 49 microlitros de volumen total agregando 40 microlitros de agua. Agregue un microlitro de ADN polimerasa Pfu y mezcle bien. A continuación, ejecute la PCR.

A continuación, prepare la segunda PCR. Transfiera dos microlitros de los productos de la primera PCR a un nuevo tubo de PCR y mézclelo con cinco microlitros de tampón de reacción 10x Pfu ultra two. Agregue un microlitro del segundo cebador de PCR anidado, un microlitro del cebador T7 y un microlitro de dNTP.

Haga hasta 49 microlitros de volumen total de reacción agregando 39 microlitros de agua y agregue un microlitro de Pfu ADN polimerasa. Ejecute la PCR con el mismo perfil de PCR que la primera configuración de PCR. Alternativamente, en lugar de usar Pfu ADN polimerasa, se puede usar una ADN polimerasa quimérica en las dos PCR diferentes.

Tome de cinco a diez microlitros del segundo producto de PCR y hágalo funcionar con un gel de agarosa. Por último, visualice el resultado en un generador de imágenes. Este gel de agarosa muestra dos productos de PCR distintos que utilizan el mismo cebador directo pero diferentes cebadores inversos y un producto de PCR distinto que tiene un cebador directo e inverso distintos.

Los cebadores ideales para la reacción basada en PCR son aquellos que proporcionan un producto de PCR distinto. Los productos de la segunda reacción de PCR con la ADN polimerasa de Pfu y la ADN polimerasa quimérica produjeron productos de PCR del mismo tamaño a pesar de tener diferentes condiciones de ciclo de PCR para el RACE de tres cebadores. Los controles con transcriptasa inversa negativa no mostraron contaminación genómica del ARN utilizado en la síntesis de ADNc, así como en las reacciones posteriores.

Los productos de PCR purificados en gel se enviaron para su secuenciación. Una secuencia representativa de Sanger de un cromatograma de secuencia identificó la ubicación del codón de parada, la señal de poliadenilación putativa y el sitio, así como la cola de poli A en el producto RACE de tres primos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar equipo de protección y guantes en todo momento.

Además, utilice DNasa y RNasa estériles para sus tubos de reactivos y otros productos desechables. No olvide que trabajar con fenol y cloroformo puede ser extremadamente peligroso. Y siempre se deben tomar precauciones, como usar los reactivos en una campana y desechar el material en un contenedor de desechos designado, mientras se realiza este procedimiento.