Name: Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda a aislar células de islotes pancreáticos murinos para detectar xenobióticos inductores de ROS con potencial diabetogénico. Este método permite evaluar in vitro el impacto de productos químicos ambientales en la función pancreática.

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Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto piloto de centro CREH auspiciada por NIEHS y por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 31572626).

Todos los experimentos en animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, regulaciones y agencias reguladoras. El protocolo se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación de la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Texas A & M Instituto de medicina genómica.
1. preparación de la solución
<ol><li>Diluir una solución salina equilibrada de Hank de x 10 a 1 x con doble destilada H2O y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar la solución de aislamiento mediante la adición de HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) y glucosa (5 mM). Ajustar el pH a 7,4 y mantener en hielo.</li>
	<li>Preparar la solución de colagenasa de colagenasa tipo 4. Nota: Especialmente, la colagenasa tipo 4 contiene 160 U por mg de peso seco. 1 g de colagenasa tipo 4 es diluido en 5 mL doble destilada H2O con una concentración de 200 mg/mL. se agrega 2 mL de colagenasa diluida a la solución de aislamiento frío de hielo de 30 mL y 6 mL de solución de colagenasa se transfiere a un tubo de 50 mL para cada ratón.</li>
	<li>Preparar la solución de lavado agregando 1 mM CaCl2 a la solución de aislamiento.</li>
	<li>Preparar la solución de purificación con solución de diatrizoato de sodio polysucrose frío (1,1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>Preparar 500 mL de medio de cultivo de islotes pancreáticos mediante la adición de L-glutamina (20 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y suero bovino fetal (FBS) (10%) en Medio RPMI.</li>
	<li>Prepare la solución DCFH-DA disolviendo el polvo en agua destilada a 200 μm y almacenar a-20 ° C. Nota: El ROS solución de tinción es recién hecho diluyendo DCFH-DA solución a la concentración final de 5 μm en RPMI. Este reactivo debe ser protegido de la luz.</li>
</ol>2. quirúrgico preparación
<ol><li>Inyectar por vía intraperitoneal (I.P.) un ratón con avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Después de que el ratón está totalmente anestesiado y no responde a hind pie pizcas, eutanasia el ratón y mueve la campana biológica.</li>
	<li>Coloque el ratón eutanasia con el abdominal hacia arriba y rociar la piel con etanol al 70% para la esterilización.</li>
	<li>Abrir la cavidad abdominal con un 1 cm U-incisión en el abdomen superior y retraiga la piel en dirección rostral sobre el pecho para exponer la cavidad abdominal.</li>
</ol>3. eliminación y perfusión páncreas
<ol><li>Como se ilustra en la figura 1, encontrar la ubicación de la ampolla. Utilizar un par de pinzas curvas para apretar el duodeno cerca de la posición del esfínter de Oddi. Usar otro par de pinzas curvas para sujetar a la pared del duodeno para bloquear la vía biliar en el duodeno. Nota: La ampolla no se ha insertado en este paso. Este paso está destinado a bloquear la vía biliar en el duodeno.</li>
	<li>Vuelva a colocar el ratón con la cabeza proximal y los pies distales en relación con el investigador.</li>
	<li>El conducto biliar común y la inyecte lentamente 3 mL de solución de colagenasa con una jeringa de aguja y 5 mL de 30 G. Asegúrese de que el conducto biliar común y el páncreas se inflan después de la inyección.</li>
	<li>Retire el páncreas distendido con los fórceps curvado y tijeras finas para separar el colon descendente, intestino, estómago y bazo. Colocar el páncreas en un tubo de 50 mL que contiene 3 mL de solución de colagenasa y mantenerlo en hielo.</li>
</ol>4. páncreas digestión
<ol><li>Coloque cada tubo de 50 mL en un baño de agua de 37 ° C. Incube durante 15-20 minutos (el tiempo varía con la cepa y edad de los ratones).</li>
	<li>Vibrar el tubo utilizando un vortex.</li>
	<li>Piscina 4-5 páncreas digerida en un colador grande Lavabo estéril y utilizar una cuchara para que el páncreas desintegrarse completamente. Utilice una jeringa de aguja y 10 mL de 23 G con solución de lavado para pipetear con fuerza las células digeridas fuera de la pantalla. Recoger la solución de lavado en un tubo de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 97 x g a 4 ° C por 1 min y decantar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 25 mL de solución de lavado para tubos y vuelva a suspender el tejido con un vórtex suave. Desactivación de los tejidos a 97 x g a 4 ° C por 1 min y decantar el sobrenadante. Repita 3 veces. Tenga cuidado de no desplazar los tejidos concentrados.</li>
</ol>5. purificación de islotes
<ol><li>Añadir 10 mL de solución de purificación a la pelotilla de tejido lavado y resuspender suavemente el contenido.</li>
	<li>Recubrimiento con cuidado 5 mL de solución de aislamiento en la solución de purificación. Tenga cuidado de mantener una interfaz líquida sostenida entre las dos soluciones.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 560 x g a 4 ° C durante 15 min con una aceleración lenta y sin freno. Introduzca la pipeta en la interfaz y recoger la capa de islotes en nuevos tubos de 50 mL.</li>
	<li>Lave los islotes como se describe en el paso 3.5.</li>
</ol>6. revestimiento y tratamiento de las células del islote
<ol><li>Resuspender los islotes en 10 mL de solución de cultivo de islotes, suavemente mezcle bien y coloque 100 μL/pocillo con una pipeta multicanal a una placa de 96 pocillos. Colocar aproximadamente 5 islotes por 96 bien.</li>
	<li>Colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos para 12 h.</li>
	<li>Centrifugar (112 x g) la placa de 96 pocillos y retire el medio de cultivo.</li>
	<li>Diluir los productos químicos ambientales en el medio de cultivo de islotes. Añadir 100 μl de cada uno de los diluyentes químicos en pocillos separados de la placa. Resuspender los islotes en cada pocillo e incubar durante 12 h a 37 ° C (la concentración varía para los diferentes productos químicos ambientales).</li>
</ol>7. ROS coloración y a la medida
<ol><li>Después del tratamiento de islotes, lavado con PBS 1 x (200 μL para cada 96-well). Nota: La concentración de las sustancias químicas es como sigue: AFB1: 3 μm, atrazina: 100 μm, BaP: 10 μm, BPA: 100 μm, β-estrógeno, PCB126: 10 μm, nonilfenol y BPA: 100 μm.</li>
	<li>Uso de N-acetil cisteína (NAC) como antioxidante para saciar ROS. Añadir 5 mM de NAC a los diluyentes químicos inducida por ROS e incubar durante 12 h a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar la placa de 96 pocillos x 112 g e incubar con solución de 5 μm de sonda fluorescente (H2-DCFH-DA disuelto en medios RPMI) a 37 ° C durante 60 minutos.</li>
	<li>Lavar las células de los islotes tratados 3 veces con PBS y medir la fluorescencia con un lector de microplacas a 488 nm. Nota: La acumulación de DCF en células se puede medir por un aumento en fluorescencia en 530 nm cuando la muestra es excitada a 488 nm.</li>
	<li>Realizar la insulina estimulada por glucosa secreción (GSIS) ensayo9 de xenobióticos inducen ROS tratados islas e islotes no tratadas para medir los efectos de xenobióticos sobre la función fisiológica de los islotes pancreáticos.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

La acumulación de pruebas sugiere que la exposición a químicos ambientales desempeña un papel importante en el desarrollo de T2DM. Inducida por xenobióticos ROS ha sido reconocido como un factor etiológico potencial contribuyendo al desarrollo de T2DM. Los seres humanos están expuestos a una amplia gama de productos químicos xenobióticos y hay una gran necesidad de técnicas de investigación novedosas para identificar efectivamente los toxicantes pancreáticos e investigar el mecanismo de la toxicidad específica de las cél...

Aumentos en la prevalencia de T2DM se han convertido en una crisis de salud global en los últimos años plantea una grave amenaza a la salud pública1. Se han encontrado muchos factores causal relacionada con el desarrollo de T2DM, entre los que repite resultados sugieren que un punto convergente común para estos factores es la inducción de estrés oxidativo que conduce a la generación excesiva de ROS2 , 3.
Una amplia gama de productos químicos ambientales como PCBs, dioxinas y BaP se ha encontrado para inducir el estrés oxidativo, que puede perjudicar el funcionamiento de las células β pancreáticas y llevar a resistencia a la insulina y T2DM4. Aunque a nivel fisiológico de ROS desempeña un papel importante en las funciones celulares, la exposición a ROS que excede la capacidad del sistema antioxidante provoca el daño a las células/tejidos y conduce a enfermedades5. Las células β pancreáticas expresan un bajo nivel de enzimas antioxidantes y por lo tanto están un objetivo sensible de la mediada por estrés oxidativo6,7. La exposición crónica a altos niveles de ROS se ha demostrado para causar la disfunción de células pancreáticas inducida por estrés5 así como resistencia a la insulina en el hígado y tejido adiposo8.
El objetivo general de este proyecto es desarrollar un ensayo basado en células para productos químicos de la pantalla para sus potenciales diabetogenic basados en la inducción de ROS en las células pancreáticas. El páncreas carece de desintoxicación metabólica y es un blanco sensible de daño inducido por xenobióticos6,7. Por lo tanto, midiendo directamente los ROS generados en las células pancreáticas, este análisis deben proporcionar una aproximación directa a la lesión inducida por el producto químico en el páncreas. Para desarrollar este método, aislados islotes pancreático de ratón, había cultivado el islote aislado bajo condiciones de cultivo celular con productos químicos y utiliza la generación de ROS inducida por químicos como la lectura. Este procedimiento es simple y eficaz en la identificación de productos químicos inductores de ROS en el islote aislado; pueden desarrollarse para la investigación de los mecanismos de toxicidad que son específicos para el páncreas in vitro.

<table><tbody><tr><td>10 veces; Hank' s solución salina equilibrada &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>solución de diatrizoato de polisacarosa/sodio &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA)</td>Lector de microplacas de fluorescencia <td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>estreptomicina</td><td>GIBCO 15140148</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA de Insulina Rata/Ratón</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>para centrífuga de placas de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>para lectura de fluorescencia</td></tr></tbody></table>

una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos diabetogenic ambiental productos químicos

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposición a determinadas sustancias químicas ambientales en humanos y animales se ha encontrado para causar daño celular de las células β pancreáticas que conducirá al desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Aunque los mecanismos para el daño de la célula β inducida por químicos eran probablemente sea complejo y confuso, un hallazgo recurrente es que estos productos químicos inducen estrés oxidativo que conduce a la generación de especies reactivas excesiva del oxígeno (ROS) que inducen daño a la célula β. Para identificar potenciales químicos ambientales diabetogenic, se aislaron células de los islotes pancreáticos de ratones C57BL/6 y las células del islote cultivadas en placas de cultivo celular de 96 pozos; Luego, las células del islote fueron dosificadas con productos químicos y la generación de ROS se detectó por 2', 7'-Diclorofluoresceína (DCFH-DA) colorante fluorescente. Usando este método, encontró bisphenol A (BPA), Benzo [a] pireno (BaP) y los bifenilos policlorados (PCB), podría inducir a altos niveles de ROS, sugiriendo que potencialmente pueden inducir daño en las células del islote. Este método debe ser útil para la detección diabetogenic xenobióticos. Además, las células del islote culta también pueden ser adaptadas para el análisis en vitro de la toxicidad inducida por el producto químico en las células pancreáticas.

Una micrografía del islote aislado sano se muestra en la figura 2, en la cual islotes tienen una forma redonda u ovalada con relativamente uniforme de tamaño (aunque uniformidad de tamaño puede variar de una cepa a cepa). Investigamos a continuación las funciones del islote pancreático en un ensayo en vitro por aislar el islote y estimulando la secreción de insulina en los islotes de cultura. La figura 3 muestra el análi...

Aquí presentamos un protocolo para aislar células de islote pancreático de ratón para la detección de las inducciones de ROS por los xenobióticos con el fin de identificar los potenciales químicos xenobióticos diabetogenic.

Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Las células del páncreas son un objetivo sensible para los daños inducidos por ROS, que se asocian con el desarrollo de diabetes tipo 2. Un ensayo basado en células de páncreas ayudará a identificar las sustancias químicas inductoras de ROS. La principal ventaja de esta técnica es el uso de células aisladas de los islotes del páncreas para la identificación sencilla y eficaz de las sustancias químicas inductoras de ROS que pueden tener los potenciales diabetogénicos añadidos.Este método también se puede utilizar para un análisis in vitro de los efectos de los productos químicos en una función fisiológica del páncreas, como la secreción de insulina estimulada por la glucosa. Utilice un par de pinzas curvas para sujetar el duodeno cerca de la posición del esfínter de Oddi. Con otro par de pinzas curvas, sujete la pared del duodeno para bloquear la vía biliar.Busca el conducto biliar común y con una aguja de calibre 30 y una jeringa de cinco mililitros, inyecta lentamente tres mililitros de solución de colagenasa. A continuación, vuelva a colocar el ratón con la cabeza proximal y los pies distales. Asegúrese de que el conducto biliar común y el páncreas estén inflados después de la inyección.Con las pinzas curvas y las tijeras finas, retire el páncreas distendido para separarlo del colon, los intestinos, el estómago y el bazo descendentes. Luego, coloque el órgano en un tubo de 50 mililitros que contenga tres mililitros de solución de colagenasa y manténgalo en hielo. Coloque cada tubo de 50 mililitros en un baño de agua a 37 grados centígrados y colévelos durante 15 a 20 minutos.Agite los tubos, luego agrupe cuatro o cinco órganos digeridos en un colador de fregadero grande y estéril y use una cuchara para separar completamente el páncreas. Con una aguja de calibre 23 y una jeringa de diez mililitros que contenga solución de lavado, pipetee enérgicamente las células digeridas de la pantalla. Luego, recoja la solución de lavado en un tubo de 50 mililitros.Centrifugar los tubos a 97 g y cuatro grados centígrados durante un minuto y decantar el sobrenadante. Agregue 25 mililitros de solución de lavado a los tubos y vuelva a suspender el tejido mediante un vórtice suave. Luego, gira el tejido y decanta el sobrenadante.Repita el lavado tres veces, teniendo cuidado de no desalojar el tejido granulado. Para purificar los islotes, agregue diez mililitros de solución de purificación al pellet de tejido lavado y vuelva a suspender suavemente el contenido. Coloque suavemente cinco mililitros de solución aislante sobre la solución de purificación.Asegúrese de que se mantenga una interfaz líquida aguda entre las dos soluciones. Centrifugar el tubo a 560 g a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, con aceleración lenta y sin descanso. A continuación, inserte la pipeta en la interfaz y recoja la capa de islotes.Transfiera la solución a nuevos tubos de 50 mililitros antes de lavar el islote como se acaba de demostrar. Después de retirar el lavado final, agregue diez mililitros de solución de cultivo de islotes y mezcle suave y bien para resuspender los islotes. Luego, usando una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros por pocillo a los pocillos de una placa de 96 pocillos.Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante 12 horas. A continuación, centrifugar la placa a 112 g y retirar el medio de cultivo. Diluya los productos químicos ambientales en el medio de cultivo de los islotes.Agregue 100 micro litros de cada uno de los diluyentes químicos en pocillos separados de la placa. Vuelva a suspender los islotes en cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante 12 horas. Después del tratamiento químico de los islotes, use 1x PBS para lavar las muestras.Luego, agregue cinco milimolares de N-acetilcisteína o NAC a los pocillos, como antioxidante para apagar las ROS e incube las placas a 37 grados centígrados durante 12 horas. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 112 g, luego agregue cinco micromolares de solución de sonda fluorescente e incube la placa a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Utilice PBS para lavar las células de los islotes tratados tres veces y utilice un lector de microplacas a 480 nanómetros para medir la fluorescencia.Por último, realizar la secreción de insulina estimulada por glucosa, o ensayo GSIS, en los islotes xenobióticos inductores de ROS tratados y no tratados, para medir los efectos xenobióticos sobre la función fisiológica de los islotes pancreáticos. Aquí se muestran islotes pancreáticos sanos, aislados de ratones C57 Black/6, que tienen forma redonda u ovalada y tienen un tamaño relativamente uniforme. En este ensayo GSIS, utilizando islotes aislados estimulados con glucosa para secretar insulina, se observó una respuesta dependiente de la dosis.Cuando los islotes aislados se trataron con los xenobióticos enumerados aquí, varios productos químicos, incluidos la atrazina, BaP, BPA y PCB, causaron una inducción significativa de especies reactivas de oxígeno. Sin embargo, la adición de NAC fue capaz de apagar la producción de ROS por los tratamientos químicos. Además, los islotes pancreáticos pretratados con PCB126 y BPA mostraron una disminución significativa en la secreción de insulina en comparación con el grupo control, lo que confirma el importante papel de las ROS en la causa de daños en la función fisiológica de las células beta pancreáticas que conducen a la DMT2.Una vez dominado, el aislamiento de los islotes pancreáticos se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar la centrifugación en gradiente para purificar los islotes y separarlos de los demás desechos pancreáticos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secreción de insulina estimulada por glucosa, para responder a preguntas adicionales, como los efectos de los productos químicos en las funciones fisiológicas de los islotes del páncreas.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la toxicología exploraran los potenciales diabetogénicos de los productos químicos ambientales en células aisladas de islotes de páncreas de ratón. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar los islotes del páncreas del ratón y usar estas células de los islotes para la identificación.

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Páncreas murino aislamiento Islet

El ensayo in vitro función de las células β usando islotes aislados de ratones de Langerhans es un componente importante en el estudio de la fisiopatología de la diabetes y la terapéutica. Mientras que muchas aplicaciones posteriores están disponibles, este protocolo se describe específicamente la medición de intracelular de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) como un parámetro esencial para determinar la función de las células β.

Un método para ratón islotes pancreáticos Aislamiento y cAMP intracelular Determinación

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

En ensayos de colonias in vitro para la detección de auto-renovación y diferenciación de células progenitoras aisladas de páncreas murinos adultos estén concebidas. En estos ensayos, los progenitores de páncreas dan lugar a colonias de células en el espacio de 3 dimensiones en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Se describen protocolos para la manipulación de células individuales y caracterización de las colonias individuales.

Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Este protocolo describe un método estandarizado para la extracción quirúrgica, la digestión enzimática y la purificación con gradiente de densidad de islotes pancreáticos de rata Lewis, permitiendo preparaciones de alto rendimiento y alta pureza para su uso directo en trasplantes o estudios in vitro .

Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

Un nuevo método de evolución dirigida específicamente al ámbito de la ingeniería termoestabilidad fue desarrollado y validado tanto para las enzimas bacteriolíticas. Después de sólo una ronda de mutagénesis al azar, una enzima bacteriolítica evolucionado, PlyC 29C3, muestra mayor que el doble de la actividad residual en comparación con la proteína de tipo salvaje después de incubación a temperatura elevada.

Un método de screening para la evolución dirigida de enzimas termoestables bacteriolítica

Aprenda a aislar células de islotes pancreáticos murinos para detectar xenobióticos inductores de ROS con potencial diabetogénico. Este método permite evaluar in vitro el impacto de productos químicos ambientales en la función pancreática.

Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos

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