Name: Efectos duales de factores derivados de células de Melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprende a establecer un sistema de cocultivo bidimensional para estudiar la interacción entre células de melanoma B16F10 y adipocitos de médula ósea. Este método permite analizar los efectos duales de factores tumorales en la diferenciación adipocitaria y explorar mecanismos de metástasis ósea en investigación oncológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Dov Zipori (el Instituto Científico Weizmann, Rehovot, Israel) amablemente nos proporciona las células estromales de médula ósea murina línea 14F1.1. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales (Nº 81771729) China y la Universidad Hospital de Yongchuan de Chongqing médica (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Nota: Todas las células utilizadas este protocolo deben ser crecidas durante al menos tres generaciones después de la descongelación de las células comunes.
1. factores derivados de células de Melanoma de la cosecha
<ol><li>
Preparaciones
	<ol>
<li>Obtener células B16F10 y una línea de células de melanoma de ratón. Nota: Para este protocolo, se obtuvo una línea de células de melanoma de ratón desde el Banco de células madre de la Academia China de Ciencias.</li>
		<li>Hacer un medio completo para cultivo celular B16F10 (100 mL). Uso medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.</li>
		<li>Hacer un medio libre de suero para la inanición de las células de B16F10 (50 mL). Uso de medio sin SFB DMEM, 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar medio condicionado melanoma (CM)
	<ol>
<li>Las células5 B16F10 semilla 2.0 x 10 100 mm plato con 10 mL de 10% FBS DMEM. Luego incubar las células en una incubadora de 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 durante 24 h.</li>
		<li>Cuando las células alcanzan alrededor del 80% de confluencia, eliminar el medio de cultivo, lavan las células dos veces con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1 x, pH 7,4) y reemplazar el medio con 10 mL de medio libre de suero para el hambre.</li>
		<li>Volver las células a la incubadora durante 18 – 24 h.</li>
		<li>Después de la inanición, recoge el medio condicionado (CM) con una pipeta y transferir a un tubo de centrífuga de 50 mL fresco. Nota: El medio condicionado es el sobrenadante de las culturas de célula B16F10. Asegúrese de que las células B16F10 están en buenas condiciones antes de recoger el CM.</li>
		<li>Centrifugue la CM durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Pipeta el sobrenadante y transferir a un tubo estéril fresca o botella. Nota: Evite el pipeteo de la pelotilla en la parte inferior del tubo.</li>
		<li>Para eliminar los restos celulares, filtro de la CM pasando a través de un filtro de 0.45 μm jeringa conectada en la parte superior un tubo o frasco estéril. Nota: 0,22 μm filtros son óptimos para el filtrado de la CM.</li>
		<li>Guarde el sobrenadante filtrado a-20 ° C hasta su uso. Nota: Es mejor no almacenar el sobrenadante a-20 ° C durante más de un mes. Alternativamente, guarde el CM a-80 ° C por más largos períodos de tiempo para la diferenciación del adipocito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inducción de los adipocitos de la médula ósea por factores derivados de células de Melanoma
<ol><li>
Preparaciones
	<ol>
<li>Hacer 100 mL de medio de inducción de adipogenic28. Utilizar un completo DMEM suplementado con 5 μg/mL de insulina, 0.5m m 3-isobutil-1-metilxantina y dexametasona μm 1. Almacenar hasta dos semanas a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 100 mL de medio de mantenimiento de adipogenic. Utilizar un DMEM completo o mixto con 50% melanoma CM suplementado con 5 μg/mL de insulina.</li>
		<li>Preparar una solución stock de aceite rojo O. Disolver 30 mg de polvo de aceite rojo O en 10 mL de isopropanol (≥ 99.5%) y mezclar por vortex. Nota: Almacenar hasta 1 año a 4 ° C.</li>
		<li>Hacer una solución de aceite rojo O de trabajo. En la capilla del humo, diluya la solución stock de aceite rojo O (en el paso 2.1.3) con agua desionizada en la proporción 3:2. Incubar la mezcla por 15 min a temperatura ambiente y filtrar con un filtro de 0,22 μm antes de su uso. Nota: Sólo use la solución de trabajo fresca dentro de 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diferenciación del adipocito
	<ol>
<li>Cultura una célula stromal línea 14F1.1 de médula ósea de ratón29 en un plato de 60 mm con un DMEM completo en el 80% de confluencia en una incubadora de 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2. Nota: Como alternativa, cambie 14F1.1 con células mesenquimales derivadas de médula ósea primaria30.</li>
		<li>Trypsinize las células con 1,5 mL de una solución de tripsina 0,25% en una incubadora durante 1 – 2 minutos.</li>
		<li>Añadir 5 mL de 10% FBS medio a las células y contar el número de células con un hemocitómetro de vidrio; Luego, ajustar la densidad celular a cerca de 1 – 2 x 105/ml.</li>
		<li>Semilla 5 x 104 de 14F1.1 células por pocillo en una placa de 24 pozos con 0,5 mL de medio de inducción de adipogenic. Después de dos días de incubación, las células alcanzan alrededor del 90% de confluencia. Nota: Este paso es muy importante. Células estromales de médula ósea no pueden ser inducidas a adipocitos sin un medio de inducción de adipogenic.</li>
		<li>Retire el medio de inducción y lavan las células dos veces con 1 mL de PBS cada vez.</li>
		<li>Cambie a 1 mL de medio de mantenimiento de adipogenic y siga a las células de la cultura hasta la maduración del adipocito. Nota: Bajo el microscopio, adipocitos como pompas de jabón pequeñas o grandes y son muy fáciles de reconocer. Generalmente, adipocytes maduros están presentes en la 6th odía 8 .</li>
		<li>Los adipocitos maduros con aceite rojo O la mancha o recoger los adipocitos para un análisis de polimerasa cuantitativa (qPCR) la reacción en cadena.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción de adipocito
	<ol>
<li>Lavado 14F1.1 diferenciadas las células x 2 con PBS y fijar en formol de 3,7% durante 1 hora.</li>
		<li>Enjuague las células en isopropanol al 60% y deje que se sequen completamente.</li>
		<li>Añadir 0,2 mL de la solución de trabajo de aceite rojo O a los pocillos e incubar a temperatura de 0.5 a 2 h.</li>
		<li>Lavar las células con agua para remover los tintes no consolidados.</li>
		<li>Foto los adipocitos teñidos bajo el microscopio de luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cocultivo de los adipocitos de la médula ósea con células de Melanoma
<ol><li>
Preparaciones
	<ol>
<li>Preparación de hueso maduro adipocitos médula: inducir a las células 14F1.1 en adipocytes maduros de BM en placas de 24 pocillos con el medio de inducción de adipogenic durante 2 días y mantenerlas en el medio de mantenimiento de adipogenic para 6 – 8 días adicionales.</li>
		<li>Preparar las células B16F10: cultura las células B16F10 en platos de 60 mm con 5 mL de medio DMEM.</li>
		<li>Humedecer la inserción de la membrana (e.g. transwell): Añadir 150 μL de medio DMEM libre de FBS a los 0,4 μm tamaño de poro de membrana insertos y sumergirlos en los pocillos de las placas de 24 pocillos con 500 μl de medio DMEM libre de FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ajuste de cocultivo
	<ol>
<li>Lentamente pipeta fuera el medio de cada inserto. Nota: No destruyen la membrana al quitar el medio.</li>
		<li>Semillas las células B16F10 (0/103105106) en los poros de 0.4 μm rellenos de paso 3.2.1.</li>
		<li>Reemplazar el medio de mantenimiento de adipogenic en los pozos con los adipocitos maduros de la médula del paso 3.1.1. con 600 μl de medio DMEM completo.</li>
		<li>La transferencia de los insertos con las células B16F10 (del paso 3.2.2) en los pozos con los adipocitos maduros de la médula (en el paso 3.2.3) para los experimentos de cocultivo.</li>
		<li>Incubar cocultures a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 días.</li>
		<li>Después de 48 h de incubación, quite los insertos del cocultivo y luego lavar los adipocitos 2 x con 500 μl de PBS 1 x. Nota: Opcionalmente, recoger las células B16F10 en los insertos para el análisis si es necesario.</li>
		<li>Los adipocitos con la solución de trabajo de aceite rojo O la mancha o recoger los adipocitos para análisis de qPCR. Nota: Consulte el procedimiento de tinción en el paso 2.3.</li>
		<li>Foto los adipocitos teñidos bajo el microscopio de luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de la Gene Signature Adipocyte-específico de qPCR
<ol><li>Agregar 0,5 mL de reactivo de aislamiento de RNA listo para su uso por pozo en una placa de 24 pocillos que adipocito maduro está listo para detectar.</li>
	<li>Seguir un protocolo estándar para la extracción de RNA y la síntesis del cDNA del31.</li>
	<li>Utilice la cartilla para 18S y GAPDH como control y CEBPα/β, PPARy, FABP4, leptina, Pref-1 o la adiponectina para la firma de gene adipocyte-específico (tabla 1).</li>
	<li>Ejecute la siguiente reacción en un termociclador: 95 ° C por 20 s, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 1 s y 60 ° C por 20 s.</li>
	<li>Utilice el método 2 deΔΔCt de–para calcular que el pliegue cambia32.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+niches+for+melanoma+cell+colonization+and+growth+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow.</a> Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).</li>
<li>Trotter, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-Lineage+Cells+Support+Growth+and+Dissemination+of+Multiple+Myeloma+in+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone.</a> The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).</li>
<li>Morris, E. V., Edwards, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bone+marrow+adipocytes+in+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis.</a> Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).</li>
<li>Diedrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+the+Warburg+phenotype+in+metastatic+prostate+tumors+via+HIF-1alpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation.</a> Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).</li>
<li>Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+and+bone+marrow%3A+how+adipocyte-rich+organs+create+tumour+microenvironments+conducive+for+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression.</a> Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).</li>
<li>Chen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+increases+melanoma+cell+growth+in+the+bone+marrow+by+inducing+osteopontin+and+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6.</a> Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).</li>
<li>Balaban, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis+links+obesity+to+breast+cancer+growth%3A+adipocyte-derived+fatty+acids+drive+breast+cancer+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration.</a> Cancer & Metabolism. 5, 1(2017).</li>
<li>Huang, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+malignant+growth+of+breast+tumours+with+monocarboxylate+transporter+2+expression+via+beta-hydroxybutyrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate.</a> Nature Communications. 8, 14706(2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI Insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocytes+stimulate+invasion+of+breast+cancer+MCF-7+cells+by+secreting+IGFBP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2.</a> PLoS One. 10 (3), 0119348(2015).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Herroon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+tumor+growth+in+bone+via+FABP4-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms.</a> Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).</li>
<li>Tabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow+Adipocytes+Facilitate+Fatty+Acid+Oxidation+Activating+AMPK+and+a+Transcriptional+Network+Supporting+Survival+of+Acute+Monocytic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells.</a> Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).</li>
<li>Wen, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+activate+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+and+autophagy+to+promote+tumor+growth+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer.</a> Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593(2017).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocytes+in+bone+marrow+protect+myeloma+cells+against+chemotherapy+through+autophagy+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation.</a> Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+Stem+Cells+Evade+Chemotherapy+by+Metabolic+Adaptation+to+an+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).</li>
<li>Templeton, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Cell+Colonization+of+the+Human+Bone+Marrow+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche.</a> Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).</li>
<li>Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+three-dimensional+levitation+tissue+culture+system+based+on+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+3D+Culture+System+to+Differentiate+Visceral+Adipocytes+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro.</a> Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+3D-Culture+Approaches+to+Study+Interactions+of+Bone+Marrow+Adipocytes+with+Metastatic+Prostate+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84(2016).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+perturbation+in+vitro--a+growing+case+for+three-dimensional+%283D%29+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+among+stromal+cell+lines+from+mouse+bone+marrow+disclosed+in+their+extracellular+matrix+composition+and+interactions+with+normal+and+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells.</a> Blood. 66 (2), 447-455 (1985).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture%2C+and+Differentiation+of+Bone+Marrow+Stromal+Cells+and+Osteoclast+Progenitors+from+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Quantification+of+Plasma+MicroRNA+Levels+in+Cynomolgus+Monkeys%2C+Using+Quantitative+Real-time+Reverse+Transcription+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56850(2018).</li>
<li>Bozec, A., Hannemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Regulation+of+Adipocyte+Numbers+in+Adult+Organisms+Through+Differentiation+and+Apoptosis+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53822(2016).</li>
<li>Shafat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+blasts+program+bone+marrow+adipocytes+to+generate+a+protumoral+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment.</a> Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).</li>
<li>Gazi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+lipid+translocation+between+adipocytes+and+prostate+cancer+cells+with+imaging+FTIR+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy.</a> The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
<li>Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+adipocyte-derived+CXCL1+and+CXCL2+contribute+to+osteolysis+in+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).</li>
<li>Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+metastasis+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Spinal metastasis in the elderly.</a> European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+adipocyte+specification+and+necrosis+augment+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation.</a> Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).</li>
<li>Bochet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+promotes+breast+tumor+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).</li>
<li>Hirano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+adipogenesis+induction+by+conditioned+media+obtained+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells.</a> Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).</li>
<li>Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+arrangement+of+eukaryotic+cells+in+merged+hydrogels+combines+the+advantages+of+3-D+and+2-D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures.</a> Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Cocultures con inserciones han sido ampliamente utilizados para el estudio de las interacciones célula a célula. El sistema de cocultivo 2D es un modo eficaz de observar cómo las dos piezas diafonía en vitro, por la que aquí mostramos dos diferentes basados en celular efectos en los adipocitos de la médula ósea. Muchos laboratorios han utilizado este método para investigar la diafonía entre los adipocitos y cáncer células6,12,<sup class="xref"...

Las metástasis óseas son frecuentes entre pacientes con cáncer avanzado, pero un tratamiento curativo no está todavía disponible. Más allá de especializado en almacenar energía como grasa, adipocitos pueden apoyar el crecimiento del tumor y metástasis en médula ósea y otros órganos1,2,3,4,5,6. Por otra parte, adipocitos desempeñan un papel esencial en la regulación del cáncer celular biología7,8,9,10 y metabolismo4,11,12 ,13,14,15,16, como así como en hueso metástasis1,4,12. En el nicho de la médula ósea, los adipocitos también pueden afectar el comportamiento biológico del cáncer las células4,6,17. La interacción entre los adipocitos de la médula ósea y las células cancerosas con osteotropism es importante para entender la metástasis del hueso. Sin embargo, poco se sabe.
Basado en los estudios actuales, diversos métodos se aplican a los adipocitos, incluyendo dos o tres dimensiones (2/3D) y ex vivo culturas17,18,19,20,21. Recientemente, Herroon et al. diseñado un nuevo enfoque de la cultura de 3D para el estudio de las interacciones de los adipocitos de la médula ósea con células de cáncer22. Aunque el cocultivo 3D es óptimo para mímico fisiológica interacciones entre adipocitos y el cáncer de células en vivo, sufre una pobre reproducibilidad22,23. En comparación con un sistema de cocultivo 2D, un sistema de cocultivo 3D puede proporcionar diferentes fenotipos celulares, como células morfología21,22,24,25,26. Además, el cultivo ex vivo de fragmentos de tejido aislado de hueso esponjoso puede conducir a un resultado robusto de adipocitos cultivados médula células17.
En contraste con los modelos anteriores, sin embargo, el modelo de cultivo celular 2D sigue siendo una técnica clásica, fiable y fácil para escanear rápidamente moléculas de candidato y los fenotipos cambiados en adipocitos o cáncer células in vitro1, 4,6,12,15,27. Para entender mejor la diafonía entre los adipocitos de la médula ósea y las células del melanoma, proporcionamos un protocolo detallado para un sistema de cocultivo 2D de los adipocitos de la médula ósea con células de melanoma.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td></td><td></td>11965092</tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metil-xantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Rojo o</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Inserto</td> <td>TranswellMillipore</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>Bio-Rad 1450016</td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadora de cultivo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL falcon</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Thermo Scientific-Microscopy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Olympus-200</td><td></td></tr> <tr><td>&mu; Puntas de pipeta en L</td><td>BeyoGold FTIP620</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 1.000 mL</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

efectos duales de factores derivados de células de melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

La diafonía entre los adipocitos de la médula ósea y las células del tumor puede jugar un papel fundamental en el proceso de metástasis del hueso. Una variedad de métodos están disponibles para el estudio de la interferencia significativa; sin embargo, un sistema de dos dimensiones transwell cocultivo sigue siendo un clásico, fiable y fácil para este estudio de la diafonía. Aquí, presentamos un protocolo detallado que muestra el cocultivo de los adipocitos de la médula ósea y las células del melanoma. Sin embargo, un sistema de cocultivo podría no sólo contribuir al estudio de transducciones de señales celulares de las células de cáncer inducidas por adipocitos de médula ósea, pero también al futuro mecanicista estudio de metástasis de hueso que puede revelar nuevas dianas terapéuticas para el hueso metástasis.

En la médula ósea, pueden aparecer adipocitos en el microambiente de tumor de13,1,33,34,35 en una etapa temprana para apoyar la progresión del tumor a través de factores solubles o activación de osteoclastogénesis6,12,36, especialmente...

Aquí, presentamos un sistema de cocultivo (2D) bidimensional sencillo y confiable para el estudio de la interacción entre las células del tumor y adipocitos de médula ósea, que revela un doble efecto de factores derivados de células de melanoma en los adipocitos de la médula ósea diferenciación y también representa un método clásico para el estudio mecanístico de la metástasis del hueso.

Efectos duales de factores derivados de células de Melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la metástasis ósea, como qué cambios se inducen en el crecimiento de los adipocitos de la médula ósea y su desarrollo en un microambiente de cáncer. Las grandes ventajas de esta técnica son que es fácil de realizar y que las moléculas candidatas se pueden obtener rápidamente. Este método puede proporcionar información sobre la diafonía entre los adipocitos de la médula ósea y las células melanomales.También se puede aplicar a otros tipos de células, como los osteoblastos. Comience sembrando dos veces 10 a la quinta células de melanoma B16F10 en un plato de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS, para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Al día siguiente, lave el cultivo de células confluentes de aproximadamente el 80% dos veces con cinco mililitros de PBS por lavado, y prive a las células con 10 mililitros de medio de cultivo libre de suero en la incubadora de cultivo celular durante 18 a 24 horas.Al día siguiente, use una pipeta para transferir el sobrenadante acondicionado a un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación y cargue el medio en una jeringa equipada con un filtro de poros de 0,45 micras. A continuación, cuela la solución en un recipiente estéril para eliminar los restos de células restantes y almacena el medio acondicionado a menos 20 grados centígrados durante un mes. Para inducir adipocitos de médula ósea, se cultivan células estromales de médula ósea F14 1.1 de ratón en una placa de 60 milímetros con DMEM completo hasta una confluencia del 80%.En la etapa apropiada de cultivo, coseche las células con 1,5 mililitros de una solución de tripsina al 0,25% durante uno o dos minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción enzimática con cinco mililitros de medio suplementado con 10% de FBS, y ajuste las células a una concentración de una a dos veces 10 a la quinta célula por mililitro con medio de cultivo fresco suplementado con suero fresco. Siembre cinco veces 10 a la cuarta celda en 0,5 mililitros de medio de inducción adipogénico por pocillo en una placa de 24 pocillos, y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante otros dos días, hasta que alcancen aproximadamente el 90% de confluencia.Luego, reemplace el sobrenadante con un mililitro de medio de mantenimiento adipogénico por pocillo y continúe cultivando las células hasta la maduración de los adipocitos. Cuando las células parezcan pompas de jabón pequeñas a grandes bajo microscopía óptica, lave estos adipocitos maduros dos veces con PBS, seguido de una fijación en 0,2 mililitros de formaldehído al 3,7% durante una hora. Enjuague las celdas fijas con isopropanol al 60% y deje que los pocillos se sequen por completo.Agregue 0,2 mililitros de solución de trabajo Oil Red O a las células para una incubación de 30 a 120 minutos a temperatura ambiente, y lave las células con agua para eliminar cualquier tinte no unido para obtener imágenes de los adipocitos mediante microscopía óptica. Alternativamente, tras su maduración, agregue 0,5 mililitros de reactivo de aislamiento de ARN listo para usar a cada pozo de cultivo de adipocitos y use los cebadores apropiados para confirmar la firma genética específica de los adipocitos de las células. A continuación, ejecute la reacción en un termociclador utilizando los ajustes indicados.Para establecer un cocultivo de células de melanoma adipocito derivado de la médula ósea, primero agregue 150 microlitros de DMEM sin suero a las cámaras internas de los insertos de membrana de 0,4 micras de tamaño de poro, y coloque cada inserto en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene 500 microlitros de medio libre de suero por pocillo. Diluya las células de melanoma B16F10 de un cultivo celular del 80 % hasta una concentración experimentalmente apropiada en un medio fresco sin suero, y reemplace el medio en la cámara interna de cada inserto con 150 microlitros de células. A continuación, reemplace el sobrenadante del medio de mantenimiento adipogénico en cada pocillo de un cultivo de adipocitos de médula ósea madura con un 90% de confluente con 600 microlitros de DMEM completo, y transfiera los insertos que contienen células de melanoma a cada pocillo de la placa de cultivo de adipocitos maduros.Cuando se hayan transferido todos los insertos, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares. Después de dos días, retire los insertos y lave el fondo de cada pocillo dos veces con 500 microlitros de PBS por lavado. A continuación, tiñir los adipocitos con la solución de trabajo Oil Red O, o analizar la expresión génica de los adipocitos mediante PCR cuantitativa, como se ha demostrado.Los adipocitos maduros diferenciados en un medio condicionado por el tumor contienen gotas de lípidos, lo que permite que los adipocitos diferenciados se identifiquen fácilmente mediante la tinción con Oil Red O. La firma génica específica de los adipocitos de estas células también puede confirmarse mediante PCR cuantitativa. Se observa una reducción en el almacenamiento de lípidos en los adipocitos cocultivados en presencia de un alto número de células de melanoma, así como una desdiferenciación en el fenotipo de los adipocitos, como lo demuestra una disminución de la expresión génica específica de los adipocitos en estas células previamente maduras.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y configurar un sistema de cocultivo 2D para estudiar las interacciones entre dos tipos de células diferentes.

dual-effects-melanoma-cell-derived-factors-on-bone-marrow-adipocytes

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este vídeo demuestra la diferenciación de las células estromales de la médula ósea (BMSC) en adipocitos. En el proceso de dos pasos, en presencia de factores de crecimiento y hormonas específicas, las BMSC indiferenciadas primero se diferencian en preadipocitos. El segundo paso, que implica el tratamiento con glucosa e insulina, conduce a la formación de adipocitos maduros con múltiples gotas de lípidos.

Diferenciación in vitro de células estromales de médula ósea de ratón en adipocitos

El tejido adiposo (AT) puede influir en la homeostasis de todo el cuerpo, por lo tanto, es importante comprender los mecanismos moleculares de la diferenciación y función de los adipocitos. Proporcionamos un protocolo para obtener nuevos conocimientos sobre estos procesos mediante el análisis de la homeostasis, la diferenciación y la exposición a la hipoxia de los adipocitos como modelo para la apoptosis inducida de los adipocitos.

Mecanismo de regulación de los números de adipocitos en los organismos adultos a través de diferenciación y apoptosis La homeostasis

En organismos multicelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas de diferentes tipos de células como resultado de la señalización paracrina. Los sistemas de cocultivo de insertos ofrecen una forma sencilla de evaluar los cambios mediados por los factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

Los métodos tradicionales de evaluación de diferenciación adipogenic son baratos y fácil de usar, pero no son específicos a los cambios en la expresión génica. Hemos desarrollado un ensayo para cuantificar la diferenciación de células mesenquimales en adipocytes maduros usando un marcador específico de linaje. Este ensayo tiene diversas aplicaciones en investigación básica y la medicina clínica.

Visualización y cuantificación del potencial de la diferenciación de células mesenquimales Adipogenic con un marcador específico de linaje

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

El siguiente procedimiento describe un método para el control espacial y temporal del inicio del tumor melanocítico en la piel dorsal murina, utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente. Este protocolo describe el inicio de melanoma cutáneo macroscópico y microscópico.

Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

En este artículo se describe un protocolo para la propagación de células tumorales circulantes por líquido cefalorraquídeo (CTC-LCR) recolectadas de pacientes con enfermedad leptomeníngea asociada a melanoma (M-LMD) para desarrollar modelos preclínicos para estudiar la M-LMD.

Ex Vivo Cultivo de células tumorales circulantes en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con melanoma para estudiar la enfermedad leptomeníngea asociada al melanoma

Aprende a establecer un sistema de cocultivo bidimensional para estudiar la interacción entre células de melanoma B16F10 y adipocitos de médula ósea. Este método permite analizar los efectos duales de factores tumorales en la diferenciación adipocitaria y explorar mecanismos de metástasis ósea en investigación oncológica.

Efectos duales de factores derivados de células de Melanoma en la diferenciación de adipocitos de médula ósea

Explorar más videos