Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

El objetivo general de este procedimiento es crear una línea de pez cebra transgénico que permita la observación de cambios eléctricos celulares durante la embriogénesis, el movimiento de las larvas y la génesis del tumor. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo, la fisiología y la biología de las células cancerosas, como ¿cuáles son las funciones fundamentales de la señalización eléctrica celular durante la embriogénesis y en las células tumorales? La principal ventaja de esta técnica es que permite rastrear la señalización eléctrica celular in vivo y en tiempo real.

Después de preparar el ARNm de la transposasa Tol2 y la solución de inyección de acuerdo con el protocolo de texto, la tarde antes de la inyección, configure de cuatro a seis tanques de cría con al menos dos machos y dos hembras. Para reducir la cantidad de desechos de peces e inducir una respuesta reproductiva, evite alimentar a los peces por la tarde. A la mañana siguiente, retire la solución inyectable preparada del congelador a menos 80 grados centígrados y colóquela en hielo.

Tire de los divisores en los tanques de cría de peces y permita que los peces se apareen. En general, los peces ponen huevos en 20 a 30 minutos. Mientras espera, con un extractor de micropipetas con los siguientes parámetros, extraiga las agujas del vidrio capilar.

Usa una toallita de laboratorio para romper el extremo de la aguja y crear un borde biselado. Se prefiere un diámetro más pequeño para disminuir la mortalidad embrionaria. Una vez que los peces hayan puesto huevos, recójalos en una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro.

Inmediatamente bajo el microscopio de disección, retire todos los embriones anormales y los desechos de los peces. A continuación, pipetea los embriones fecundados en un molde de inyección de agarosa al 3% preparado. Retire el exceso de agua para ayudar a mantener los embriones en su lugar.

Una vez que todas las filas estén llenas de embriones viables, colóquelas de manera que las células individuales estén orientadas horizontalmente en un ángulo de 45 grados con respecto a la aguja. Esto hará que la inyección sea mucho más fácil más adelante. A continuación, mientras usa guantes, use una punta de pipeta de carga de 20 microlitros para eliminar cinco microlitros de la construcción preparada del tubo en hielo.

Inserte con cuidado la punta de la pipeta en el extremo posterior del tubo capilar roto hasta donde comienza a estrecharse para que el reactivo esté lo más cerca posible de la punta y lo expulse hacia el capilar. Si todavía hay burbujas de aire, agite la aguja asegurándose de no romper la punta. Inserte la aguja directamente en el soporte de la aguja de microinyección y apriétela con cuidado hasta que la aguja permanezca en su lugar.

A continuación, ajuste el ángulo a unos 45 grados. Una vez que la aguja esté preparada y colocada, encienda el microscopio y el tanque de presión de gas. Ajuste el volumen de inyección utilizando aproximadamente 0,5 PSI para la retención y 30 PSI para la expulsión.

Compruebe que la solución se expulsa de la aguja al pisar el pedal. Usando un micrómetro de etapa con una gota de aceite mineral, ajuste el volumen y el flujo de la solución a aproximadamente 10 micrómetros de diámetro. Asegúrese de que la contrapresión permita que una pequeña cantidad de solución gotee de la aguja.

Si no hay suficiente contrapresión, la acción capilar hará que el líquido entre en la aguja y destruya el ARNm. Una vez que la aguja esté calibrada, inserte la aguja en la célula individual de los embriones fertilizados usando el borde de la muesca de gel para proporcionar un respaldo que mantenga el embrión en su lugar y permita que la aguja aplique presión sin mover el embrión. Una vez que la punta de la aguja esté en la celda individual, presione el pedal para liberar la cantidad deseada de solución.

Es importante inyectar la solución en la célula, no en la yema, para generar pez cebra transgénico. Repite este proceso para todos los embriones. Una vez finalizado, utilice una pipeta de transferencia de 3,4 mililitros y agua del sistema de peces para transferir los embriones inyectados a un plato etiquetado enjuagándolos fuera de la muesca de agarosa.

Almacene los embriones en una incubadora de 28,5 grados centígrados para que se desarrollen. Vuelva a consultar a lo largo del día para eliminar los embriones de peces muertos y reemplazar el agua con azul de metileno al 0,1% en el agua de los peces. Alrededor de seis a ocho horas después de la inyección, use 10 embriones de peces inyectados y el método hotshot para preparar el ADN genómico.

A la mañana siguiente, use un microscopio de disección con una fuente de luz fluorescente para clasificar los embriones que muestran GFP en los tejidos que no son yemas. Estos embriones deben contener la construcción inyectada. Realice un ensayo de impuestos especiales Tol2 para comprobar la actividad del transposón como se ha descrito anteriormente.

Si se puede detectar plasma extirpado, conserve los embriones de peces inyectados y críalos. De lo contrario, repita la síntesis de ARNm de Tol2 y el proceso de microinyección hasta obtener resultados positivos del ensayo de impuestos especiales de Tol2. Para obtener imágenes de embriones de pez cebra, cruza múltiples peces fundadores de la generación F2 con peces de tipo salvaje en parejas individuales.

Recoja embriones de peces en las diferentes etapas de desarrollo deseadas de acuerdo con la guía de estadificación del pez cebra. Para los embriones de peces en etapa temprana en el agua del sistema de peces, bajo un endoscopio de disección, use un par de pinzas para pelar y quitar cuidadosamente los coriones. Utilice una pipeta de transferencia de eliminación para transferir algunos embriones a un portaobjetos de vidrio cóncavo con 3% de metilcelulosa.

Luego, usando una aguja debajo de un endoscopio de disección, ajuste los embriones a las posiciones deseadas para ver la actividad celular de GFP. En el caso de los embriones en la etapa de menos de 12 somitas, utilice un microscopio compuesto de epifluorescencia con una cámara compatible y un software para la obtención de imágenes. Para embriones que superan la etapa de 12 somitas, use un microscopio de disección de fluorescencia.

Para obtener imágenes del voltaje de las células tumorales, primero identifique a los peces con tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos o MPNST. Coloque el pez en una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro y realice imágenes de todo el montaje. Finalmente, después de la toma de imágenes, diseccione el tumor antes de ver la actividad eléctrica de la célula tumoral.

En una inyección exitosa, más del 50% de los embriones inyectados mostrarán algún grado de GFP en las células somáticas y la mayoría de ellos mostrarán un resultado positivo en el ensayo de impuestos especiales de transposones Tol2. Aquí, se examinaron los cambios potenciales de membrana a lo largo del ciclo celular durante el desarrollo embrionario temprano del pez cebra. Como se ve en este video de lapso de tiempo, las células se hiperpolarizaron antes de la formación del surco de escisión.

Además, diferentes tejidos mostraron una variedad de potenciales de membrana en embriones de peces de uno a tres días de edad. Por ejemplo, la somita y el notocord estaban generalmente hiperpolarizados en comparación con los tejidos y órganos adyacentes. En este embrión de pez de dos días de edad, las actividades eléctricas neuromusculares se muestran durante el movimiento con cambios de densidad de color correspondientes a la transducción de señales eléctricas.

Se examinaron las propiedades bioeléctricas de las células cancerosas en embriones de cruces de peces reporteros ASAP1 con un mutante RPL35 que es propenso a la MPNST espontánea. En comparación con los tejidos circundantes, las células tumorales estaban más polarizadas. Una vez dominada, esta técnica de microinyección se puede realizar en unas tres horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los embriones de pez cebra deben estar en la etapa de una sola célula para obtener resultados ideales. Con su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo y la biología celular exploren in vivo los cambios de señalización eléctrica en el pez cebra y otros organismos modelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una línea de pez cebra transgénico por microinyección.