Name: Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a visualizar cambios eléctricos celulares en embriones de pez cebra y tumores usando líneas transgénicas. Este método permite el seguimiento en tiempo real de señales bioeléctricas in vivo.

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El trabajo de investigación en esta publicación fue apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R35GM124913, programa de incentivos de la Universidad de Purdue PI4D y PVM interno competitivo Programa de fondos de investigación básica. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los agentes de financiación. Agradecemos a Koichi Kawakami para la construcción de Tol2, Michael Lin para la construcción de ASAP1, y Leonard Zon para el promotor ubi construir a través de Addgene.

El pez cebra se encuentran en un centro de animales aprobados por AAALAC, y todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado de animales de Purdue y uso Comité (PACUC).
1. Tol2 Transposon plásmido construcción preparación
Nota: Tol2, un transposón que fue descubierto en los peces medaka, ha sido ampliamente utilizado en el pez cebra investigación comunidad8,9. Ha sido con éxito adoptado al puerta de enlace específica basada en la recombinación sistema de clonación y conocido como el kit de Tol210. El kit de Tol2 permite de una manera más conveniente de crear construcciones modificadas para requisitos particulares de expresión, aumentando también la eficiencia de la transgénesis. Así, fue una decisión fácil de tomar ventaja de este sistema y crear una línea de pez cebra de expresión de ASAP1 ubicua utilizando un promotor ubiquitina de validado a ASAP111.
<ol><li>Crear una entrada medio ASAP1 construcción: pDONR221-ASAP1<ol>
<li>Adquirir el concepto de sensor ASAP1 voltaje genéticamente codificado, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plásmido #52519), de Addgene. Para amplificar la región de la codificación de ASAP1, configurar una PCR utilizando los cebadores modificado para requisitos particulares (attB1-ASAP1F y attB2-ASAP1R) flanqueados por secuencias attB en el extremo 5' de los cebadores (figura 1). Polimerasa de la DNA de Phusion fue elegida por su alta eficiencia y las condiciones PCR fueron optimizadas basados en el protocolo previamente publicados12.</li>
		<li>Cargar los productos de PCR de 50 μL en un 1% TAE de gel utilizando una pipeta regular con puntas μl 200 y realizar la electroforesis a 160 V en un tanque horizontal gel durante unos 30 minutos.</li>
		<li>Compruebe el gel en un transiluminador UV (353 nm), impuesto especial a la banda deseada con un cuchilla/bisturí bajo un transiluminador UV previamente publicados13,14y puso la muestra de ADN que contienen gel en una microcentrífuga de 1.5 mL limpia tubo.</li>
		<li>Realizar la purificación del gel para los productos de PCR ASAP1. Recuperar el ADN en el gel suprimido usando un kit de purificación de gel de ADN comercial siguiendo las instrucciones del fabricante y eluir el ADN en 20 μl de agua. Toma 1 μl como una muestra y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro. Flujo de las instrucciones de software usando agua como blanco control15.</li>
		<li>Tome 100 ng de purificado producto de PCR y se mezcla con 150 ng de plásmido pDONR221 en 10 μl de TE (10 mM Tris, pH de EDTA 1 mM 8.0)16del almacenador intermediario. Añadir 2 μl de BP Clonase II en la reacción e incubar la reacción a temperatura ambiente durante la noche.</li>
		<li>En el segundo día, añadir 1 μl de proteinasa K en la reacción e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Realizar la transformación. Transferencia de la reacción y mezclar con 50 μl de Top10 competentes de e. coli las células e incubar las células en hielo durante 30 minutos. Luego, cambiar el tubo de reacción en un baño de agua de 42 ° C durante 1 minuto, inmediatamente retire el tubo e incubar en hielo durante 2 minutos. A continuación, poner el tubo en una coctelera de 37 ° C e incubar durante 1 h.</li>
		<li>Sacar el tubo y la placa de las células en una placa de LB de la kanamicina. A continuación, incubar la placa durante la noche (16-18 h) a 37 ° C.</li>
		<li>Seleccionar colonias individuales y bien separadas y sembrar en tubos de cultivo celular de 14 mL con 3 mL de medio LB. Cultura les durante la noche a 37 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm (rotación por minuto).</li>
		<li>Realizar utilizando un kit comercial miniprep siguiendo su manual de instrucción17de miniprep.</li>
		<li>Secuencia 3-4 plásmidos con Sanger secuenciación para identificar positiva pDONR221-ASAP1 reproduce con primers de secuencia M13F y M13R.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Creación de la construcción de Tol2 para microinyección: pDestTol2 -ubi-ASAP1<ol>
<li>Elegir que la secuencia medida verificada pDONR221 ASAP1 clon su concentración de ADN utilizando un siguiente espectrofotómetro la instrucción de software usando el agua como un espacio en blanco de control15.</li>
		<li>Tomar 100 μg de pDONR221-ASAP1 y se mezcla con 100 μg de plásmido de Tol2 kit 5-final (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 μg de p3E-polyA (Tol2 kit #302) y 150 μg de pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Ajustar el volumen total a 8 μl utilizando tampón TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) en una microcentrífuga de 1.5 mL tubo y mezcle bien por un vórtice breve de 2-5 s. Luego, añadir 2 μl de LR Clonase II plus e incubar la reacción a temperatura ambiente durante la noche.</li>
		<li>En el segundo día, añadir 1 μl de proteinasa K en la reacción con una pipeta μl 10 e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Realizar transformación e identificar clones positivos como se describió anteriormente (medidas 1.1.7-11).</li>
		<li>Medida de la concentración de DNA de secuencia había verificada clon pDestTol2-ubi-ASAP1 (figura 1B) utilizando un espectrofotómetro15. La concentración es generalmente alrededor de 200ng/μl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparar Tol2 transposasa mRNA y solución inyectable
<ol><li>Raya e. coli glicerol stock de plásmido pCS2FA transposasa (Tol2 kit #396) sobre una placa de LB (con ampicilina 100 en μg/mL) usando un asa de inoculación esterilizada. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora durante una noche. Al día siguiente, elige una sola Colonia e inocular él en 3 mL de LB (ampicilina 100 μg/mL) utilizando una pipeta esterilizada de 10 μl. Cultura de la noche a 37 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm.</li>
	<li>Realizar miniprep en la cultura de e. coli utilizando un kit comercial miniprep siguiendo su manual de instrucciones. Eluir el ADN plásmido en 30-50 μl de tampón TE por 1 minuto centrifugar a 14.000 rpm y medir su concentración de ADN con un espectrofotómetro.</li>
	<li>Alinear 1-2 μg de plásmido no i endonucleasa y purificar el ADN con ADN kit no me después con su manual de instrucciones de limpieza la digestión. Eluir el ADN en 5 μl de agua por centrifugación a 14.000 rpm durante 1 minuto. La concentración esperada es de 200-300 ng/μl.</li>
	<li>Realizar la transcripción en vitro con no linealizado transposasa pCS2FA como una plantilla de ADN utilizando un kit comercial de transcripción SP6.</li>
	<li>Una vez terminada la reacción, purificar Tol2 transposasa mRNA usando una limpieza de RNA comercial kit siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, procederá a la elución mRNA en 20 μl de agua libre de ARNasa y medir la concentración de RNA en un espectrofotómetro. La concentración esperada es de 1-3 μg / μl. las muestras se pueden almacenar en un congelador de-80 ° C si es necesario.</li>
	<li>Preparar la solución de microinyección mezclando 20 ng/μl pDestTol2 -ubi-ASAP1 y Tol2 transposasa mRNA (100 ng/μL) en un tubo de microcentrífuga mediante pipeteo. Para evitar la degradación de ácidos nucleicos por descongelación repetida y recongelamiento, alícuotas 6 μl por tubo y guardarlo en un congelador de-80 ° C para su uso futuro.</li>
</ol>3. microinyección
<ol><li>Set 4-6 tanques de cría con al menos 2 machos y 2 hembras la tarde antes de la inyección. Estos peces no deben ser alimentados por la tarde. Este paso será reducir la cantidad de residuos de pescado y ahorrar tiempo a limpiar por la mañana, mientras que también ayuda a inducir una respuesta de mejoramiento.</li>
	<li>A la mañana siguiente, retire la solución de la inyección preparada (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construir y mRNA de Tol2) del congelador de-80 ° C y coloque en hielo.</li>
	<li>Tire los divisores en el pescado tanques de cría y permitir a los peces para aparearse. En general, peces ponen huevos a 20-30 minutos después de sacar el divisor. Si no, espere 1-2 horas más. Algunos peces en absoluto no pueden poner huevos. En este caso, repite este experimento para colección de embriones de peces.</li>
	<li>Mientras espera, asegúrese de que hay agujas con la punta rota en un ángulo que crea un borde biselado con fórceps, o rompiendo en un limpiador de tarea delicada.<ol>
<li>Tire las agujas de vidrio capilar en un extractor de micropipeta utilizando los siguientes parámetros: calor 545; Tire de 60; velocidad 80; tiempo 250; presión de 500. Romper la aguja con pinzas por debajo de un alcance de disección (con ocular de regla para la estimación del diámetro) manteniendo el fórceps en un ángulo de aproximadamente 45 °. Diámetros de deseada de la aguja pueden ser variable dependiendo de la configuración microinyector, pero menor diámetro es preferible para reducir la mortalidad del embrión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que los peces han puesto huevos, recoger en un diámetro de 10 cm plato de Petri y llevarlos al alcance de la disección. Quitar todos los embriones anormales y desechos de pescado.</li>
	<li>Pipeta de molde los embriones fertilizados en la inyección de preparados de agarosa al 3%. Eliminar el exceso de agua para ayudar a mantener los embriones en el lugar.</li>
	<li>Una vez que todas las filas están llenas de embriones viables, disponerlos de modo que las células todas hacia la misma dirección hacia la aguja, que es aproximadamente un ángulo de 45° horizontal. Esto facilitará la inyección mucho más tarde.</li>
	<li>Usando guantes, utilizar una pipeta de carga μl 20 punta y 5 μl de la construcción dispuesta retirar el tubo en hielo.</li>
	<li>Inserte cuidadosamente la punta en el extremo posterior del tubo capilar roto hasta donde comienza a tapper, para obtener el reactivo tan cerca de la punta. Si quedan burbujas de aire, agitar la aguja, asegurándose de no romper la punta.</li>
	<li>Inserte la aguja en el portaagujas de microinyección y apriete con cuidado hasta que la aguja permanece en su lugar. Ajuste el ángulo de 45 °.</li>
	<li>Una vez que la aguja está preparada y conectada, encienda el microscopio y gas tanque de presión. Comercial CO2 tanques son generalmente buenos para este propósito. El volumen de inyección se ajusta por la presión de sujeción y eyección: aproximadamente 0,5 psi para la tenencia y 30 psi para expulsión. Asegúrese de comprobar que la solución se sale cuando se presiona el pedal.</li>
	<li>Usando un micrómetro con una gota de aceite mineral, ajustar el volumen y el flujo de la solución de ~ 150 μm de diámetro (aprox. 2 nL). Asegúrese de que la contrapresión dejó una pequeña cantidad gotear de la aguja. Si no hay suficiente presión, acción capilar produce un líquido entrar en la aguja y destruir el mRNA.</li>
	<li>Una vez que se calibra la aguja, comenzar a inyectar la construcción dentro de la célula de los embriones fecundados. Nota: Esto tiene una gran cantidad de práctica, paciencia y delicadeza, debido a la membrana de la célula es difícil de perforar. Es importante inyectar la solución en la celda, no la yema, para la generación de pez cebra transgénico. Esto es diferente de la inyección de morfolino. No importa qué lado la aguja entra en la célula, siempre y cuando la construcción va en la celda. La transgénesis tendrá una muy baja tasa de éxito si se inyecta en la yema de huevo en lugar de la célula. Inyección fase unicelular también es importante, o pez quimera somática se creará. Esto reducirá la posibilidad de que el transgén entrar a las células de germen.</li>
	<li>Utilice el borde de la ranura de gel para proporcionar un soporte que mantiene al embrión en su lugar y permite que la aguja aplicando presión sin mover el embrión. Una vez que la punta de la aguja está en la célula, presione el pedal para liberar la cantidad deseada de solución. Repita este proceso para todos los embriones.</li>
	<li>Terminada, transferir los embriones inyectados en una placa etiqueta de enjuague de la muesca de la agarosa con agua de sistema de pescado y una pipeta de transferencia desechable mL 3,4. Almacenar los embriones en una incubadora de 28,5 ° C, que les permita desarrollar. Compruebe detrás durante todo el día eliminando embriones de peces muertos y reemplazar agua con azul de metileno 0.1% en agua de pescado.</li>
	<li>Alrededor de 6-8 horas después de la inyección, tome 10 inyectado embriones de peces y preparar la DNA de genomic de ellos usando el método de Hotshot18.</li>
	<li>A la mañana siguiente, usar un microscopio de disección con una fuente de luz de fluorescencia para clasificar los embriones que GFP en los tejidos de la yema no. Estos embriones de peces deben contener la construcción inyectada.</li>
	<li>Realizar el ensayo de Tol2 impuestos especiales para comprobar la actividad del transposon como se describió anteriormente19. Si suprimido plásmido puede ser detectada, mantener la inyección embriones de peces y criarlos. Si no suprimido plásmido puede ser detectada, repita el proceso de síntesis y microinyección de Tol2 mRNA hasta lograr los resultados positivos del ensayo Tol2 impuestos especiales.</li>
</ol>4. establecer peces transgénicos ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
<ol><li>Levantar los peces inyectados (generación de F0 ) a la edad adulta como se describió anteriormente en el pez cebra libro20. Esto generalmente toma alrededor de 4 meses.</li>
	<li>Tomar un solo adultos F0 peces y cruzarlo con un sencillo frente a peces de tipo salvaje del género. Recolectar embriones de peces después de criar durante el día. Mantener los embriones de peces recogidos en la incubadora de 28,5 ° C en los peces del agua con azul de metileno 0,1%.</li>
	<li>En el tercer día, revise los embriones de peces por debajo de un microscopio de disección fluorescente con un filtro GFP. Clasificar embriones de peces verdes, si hay alguna y elevarlas a la edad adulta como peces transgénicos generación de F1 , Tg (ubi: ASAP1). Nota: Proporción mendeliana no se espera ya que la mayoría de los padres F0 peces es quimeras genética de línea germinal.</li>
	<li>Cruz sola F1 adultos peces con peces tipo salvaje y recolectar embriones de peces. Clasificar los embriones verde peces y criarlos hasta la edad adulta como de los pescados generación F2 . Nota: Verde y no verde peces embriones debe cerca de 1:1 si hay un solo transgen.</li>
	<li>Para ver los cambios de potencial eléctricos en tumor como tumores de la vaina del maligno del nervio periférico (MPNST), cruzar la generación de2 F Tg (ubi: ASAP1) pescado con pescado rpl35hi258/wt . Es conocido que los tumores visibles comienzan a encontrarse en el 6-8 meses adultos21,22.</li>
</ol>5. la proyección de imagen
<ol><li>Imagen de embriones de pez cebra, tomar a múltiples fundador de generación de2 F pescados y cruzarlos con los pescados de tipo salvaje en pares individuales. Recoger peces embriones en diferentes etapas de desarrollo deseadas según el pez cebra escenificando guía23.</li>
	<li>Para las primeras etapas de embriones de peces, pelar y quitar chorions de los embriones cuidadosamente con un par de fórceps bajo una disección en un diámetro de 10 cm placa de Petri con agua de sistema de pescado.</li>
	<li>Transferencia de unos embriones de peces en un portaobjetos de vidrio cóncava con 3% de metilcelulosa con una pipeta de transferencia desechable 3,4 mL. Ajustar los embriones a la posición deseada para ver la actividad celular de la GFP utilizando una aguja por debajo de un alcance de disección fluorescente.</li>
	<li>Para las etapas móviles de embriones de peces (más de la 12 etapa del somite), uso de mesilato de metanosulfonato de 0.05% para anestesiar los embriones de peces antes de transferirlas a las diapositivas. Brevemente, embriones de peces fueron emergió en mesilato de metanosulfonato de 0.05% en agua de pescado hasta que dejaron de natación y equilibrio del cuerpo de la pérdida. También, agregar una gota de mesilato de metanosulfonato de 0,05% con la metilcelulosa en la diapositiva.</li>
	<li>Menos de 12 embriones del pescado de la etapa del somite, usar un microscopio de epi-fluorescencia compuesto con una cámara compatible y un software para la proyección de imagen. Para mayores de 12 embriones en fase de somite pescado, usar un microscopio de disección de fluorescencia.</li>
	<li>Voltaje de la célula de tumor de la imagen, primero identificar los peces con tumores MPNST. Entonces, anestesiar el pez con mesilato de metanosulfonato de 0.05%. Para el montaje de toda la proyección de imagen, poner el pescado en un diámetro de 10 cm plato de Petri. Para ver la actividad eléctrica de la célula tumoral, tumores de pescado pueden diseca después Monte toda la proyección de imagen.</li>
</ol>

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<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomic+analysis+of+copy+number+alterations+in+human+and+zebrafish+tumors+enables+cancer+driver+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery.</a> PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+aneuploid+zebrafish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+have+genetic+alterations+similar+to+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).</li>
<li>Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).</li>
<li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque las actividades eléctricas nivel celular y tejidos durante el desarrollo embrionario y la enfermedad humana fueron descubiertas hace mucho tiempo, los en vivo eléctrica cambios dinámicos y sus papeles biológicos siguen siendo en gran parte desconocidos. Uno de los mayores retos es visualizar y cuantificar los cambios eléctricos. Tecnología de abrazadera del remiendo es una brecha para el seguimiento de las células, pero su aplicación en embriones vertebrados es limitada porque se componen de muchas célula...

Bioelectricidad se refiere a señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana de la célula1. Intercambio iónico a través de la membrana celular y el acoplado cambios actuales y potenciales eléctricos, es esencial para la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables. Además, la bioelectricidad y los gradientes de iones tienen una variedad de otras funciones biológicas importantes como almacenamiento de energía, biosíntesis y transporte de metabolitos. Señalización bioeléctrica también fue descubierto como un regulador de la formación embrionaria, como ejes del cuerpo, el ciclo celular y diferenciación de células1. Por lo tanto, es fundamental para la comprensión de muchas enfermedades congénitas humanas que resultan de la mala regulación de este tipo de señalización. Aunque abrazadera del remiendo ha sido ampliamente utilizada para la grabación de las células, está todavía lejos de ser ideal para el control simultáneo de múltiples células durante el desarrollo embrionario en vivo. Además, moléculas pequeñas sensibles de tensión no son también ideales para aplicaciones en vivo debido a su toxicidad, especificidades y sensibilidades.
La creación de una variedad de genéticamente codificado voltaje fluorescente indicadores (GEVIs) ofrece un nuevo mecanismo para resolver este problema y permite la fácil aplicación para el estudio de desarrollo embrionario, a pesar de que originalmente estaban destinados para el control neural células de2,3. Uno de los GEVIs actualmente disponibles es el Sensor acelerado de potenciales de acción 1 (ASAP1)4. Se compone de un lazo extracelular de un dominio de detección de tensión de voltaje sensibles fosfatasa y una proteína fluorescente verde permutada circularmente. Por lo tanto, ASAP1 permite la visualización de los cambios de potencial eléctricos celulares (polarización: verde brillante, despolarización: verde oscuro). ASAP1 tiene 2 ms on y off cinética y puede realizar un seguimiento de cambio potencial subliminal4. Así, esta herramienta genética permite un nuevo nivel de eficacia en bioeléctrica de la supervisión en tiempo real en células vivas. Mayor comprensión de los roles de la bioelectricidad en muchas enfermedades humanas, como el cáncer y el desarrollo embrionario se arroja nueva luz sobre los mecanismos subyacentes, que es fundamental para la prevención y tratamiento de la enfermedad.
Pez cebra se ha demostrado un potente modelo animal para estudiar la biología del desarrollo y enfermedades humanas incluyendo cáncer5,6. Comparten el 70% orthologous genes con los seres humanos, y tienen Biología vertebrado similar7. Pez cebra proporcionan cuidado relativamente fácil, un tamaño grande de huevos, manejable genética, transgénesis fácil y desarrollo embrionario externo transparente, que las hacen un sistema superior en vivo imagen5,6. Con una fuente grande de líneas de peces mutantes ya presentes y un genoma completamente secuenciado, pez cebra ofrecerá una gama relativamente ilimitada de los descubrimientos científicos.
Para investigar la en vivo en tiempo real actividad eléctrica de las células, aprovechamos el sistema de modelo de pez cebra y ASAP1. En este papel, describimos cómo incorporar el biosensor fluorescente tensión ASAP1 en el genoma del pez cebra con Tol2 transposon transgénesis y visualizar actividad eléctrica celular durante el desarrollo embrionario, larval de peces movimiento y el tumor vivo .

<table><tbody><tr><td>Tubos de cultivo celular de 14 ml</td><td>VWR</td><td>60818-725 Cultivo de</td><td>E.Coli</td></tr><tr><td>Tanque de electroforesis de agarosa</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>DNA eletroporesis</td></tr><tr><td>Agarosa RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>Para la fabricación de los geles inyectables</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F imprimación</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>Amplificación de la región codificante ASAP1 para la subclonación</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R cebador</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>Amplificación de la región codificante ASAP1 para la subclonación</td></tr><tr><td>Visor de disección de campo claro</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Decorionación, microinyección, montaje</td></tr><tr><td>Cámara a color</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Embrión de pez Grabación de imágenes</td></tr><tr><td>Corredera cóncava</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>Para sujetar embriones de peces durante el proceso de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia desechable 3,4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Embriones de peces y transferencia de agua</td></tr><tr><td>Enzima endonucleasa, no I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>Para linealizar el ADN plasmídico</td></tr><tr><td>Osciloscopio compuesto epifuorescente</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Peces Imagen de embriones</td></tr><tr><td>Epifuorescente Estereoscópica de disección</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Imagen de embriones de peces</td></tr><tr><td>Fuente de luz fluorescente</td><td>Dinámica de lúmenes</td><td>X-cite seris 120 Fuente de</td><td>luz para microscopios de fluorescencia</td></tr><tr><td>Pinzas #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Decorionación y rotura de agujas</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonasa II Mezcla de enzimas</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Clonación por recombinación de Gateway BP</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonasa II Plus</td><td>enzima Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Clonación por recombinación Gateway LR Kit de recuperación de</td></tr><tr><td>ADN en gel Zymo</td><td>Research</td><td>D4002</td><td>Purificación en gel de ADN</td></tr><tr><td>Punta de carga</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Para cargar solución inyectable en agujas capilares</td></tr><tr><td>Metilcelulosa (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>Montaje de embriones de pez</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Suprime los brotes de hongos en placas de Petri</td></tr> Molde de <tr><td>microinyección</td><td>Herramientas de ciencia adaptativa</td><td>TU-1</td><td>Para preparar bandeja de molde agaorse para sujetar embriones de peces durante la inyección</td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>WPI</td><td>Picopump neumático PV820</td><td>Inyector de microinyección</td></tr><tr><td>Micro-manipulador</td><td>WPI</td><td>Microinyector MM3301R</td><td>Operación</td></tr> de <tr><td>microinyección Extractor de micropipetas</td><td>Instrumento</td><td>Sutter P-1000</td><td>Para la preparación de aguja capilar</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>Para calibrar el volumen de inyección</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>Transcripción in vitro de ARNm</td></tr><tr><td>Cámara monocolor</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>Grabación de imágenes de embriones de peces</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>Prepare una pequeña cantidad de ADN plasmídico</td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Para sujetar peces o embriones de peces durante el proceso de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>Limpieza de ARNm después de la transcripción in vitro</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Para la medición de concentraciones de ADN y ARN</td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>Calibración de volumen de microinyección</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>amplificación de ADN para la clonación de genes</td></tr><tr><td>Pared delgada capilares de vidrio</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>Vidrio en bruto para la fabricación de aguja cappilar</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 cebador</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 cebador Tol2-exR</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Tol2 ensayo de impuestos especiales</td></tr><tr><td>TOP10 E. coli químicamente competente</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>C404006 Se utiliza para la transformación durante la clonación de genes</td></tr><tr><td>Mesilato de tricaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Para anestesiar peces o embriones de peces</td></tr><tr><td>Transiluminador UV 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V Visualización de</td><td>ADN</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>Para el proceso de transformación de la clonación de genes</td></tr></tbody></table>

visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricidad, señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana celular, juega un papel importante en la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables y muchos otros procesos biológicos, tales como embrionarias patrones del desarrollo. Sin embargo, es necesario para en vivo monitoreo de la actividad eléctrica en la embriogénesis vertebrados. Los avances de los indicadores de voltaje fluorescente genéticamente codificados (GEVIs) han hecho posible dar una solución para este desafío. Aquí, describimos cómo crear un indicador de voltaje transgénicos pez cebra utilizando el indicador de tensión establecido, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciales de acción 1), por ejemplo. El kit de Tol2 y un promotor de pez cebra ubicuo, ubi, fueron escogidos en este estudio. También explicamos los procesos de clonación de puerta de enlace específica, Tol2 pez cebra basada en transposon transgénesis y el proceso de proyección de imagen de incipiente peces peces y embriones los tumores utilizando microscopios regulares epifluorescente. Usando esta línea de peces, encontramos que hay cambios de voltaje eléctrico celular durante la embriogénesis de pez cebra y movimiento de larvas de peces. Además, se observó que en unos tumores de la vaina del nervio periférico maligno de pez cebra, el tumor de células generalmente fueron polarizadas en comparación con los tejidos normales circundantes.

En una inyección exitosa, más que embriones de pescado 50% inyectado mostrará cierta fluorescencia verde en las células somáticas, y la mayoría de ellos será positiva por análisis de impuestos sobre el consumo de transposon de Tol2 (figura 2). Después de 2-4 generaciones de hacia fuera-Cruz con peces de tipo salvaje (hasta que los peces fluorescentes alcanzan 50%, la proporción mendeliana esperada), los peces transgénicos se utilizaron para el experimento de ...

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

El objetivo general de este procedimiento es crear una línea de pez cebra transgénico que permita la observación de cambios eléctricos celulares durante la embriogénesis, el movimiento de las larvas y la génesis del tumor. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo, la fisiología y la biología de las células cancerosas, como ¿cuáles son las funciones fundamentales de la señalización eléctrica celular durante la embriogénesis y en las células tumorales? La principal ventaja de esta técnica es que permite rastrear la señalización eléctrica celular in vivo y en tiempo real.Después de preparar el ARNm de la transposasa Tol2 y la solución de inyección de acuerdo con el protocolo de texto, la tarde antes de la inyección, configure de cuatro a seis tanques de cría con al menos dos machos y dos hembras. Para reducir la cantidad de desechos de peces e inducir una respuesta reproductiva, evite alimentar a los peces por la tarde. A la mañana siguiente, retire la solución inyectable preparada del congelador a menos 80 grados centígrados y colóquela en hielo.Tire de los divisores en los tanques de cría de peces y permita que los peces se apareen. En general, los peces ponen huevos en 20 a 30 minutos. Mientras espera, con un extractor de micropipetas con los siguientes parámetros, extraiga las agujas del vidrio capilar.Usa una toallita de laboratorio para romper el extremo de la aguja y crear un borde biselado. Se prefiere un diámetro más pequeño para disminuir la mortalidad embrionaria. Una vez que los peces hayan puesto huevos, recójalos en una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro.Inmediatamente bajo el microscopio de disección, retire todos los embriones anormales y los desechos de los peces. A continuación, pipetea los embriones fecundados en un molde de inyección de agarosa al 3% preparado. Retire el exceso de agua para ayudar a mantener los embriones en su lugar.Una vez que todas las filas estén llenas de embriones viables, colóquelas de manera que las células individuales estén orientadas horizontalmente en un ángulo de 45 grados con respecto a la aguja. Esto hará que la inyección sea mucho más fácil más adelante. A continuación, mientras usa guantes, use una punta de pipeta de carga de 20 microlitros para eliminar cinco microlitros de la construcción preparada del tubo en hielo.Inserte con cuidado la punta de la pipeta en el extremo posterior del tubo capilar roto hasta donde comienza a estrecharse para que el reactivo esté lo más cerca posible de la punta y lo expulse hacia el capilar. Si todavía hay burbujas de aire, agite la aguja asegurándose de no romper la punta. Inserte la aguja directamente en el soporte de la aguja de microinyección y apriétela con cuidado hasta que la aguja permanezca en su lugar.A continuación, ajuste el ángulo a unos 45 grados. Una vez que la aguja esté preparada y colocada, encienda el microscopio y el tanque de presión de gas. Ajuste el volumen de inyección utilizando aproximadamente 0,5 PSI para la retención y 30 PSI para la expulsión.Compruebe que la solución se expulsa de la aguja al pisar el pedal. Usando un micrómetro de etapa con una gota de aceite mineral, ajuste el volumen y el flujo de la solución a aproximadamente 10 micrómetros de diámetro. Asegúrese de que la contrapresión permita que una pequeña cantidad de solución gotee de la aguja.Si no hay suficiente contrapresión, la acción capilar hará que el líquido entre en la aguja y destruya el ARNm. Una vez que la aguja esté calibrada, inserte la aguja en la célula individual de los embriones fertilizados usando el borde de la muesca de gel para proporcionar un respaldo que mantenga el embrión en su lugar y permita que la aguja aplique presión sin mover el embrión. Una vez que la punta de la aguja esté en la celda individual, presione el pedal para liberar la cantidad deseada de solución.Es importante inyectar la solución en la célula, no en la yema, para generar pez cebra transgénico. Repite este proceso para todos los embriones. Una vez finalizado, utilice una pipeta de transferencia de 3,4 mililitros y agua del sistema de peces para transferir los embriones inyectados a un plato etiquetado enjuagándolos fuera de la muesca de agarosa.Almacene los embriones en una incubadora de 28,5 grados centígrados para que se desarrollen. Vuelva a consultar a lo largo del día para eliminar los embriones de peces muertos y reemplazar el agua con azul de metileno al 0,1% en el agua de los peces. Alrededor de seis a ocho horas después de la inyección, use 10 embriones de peces inyectados y el método hotshot para preparar el ADN genómico.A la mañana siguiente, use un microscopio de disección con una fuente de luz fluorescente para clasificar los embriones que muestran GFP en los tejidos que no son yemas. Estos embriones deben contener la construcción inyectada. Realice un ensayo de impuestos especiales Tol2 para comprobar la actividad del transposón como se ha descrito anteriormente.Si se puede detectar plasma extirpado, conserve los embriones de peces inyectados y críalos. De lo contrario, repita la síntesis de ARNm de Tol2 y el proceso de microinyección hasta obtener resultados positivos del ensayo de impuestos especiales de Tol2. Para obtener imágenes de embriones de pez cebra, cruza múltiples peces fundadores de la generación F2 con peces de tipo salvaje en parejas individuales.Recoja embriones de peces en las diferentes etapas de desarrollo deseadas de acuerdo con la guía de estadificación del pez cebra. Para los embriones de peces en etapa temprana en el agua del sistema de peces, bajo un endoscopio de disección, use un par de pinzas para pelar y quitar cuidadosamente los coriones. Utilice una pipeta de transferencia de eliminación para transferir algunos embriones a un portaobjetos de vidrio cóncavo con 3% de metilcelulosa.Luego, usando una aguja debajo de un endoscopio de disección, ajuste los embriones a las posiciones deseadas para ver la actividad celular de GFP. En el caso de los embriones en la etapa de menos de 12 somitas, utilice un microscopio compuesto de epifluorescencia con una cámara compatible y un software para la obtención de imágenes. Para embriones que superan la etapa de 12 somitas, use un microscopio de disección de fluorescencia.Para obtener imágenes del voltaje de las células tumorales, primero identifique a los peces con tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos o MPNST. Coloque el pez en una placa de Petri de 10 centímetros de diámetro y realice imágenes de todo el montaje. Finalmente, después de la toma de imágenes, diseccione el tumor antes de ver la actividad eléctrica de la célula tumoral.En una inyección exitosa, más del 50% de los embriones inyectados mostrarán algún grado de GFP en las células somáticas y la mayoría de ellos mostrarán un resultado positivo en el ensayo de impuestos especiales de transposones Tol2. Aquí, se examinaron los cambios potenciales de membrana a lo largo del ciclo celular durante el desarrollo embrionario temprano del pez cebra. Como se ve en este video de lapso de tiempo, las células se hiperpolarizaron antes de la formación del surco de escisión.Además, diferentes tejidos mostraron una variedad de potenciales de membrana en embriones de peces de uno a tres días de edad. Por ejemplo, la somita y el notocord estaban generalmente hiperpolarizados en comparación con los tejidos y órganos adyacentes. En este embrión de pez de dos días de edad, las actividades eléctricas neuromusculares se muestran durante el movimiento con cambios de densidad de color correspondientes a la transducción de señales eléctricas.Se examinaron las propiedades bioeléctricas de las células cancerosas en embriones de cruces de peces reporteros ASAP1 con un mutante RPL35 que es propenso a la MPNST espontánea. En comparación con los tejidos circundantes, las células tumorales estaban más polarizadas. Una vez dominada, esta técnica de microinyección se puede realizar en unas tres horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los embriones de pez cebra deben estar en la etapa de una sola célula para obtener resultados ideales. Con su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo y la biología celular exploren in vivo los cambios de señalización eléctrica en el pez cebra y otros organismos modelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una línea de pez cebra transgénico por microinyección.

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Fuente: Williams, A. L., et al. Imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de células de cresta neural migratorias en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un protocolo de imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar la migración de las células de la cresta neural en un embrión de pez cebra en tiempo real con alta resolución.

Visualización de la migración de células de la cresta neural en un embrión de pez cebra mediante imágenes de lapso de tiempo multifotónicas

Un método simple para registrar los potenciales de campo extracelular en el cerebro anterior de las larvas de pez cebra se describe. El método proporciona una...

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Imágenes del desarrollo cerebrovascular en larvas de pez cebra se describe. También se proporcionan técnicas para facilitar la proyección de imagen 3D y modificar desarrollo cerebrovascular el uso de tratamientos químicos.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

Aprende a visualizar cambios eléctricos celulares en embriones de pez cebra y tumores usando líneas transgénicas. Este método permite el seguimiento en tiempo real de señales bioeléctricas in vivo.

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