Valoración de ELISA como método para determinar la constante de disociación de la interacción del ligando del Receptor

El objetivo general de esta titulación ELISA es determinar la constante de afinidad de dos socios de unión de manera reproducible y eficiente utilizando un nuevo algoritmo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave no solo en el campo de la interacción proteína-ligando e investigación de receptores, sino también en ciencias de la vida aplicadas como la investigación farmacéutica y la farmacología. La principal ventaja de esta técnica es que la constante de afinidad de una interacción receptor-ligando puede determinarse fácilmente mediante la titulación de un receptor con un ligando en una placa ELISA y utilizando un nuevo algoritmo de evaluación.

Comience este procedimiento diluyendo la solución de stock del Dominio A de Integrina Alfa 2 a una concentración final de cinco microgramos por mililitro en tampón TBS cloruro de magnesio. En esta demostración se utilizará tanto una forma de tipo salvaje como una forma mutante del Dominio A de Integrina Alfa 2. Llene cada pozo de una fila en una placa de microtitulación de media área con 50 microlitros de la solución de recubrimiento del Dominio A de Integrina Alfa 2.

Realice cada fila de titulación al menos por duplicado. En este ejemplo, cada fila de titulación se realiza por cuádruple. Selle la placa con papel de aluminio y deje la placa a cuatro grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento y llene cada pozo con 15 microlitros de tampón TBS cloruro de magnesio. Retire la solución de lavado y llene los pozos con nueva solución de lavado. Los lavados eliminarán las moléculas de receptor solubles que no se han inmovilizado en la superficie de plástico por absorción física.

El siguiente paso es bloquear los sitios de unión no específicos añadiendo 50 microlitros de una solución de BSA al uno por ciento en tampón TBS cloruro de magnesio a cada pozo. Vuelva a sellar la placa e incube a temperatura ambiente durante una hora. Mientras los pozos de la placa de microtitulación se están bloqueando con BSA, prepare una dilución en serie del ligando Rodocetina.

En este caso, se utiliza una concentración inicial de 243 Rodocetinas con esmalte erosionado y un factor de dilución de 2.3. Para las ocho curvas de titulación en este experimento, prepare 920 microlitros de solución de Rodocetina a la concentración más alta en un uno por ciento de BSA en TBS cloruro de magnesio en el tubo de ensayo número uno. Pipetee 520 microlitros de solución de BSA al uno por ciento en TBS cloruro de magnesio en cada uno de los otros diez tubos de ensayo etiquetados del dos al once.

Transfiera 400 microlitros de la solución de Rodocetina de tubo de ensayo a tubo de ensayo dos. Mezcle ambas soluciones mediante chut-ter-a-ción y luego transfiera 400 microlitros de esta mezcla al tubo de ensayo tres. Continúe esta dilución en serie hasta el tubo de ensayo once.

Para el éxito de este procedimiento, es importante siempre llenar rápidamente cada pozo con solución para asegurarse de que los pozos no se sequen. Al finalizar la incubación de una hora, retire la solución de bloqueo de los pozos de la placa de microtitulación. Agregue inmediatamente 50 microlitros de la solución de Rodocetina del tubo de ensayo uno en los pozos de la columna uno, la solución del tubo de ensayo dos a los pozos de la columna dos y continúe hasta la columna once.

Agregue 50 microlitros de BSA al uno por ciento y TBS cloruro de magnesio como control libre de ligando a los pozos de la columna doce. Vuelva a sellar la placa e incube a temperatura ambiente durante una hora y media. Para eliminar las moléculas de ligando no unidas, retire la solución de unión y llene cada pozo con 50 microlitros de tampón HBS cloruro de magnesio.

Luego retire el tampón HBS y agregue nuevo tampón HBS. Para fijar químicamente el receptor y el ligando unido, llene cada pozo de la placa de microtitulación con 50 microlitros de una solución de glutaraldehído al 2.5 por ciento en tampón HBS cloruro de magnesio. Incubar la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante diez minutos.

Retire y inactiva el exceso de glutaraldehído retirando la solución de fijación y llenando cada pozo con 50 microlitros de tampón TBS cloruro de magnesio. Retire el tampón de lavado y agregue nuevo tampón de lavado a cada pozo. Para comenzar este ensayo, retire el tampón de lavado de todos los pozos de la placa de microtitulación y agregue a cada pozo 50 microlitros de la solución de anticuerpo primario, diluida de uno a dos mil en un uno por ciento de BSA TBS cloruro de magnesio.

Vuelva a sellar la placa e incube a temperatura ambiente. Retire la solución de anticuerpo primario de todos los pozos y agregue a cada pozo 50 microlitros de tampón TBS cloruro de magnesio. Lave tres veces con tampón TBS cloruro de magnesio.

A continuación, agregue a cada pozo 50 microlitros de la solución de anticuerpo secundario, diluida de uno a dos mil en un uno por ciento de BSA en TBS cloruro de magnesio. Vuelva a sellar la placa y déjela reposar a temperatura ambiente. Retire la solución de anticuerpo secundario de los pozos y agregue a cada pozo 50 microlitros de tampón TBS cloruro de magnesio.

Lave tres veces. Después del tercer lavado, golpee la placa de microtitulación sobre un paño de papel para eliminar todos los rastros de líquido. Con una pipeta multicanal, agregue rápidamente 50 microlitros de la solución de detección de fosfatasa alcalina a cada pozo de la placa de microtitulación para iniciar la conversión enzimática lo más simultáneamente posible.

Incúbela a temperatura ambiente hasta que la solución en los pozos con la concentración de ligando más alta se vuelva amarilla. Dependiendo de la intensidad de la señal, el tiempo de incubación puede variar entre cinco minutos y una hora. Deténgase la conversión del sustrato de fosfatasa usando una pipeta multicanal para agregar 50 microlitros de una solución de hidróxido de sodio 1.5 molar a cada pozo en el mismo orden en que se agregó la solución de detección de fosfatasa alcalina.

Deja la placa durante varios minutos para asegurar una mezcla libre de estrías de ambas soluciones. Mida la densidad óptica a 405 nanómetros de cada pozo usando un lector ELISA. Comience el análisis de datos abriendo la tabla de datos brutos.

Copie las columnas del archivo de Excel, abra Graph Pad Prism Five, abra un nuevo archivo de proyecto en el menú principal y, bajo nuevo dato y gráfica, elija el formato X Y. Elija la opción Ingresar y trazar un punto único para cada valor para el eje Y y péguelas en la hoja de datos de Graph Pad Prism como valores X e Y respectivamente. Transponga los valores de densidad óptica a 405 nanómetros a un formato de columna.

En la hoja de datos, la primera columna representa las concentraciones como ligando añadido como valores X, mientras que las columnas a la derecha contienen los valores de señal de las ocho curvas de titulación como valores Y. Como se dibujará un gráfico semilogarítmico, se elimina la última fila, que cuenta las señales de los controles libres de ligando, concentración cero. Graph Pad Prism dibuja el gráfico que se ve en la sección de gráficos.

Para el eje X, se selecciona una escala semilogarítmica. El eje X muestra los valores de señal medidos como valores OD a 405 nanómetros. Al hacer doble clic en cualquiera de los símbolos, se pueden seleccionar y marcar con forma y color simples.

Los valores de titulación para la forma de tipo salvaje se resaltan con círculos en diferentes tonos de rojo, mientras que las señales de titulación para la forma mutante se marcan con cuadrados azules. Abra el subprograma de análisis y bajo Análisis X Y, elija la opción Regresión no lineal y presione el botón Nuevo para crear una nueva ecuación. Escriba la ecuación de la curva de