Implantación de injertos vasculares Electrospun con estructura optimizada en un modelo de rata

El objetivo general de esta intervención quirúrgica es trasplantar un injerto vascular electrohilado en una aorta abdominal de rata y evaluar el rendimiento a largo plazo del injerto. Este método ha sido establecido por el profesor Deling Kong y otros colegas de nuestro grupo, y puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de los injertos vasculares electrohilados, como el efecto de la estructura y las propiedades superficiales del injerto en la regeneración vascular. La principal ventaja de esta técnica es que tiene una buena repetibilidad y una alta tasa de supervivencia animal.

Además, el modelo animal es fácil de manejar a bajo costo. Este trabajo será dirigido por nuestro colega, el doctor Wang. Para comenzar, prepare la solución polimérica disolviendo policaprolactona en una mezcla de 1 a 5 de metanol y cloroformo, y revolviéndola a temperatura ambiente durante 12 horas.

Cargue la solución de polímero en una jeringa de vidrio de 10 mililitros y equípela con una aguja roma de calibre 21. Luego, coloque un mandril de acero inoxidable en el instrumento de recolección y asegúrese de que esté correctamente conectado a tierra. Ajuste la distancia de trabajo desde la punta de la aguja hasta el colector a 17 centímetros para la solución de policaprolactona al 25%.

A continuación, ajuste el caudal de la bomba de jeringa a ocho mililitros por hora. A continuación, ajuste el voltaje de la fuente de alimentación a 11 kilovoltios y comience a girar el mandril a 40 RPM para recolectar fibras electrohiladas para una distribución adecuada de la fibra. Con todo ya configurado, encienda la fuente de alimentación y la bomba de jeringa para comenzar a recolectar las fibras electrohiladas.

Después de 4,5 minutos, apague la bomba de jeringa, la fuente de alimentación y el motor del mandril. Deje que el injerto se seque en la campana durante una hora. Luego, retire el injerto del mandril con alcohol absoluto y colóquelo en el vacío durante la noche para eliminar el solvente residual.

Esterilice el injerto con óxido de etileno y déjelo secar en una campana de contención biológica estéril. Utilizando técnicas estándar, obtenga imágenes SEM del lumen de los injertos e impórtelas a ImageJ. Utilice las herramientas de medición para medir tanto el diámetro de la fibra como el tamaño medio de los poros de cada imagen, a fin de garantizar la coherencia de las muestras.

Para obtener información sobre las propiedades mecánicas del material de injerto, primero corte un andamio tubular en secciones de tres milímetros con una cuchilla de afeitar. Luego, use calibradores para medir el grosor de los andamios. A continuación, cargue los andamios en las mordazas de una máquina de ensayos de tracción, de modo que quede un milímetro entre las mordazas.

Sostenga los andamios axialmente, a una velocidad de 10 milímetros por minuto, hasta que se rompan. Asegúrese de registrar tanto la resistencia a la tracción como el alargamiento final a la rotura de las muestras. Antes de la cirugía, se ayunaron ratas macho Sprague Dawley, con un peso de 240 a 270 gramos, durante 24 horas antes de la cirugía de implantación.

Anestesiar a la rata y prepararla para la cirugía como se describe en el protocolo de texto adjunto. Confirme la anestesia adecuada asegurándose de que la rata tenga los músculos relajados y una respiración constante. Luego, coloque a la rata debajo del microscopio quirúrgico en posición supina.

Con unas tijeras quirúrgicas, realice una incisión de laparotomía de línea media de cuatro a cinco centímetros de largo y exponga la cavidad abdominal. Retraiga y envuelva cuidadosamente los intestinos con una gasa humedecida con solución salina. Mientras mira a través del microscopio quirúrgico, separe la aorta abdominal de los tejidos adyacentes.

Identifique y lige todas las ramas pequeñas de la aorta descendente, utilizando suturas de nailon monofilamento 9-0. A continuación, utilice pinzas vasculares para sujetar hasta una sección aislada de un centímetro de la aorta. Luego, use un par de microtijeras para seccionar la aorta abdominal entre las pinzas.

Enjuague los dos extremos de la aorta con solución salina heparinizada para eliminar la sangre residual. Despegue las adventicias de la aorta pinzada con unas microtijeras. Luego, coloque una sección de un centímetro de largo del injerto esterilizado en el espacio creado por la sección de aorta extraída.

Usando suturas de nailon monofilamento 9-0, construya cuatro anastomosis usando un patrón de sutura en forma de ocho a las nueve en punto, tres en punto, 12 en punto y luego seis en punto en las posiciones del lado proximal. A continuación, construya las otras cuatro anastomosis entre cada una de las suturas en el lado proximal. Coloque el injerto verticalmente para mostrar el intervalo igual entre los ocho puntos bajo el microscopio quirúrgico.

Una vez finalizada la sutura proximal, repetir el proceso en el lado distal. Una vez que se haya unido el injerto, retire la pinza distal para permitir que la sangre fluya hacia el injerto, luego retire la pinza proximal. Con una bola de algodón estéril, aplique presión para detener cualquier sangrado observado en los puntos de sutura.

Presione durante unos tres minutos, hasta que se produzca la hemostasia. A continuación, regrese los intestinos a la cavidad abdominal y enjuague la cavidad abdominal con una solución salina fisiológica tibia que contenga gentamicina. A continuación, cose la pared abdominal con una sutura de nailon 3-0 en las capas de músculo y piel.

Use yodo en la incisión después de la cirugía solo una vez. Regrese la rata a la compañía de otras personas una vez que se haya recuperado por completo. La concentración de policaprolactona en la solución de electrohilatura puede afectar tanto el diámetro de la fibra como las propiedades mecánicas de los injertos.

La solución al 25% de mayor concentración produce injertos vasculares con fibras más gruesas y poros más grandes que la solución al 10%. Después de tres meses in vivo, la tinción histológica reveló una capa de tejido nuevo formada en la luz del injerto y una cantidad significativa de deposición de colágeno dentro del propio injerto. Esta nueva capa de tejido está revestida de células endoteliales, debajo de las cuales se puede encontrar una capa de células musculares lisas y elastina alineadas circunferencialmente.

Después de 12 meses in vivo, el nuevo tejido parecía bien integrado y las capas endotelial y de músculo liso permanecieron intactas. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una o dos horas, si se realiza adecuadamente. Después de ver este procedimiento, se pueden realizar otras medidas, como el ultrasonido Doppler en color, para responder preguntas adicionales, como Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fabricar los injertos vasculares electrohilados y evaluar su rendimiento in vivo en un modelo de reemplazo de arteria abdominal de rata.