Name: Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprenda a aislar capilares cerebrales de tejido humano fresco mediante centrifugación en gradiente de densidad. Este método permite estudiar la barrera hematoencefálica intacta y sus vías de señalización en condiciones fisiológicas.

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Agradecemos y reconocemos el Dr. Peter Nelson y Sonya Anderson en el Banco de tejido cerebral de UK-ADC para proporcionar cerebro humano todas las muestras de tejido (NIH número de concesión: P30 AG028383 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento). Agradecemos a Matt Hazzard y Tom Dolan, servicios de tecnología de información, tecnología académica y compromiso de la Facultad, Universidad de Kentucky para asistencia gráfica. Este proyecto fue apoyado por 1R01NS079507 número de subvención del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular (por B.B.) y grant número 1R01AG039621 del Instituto Nacional sobre el envejecimiento (a A.M.S.H.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular o el Instituto Nacional sobre envejecimiento. Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

La siguiente información se basa en la seguridad actual y normas reglamentarias de la Universidad de Kentucky, Lexington, KY, Estados Unidos. Como precaución de seguridad, consulte programa de seguridad biológica de la institución y los reglamentos y recomendaciones más actuales antes de trabajar con tejido humano.
PRECAUCIÓN: Tejido humano puede ser una fuente de patógenos transmitidos por la sangre, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (HCV) y otros. Trabajo con tejido humano plantea el riesgo de infección de patógenos de la sangre. Por lo tanto, ciertas consideraciones reglamentarias y de seguridad son imprescindibles cuando se trabaja con tejido humano para proteger al personal de laboratorio. Trabajo con tejidos humanos en los Estados Unidos requiere de un laboratorio de bioseguridad nivel 2, así como las precauciones de seguridad y formación de acuerdo con el NIH sección IV-B-7, Ley de OSHA de 1970 cláusula 5(a)(1) y el programa de seguridad institucional. En general, se debe obtener aprobación del Comité de bioseguridad institucional o junta de revisión institucional antes de realizar cualquier investigación con materiales humanos (tejido, fluidos corporales). La formación es necesaria para todo el personal trabajando con materiales humanos e incluye entrenamiento de seguridad de laboratorio básico, e.g., químicos de higiene y seguridad en el laboratorio, así como formación específica sobre seguridad biológica, residuos peligrosos y ser humano patógenos de la sangre. Todo el personal trabajando con materiales humanos es muy recomendables para obtener vacunas de Hepatitis B, antes de trabajar con materiales humanos. Personal se requiere usar equipo de protección personal específico al trabajar con materiales humanos, por ejemplo., una bata de laboratorio con manguito y un rostro protector y guantes en todo momento. Todo el trabajo se realiza en un gabinete de bioseguridad (clase 2). Todo el equipo que viene en contacto con materiales humanos y cualquier desecho de materiales humanos es manejado adecuadamente para evitar contaminación o infección del personal. Todos los equipos y las superficies se limpian con etanol del 10% cloro y 75% después de cada procedimiento con materiales humanos. Un derrame con materiales humanos debe limpiarse inmediatamente para arriba. La cristalería es esterilizada después de cada uso. Residuos, incluyendo el tejido humano no fijado, es recogido en una bolsa para residuos biológicos marcados y esterilizado. Objetos punzantes se recogen en un recipiente imperforable y fuga etiquetado como riesgo biológico. Todos los residuos de materiales humanos está dispuesto según las normas de seguridad biológica de la institución.
Nota: Nuestro laboratorio obtiene muestras frescas de corteza frontal de personas fallecidas a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M). Criterios de inclusión son: inscripción en el estudio de cohorte longitudinal autopsia de UK-ADC y un intervalo Post Mortem (PMI) ≤4 h64. Las autopsias siguen un protocolo estándar y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas65. Un PMI corto de menos de 4 h es de máxima importancia para asegurar viabilidad capilar después de aislamiento. Puede utilizarse tejido fresco y congelado. Si la congelación es necesaria, tejido cerebral humano recién obtenida debe ser choque congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C. Tejido fresco o descongelado debe ser almacenado en búfer de aislamiento (véase abajo) y procesado rápidamente. Encontramos que 10 g de tejido fresco de humano rendimientos alrededor de 100 mg de capilares del cerebro (peso húmedo).
1. configuración
<ol><li>
Preparación de buffer Nota: El volumen de amortiguamiento necesitada depende de la cantidad de tejido. Todos los volúmenes de buffer en el siguiente protocolo se basan en 10 g de tejido de la corteza del cerebro humano.<ol>
<li>L de tampón de aislamiento: Uso 1,5 L de salino tamponado con fosfato de Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, Na2HPO4de 8,1 mM, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) y suplemento con D-glucosa (1,35 g de 5 mm. ) y piruvato de sodio 1 mM (0,165 g). Después de agregar la glucosa y del piruvato, ajustar a pH 7,4 con hidróxido de sodio. Enfriar y almacenar la solución a 4 ° C antes de usar.</li>
		<li>Albúmina de suero bovino (BSA): Añadir 10 g de polvo de BSA a 1 L de tampón de aislamiento a una concentración final de BSA 1%. Revolver lentamente para evitar burbujas, ajustar a pH 7,4 y almacenar a 4 ° C durante la noche. Inmediatamente antes de su uso, Revuelva suavemente; evitar la formación de burbujas para evitar la desnaturalización de la albúmina.</li>
		<li>medio de gradiente de densidad: pesar 18 g de medio de gradiente de densidad en un frasco de vidrio y agregar una barra de agitación magnética. Añadir 60 mL de tampón de aislamiento y agite vigorosamente por 5 minutos hasta que todo el polvo se suspende. Tienda durante la noche a 4 ° C para permitir que el medio de gradiente de densidad disolver. Agitar durante 10 minutos antes de usar.</li>
		<li>Almacenar todos los búferes a 4 ° C; Mantenga todas las herramientas y buffers en el hielo durante el procedimiento de aislamiento completo. Revolver todos los búferes antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disposición experimental
	<ol>
<li>Montar la mano del mortero de la amoladora de Potter-Elvehjem tejido sobre el agitador electrónico de arriba. Coloque el molinillo de tejido de Potter-Elvehjem y los homogeneizadores Dounce con mortero en el hielo bajo el capó. Preparar una malla de filtro de 300 μm (5 x 5 cm2), doblar a un cono e insertar y adjuntar a una 50 mL tubo Falcon con cinta adhesiva (figura 1A).</li>
		<li>Aros de conexión y filtros de la tensión de la célula (tamaño de poro: 30 μm) en tubos Falcon de 50 mL. Preparar bolsas de residuos biosanitarios hospitalarios. Colocar los equipos en la seguridad de la biotecnología gabinete (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de muestras de cerebro
Nota: La figura 1A muestra la tabla de flujo del procedimiento de aislamiento completo que se describe a continuación. Tejido cerebral humano puede provenir de cualquier parte de la corteza y puede utilizarse fresco o congelado. Tejido cerebral congelado puede ser descongelado a temperatura ambiente (sin buffer; ~ 30 min para 10 g). Para obtener resultados comparables, el tejido cerebral se debe obtener de la misma región del cerebro para cada experimento. Este protocolo está optimizado para fresco (PMI < 4 h) corteza cerebral humana que no ha sido congelada.
<ol><li>Preparación del tejido de cerebro humano: documentar el peso de los tejidos del cerebro. Todos los números en el siguiente protocolo están apropiados para 10 g de tejido cerebral humano fresco. Coloque el tejido de cerebro en un plato de Petri de 100 mm. Remueva cuidadosamente las meninges con fórceps. Utilice un bisturí para cortar la materia blanca.</li>
	<li>Picado del tejido de cerebro humano: cuidadosamente corte el tejido de cerebro y picar con un bisturí. Carne picada durante unos 5 minutos (piezas de 2 – 3 mm). Transferir el tejido cerebral a la amoladora de tejido de Potter-Elvehjem. Añadir 30 mL de tampón de aislamiento. Nota: Las piezas de tejido picada son difíciles de ver ya que el tejido cerebral se convierte en ruido de fondo durante el proceso de picado.</li>
</ol>3. homogeneización
<ol><li>Amoladora de tejido Potter-Elvehjem (distancia: 150 – 230 μm): homogeneizar cada muestra con 100 golpes a una velocidad de homogeneizador de 50 rpm. Documentar el tiempo cada 25 golpes y el tiempo total necesario para 100 golpes. Vea la tabla 1 para un protocolo propuesto homogeneización; el tiempo total para homogeneizar 10 g de corteza frontal humana es alrededor de 22 minutos. No agregue el aire para evitar burbujas.</li>
	<li>Homogeneizadores Dounce (distancia: 80 a 130 μm): transferir el homogeneizado a un homogeneizador Dounce en hielo. Homogeneizar la suspensión con 20 golpes (~ 6 s/movimiento, total de ~ 2 minutos). Evitar las burbujas.</li>
</ol>4. centrifugación
<ol><li>Distribuir el homogeneizado de cerebro igualmente en cuatro tubos de centrifugación de 50 mL y documento el volumen total del homogeneizado. Distribuir 50 mL de tampón de gradiente de densidad en los tubos de centrifugación (12,5 mL por tubo). Utilizar 10 mL de tampón de aislamiento enjuagar el mortero y homogeneizador, y distribuir en los cuatro tubos de centrifugación (~2.5 mL por tubo).</li>
	<li>Cierre firmemente los tubos de centrifugadora con tapas. Mezclar el homogeneizado, medio de gradiente de densidad y amortiguación agitando vigorosamente los tubos. Centrifugue a 5.800 x g durante 15 min a 4 ° C (rotor de ángulo fijo); Seleccione una velocidad de deceleración media para mantener el sedimento al tubo. Deseche el sobrenadante y resuspender cada precipitado en 2 mL de 1% de BSA.</li>
</ol>5. filtración
Nota: Para separar los tubos capilares de células de sangre rojas y otros restos celulares, son necesarios varios pasos de filtración.
<ol><li>malla de 300 μm: después de volver a suspender el precipitado, filtrar la suspensión a través de la malla de 300 μm. Los capilares se filtran a través de la malla, mientras que los buques más grandes y más grandes desechos de cerebro permanecen en la malla. Lavar cuidadosamente la malla con hasta 50 mL de 1% de BSA. Deseche la malla. Nota: Este paso de filtración elimina la suspensión capilar de vasos o trozos de restos de cerebro más grande.</li>
	<li>
Filtro de tensión de celda 30 μm Nota: Este paso de filtración separa los capilares de células de sangre rojas y otros desechos del cerebro.<ol>
<li>Distribuir el filtrado capilar en el paso 6.1 sobre los filtros de cinco 30 μm células cepa (aproximadamente 10 mL del filtrado capilar por filtro de tensión de la célula). Los capilares son retenidos por este filtro, mientras que los glóbulos rojos, células y desechos pequeños del cerebro pasan por el filtro y se recogen en el filtrado.</li>
		<li>Lavar cada filtro con 25 mL de 1% de BSA. Luego, vierta todos filtrados sobre el sexto filtro para aumentar el rendimiento. Lavar cada filtro con 50 mL de 1% de BSA; mantener la célula cepa filtros que contienen los capilares y descartar el filtrado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. colección capilar
<ol><li>Invierta los filtros y lavar los tubos capilares con 50 mL de 1% de BSA para cada filtro en tubos de 50 mL. Suavemente aplique presión con la punta de la pipeta de una pipeta de 5 mL y moverse a través del filtro para lavar los tubos capilares del cerebro.</li>
	<li>Asegúrese de lavar todos los capilares del cerebro, especialmente desde el borde del filtro. Evitar las burbujas ya que esto dificulta el proceso de filtración y aumenta la probabilidad de pérdida capilar.</li>
</ol>7. lavado
<ol><li>Después de recoger los tubos capilares, centrifugar las muestras a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C (cubo rotor oscilante). Quite el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en aproximadamente 3 mL de tampón de aislamiento. Combinar todos los pellets resuspendidos de una muestra en un tubo cónico de 15 mL y llenarlo con tampón de aislamiento. Centrifugar nuevamente a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C y lave dos veces más.</li>
	<li>Documentar la pureza capilar con un microscopio (100 aumentos) y cámara (figura 1B). Nota: El rendimiento capilar del cerebro de 10 g de tejido cerebral humano es generalmente alrededor de 100 mg. Los capilares del cerebro aislado ahora pueden ser utilizados para experimentos, procesados (e.g., Lisado, aislamiento de membrana), o ser flash-congeladas y almacenadas a-80 ° C en criotubos por un mínimo de 6 – 12 meses (evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente Protocolo describe el aislamiento de los capilares del cerebro humano intacto y viable de tejido fresco. En esta sección, discutimos en detalle lo siguiente: 1) modificaciones en el protocolo 2) solución de problemas de errores comunes, 3) limitaciones de la técnica, 4) la importancia del modelo con respecto a los existentes y modelos alternativos barrera blood - brain, y 5). aplicaciones potenciales de los capilares del cerebro humano aislado.
El protocolo descrito aquí está optim...

La barrera blood - brain es una interfaz muy controlada entre la sangre y el cerebro que determina lo que entra y sale del cerebro. Anatómicamente, las células endoteliales componen la barrera hemato - encefálica y forman una red continua, compleja. Fisiológicamente, esta red capilar proporciona el cerebro con oxígeno y nutrientes mientras que al mismo tiempo la eliminación de dióxido de carbono y productos metabólicos de desecho. Lo importante, la evidencia apoya que los cambios en la barrera contribuyen a numerosas patologías, como la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, accidente cerebrovascular1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerebro células endoteliales también sirven como una barrera al tratamiento mediante el bloqueo de la absorción de drogas en el cerebro, por ejemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme tras tumor resección8,9, 10. en este sentido, los capilares del cerebro humano aisladas representan un modelo único ex vivo barrera blood - brain que se asemeja a la barrera propiedades en vivo, que permite el estudio de la función de barrera y disfunción en la salud y la enfermedad. En este artículo, nos proporcionan un protocolo para aislar los capilares cerebrales del cerebro humano con una alta calidad capilar y rendimiento para el estudio de la barrera blood - brain.
En 1969, Siakotos et al. 11 fueron los primeros en informar el aislamiento de los capilares del cerebro bovino y humano de tejido de cerebro usando densidad gradiente centrifugación y vidrio grano columna separación. Más tarde, Goldstein et al. 12 mejorar este método mediante la adición de varios pasos de filtración para disminuir la cantidad de tejido necesario para el estudio de los capilares del cerebro aislados de ratas, manteniendo la actividad metabólica del transporte de glucosa. Desde entonces, los investigadores optimizan el procedimiento de aislamiento capilar numerosas veces, mejorando el método y el cerebro modelo capilar con cada iteración13,14,15. Por ejemplo, Pardridge et al. 16 aislados bovinos capilares mediante digestión enzimática, en lugar de homogeneización mecánica y posteriormente pasa una suspensión capilar a través de un filtro de malla de 210 μm y una columna de bolas de vidrio. Estas modificaciones mejoraron la mancha de exclusión azul de tripano de capilares del cerebro aislado y así, aumentaron la viabilidad de las células endoteliales. En la década de 1990, Dallaire et al. 17 aislados capilares bovinos y ratas que eran claras de contaminación neuronal y mantener la actividad metabólica de la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GTase) y fosfatasa alcalina. En el año 2000, Miller et al. 18, utiliza aislado de rata y los capilares del cerebro porcino en combinación con la microscopía confocal para mostrar la acumulación de sustratos de transporte en el lumen de los capilares. Posteriormente, nuestro laboratorio ha continuado optimizar el procedimiento de aislamiento capilar cerebral y hemos establecido ensayos de transporte para determinar la P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, cáncer de mama resistencia proteína (BCRP)22,23y 2 (Mrp2) de la proteína de resistencia a múltiples drogas actividad de transporte de24 . En 2004, hemos publicado dos informes donde utilizamos los capilares del cerebro aislado de rata para investigar diferentes vías de señalización. En Hartz et al. 21, se encontró que el péptido endotelina-1 rápidamente reversible reduzca la función de transporte de P-gp en capilares del cerebro, actuando a través del receptor de endothelin receptor B (ETB), óxido nítrico sintasa (NOS) y proteína quinasa C (PKC). En Bauer et al. 19, demostramos la expresión del receptor del receptor nuclear pregnano X (PXR) y mostró PXR-modulación de la función de transporte y expresión de P-gp en los capilares del cerebro. En experimentos con ratones transgénicos de PXR humanizados, hemos ampliado esta línea de investigación y mostró en vivo apretando de la barrera por regular P-gp a través de la activación de hPXR25. En 2010, Hartz et al. 26 utiliza este enfoque para restablecer la expresión de la proteína P-gp y transporte actividad en ratones de (hAPP) la proteína precursora del amiloide humanos transgénicos que sobreexpresan hAPP. Además, restauración de P-gp en hAPP ratones redujeron significativamente la amiloide beta (Aβ)40y niveles de Aß42cerebro.
Además de estudiar vías de señalización, los capilares del cerebro aislado pueden utilizarse para determinar los cambios en la permeabilidad capilar que denominamos fuga capilar. En particular, el análisis de fuga de Texas Red se utiliza para evaluar la fuga de colorante fluorescente rojo de Texas desde el lumen capilar con el tiempo y estos datos entonces se utilizan para analizar las tasas de salida. Tasas de fuga capilar aumento en comparación con las de los capilares de control indican cambios en la integridad física de la barrera blood - brain2. Esto es valioso porque hay numerosos Estados de enfermedad asociados con la interrupción de la barrera, por ej., epilepsia, esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y cerebral traumática lesión27,28,29, 30. Otros grupos también han utilizado los capilares aislados para discernir las vías de señalización que regulan la expresión de la proteína y la actividad de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Por último, hemos seguido optimizar este método para el aislamiento de los capilares del cerebro humano y, recientemente, nos mostraron mayor expresión de P-gp en el humana barrera hemato - encefálica en pacientes con epilepsia en comparación con los individuos del control de asimiento-libre38 . Tomados juntos, estos desarrollos demuestran que los capilares del cerebro aislado pueden servir como modelo para estudiar la función de barrera.
Varios en vivo, ex vivoy en vitro barrera blood - brain los modelos se han utilizado en investigación básica y la detección de drogas industriales, principalmente con el objetivo de la prueba de entrega de la droga al cerebro39,40,41 ,42,43,44. Además aisladas ex vivo capilares del cerebro, modelos actuales de la barrera hemato - encefálica incluyen en silico modelos, en vitro cultura de célula de las células endoteliales capilares cerebrales aislados o líneas de células inmortalizadas de varios especie, en vitro cultura de células de madre pluripotenciales humanas (hPSC) que se diferencian en células endoteliales capilares del cerebro y modelos de microfluidos en un chip.
Modelos in silico se utilizan comúnmente en el desarrollo de fármacos de selección de candidatos de la droga basados en predicha de la absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) propiedades. Métodos tales como modelos de relación (QSPR) propiedad de la estructura cuantitativa y cuantitativa estructura-actividad relación (QSAR) son métodos populares utilizados en el cribado de alto rendimiento de las bibliotecas predecir penetración cerebral de fármacos candidatos 45 , 46. estos modelos son útiles para las moléculas de la pantalla de propiedades de penetración de barrera.
Betz et al. 47 estableció monocapas de células endoteliales capilares cerebrales cultivadas como un sistema de modelo en vitro barrera blood - brain. In vitro de la célula cultura modelos tejido fresco o líneas celulares endoteliales inmortalizado como las células endoteliales del microvessel cerebral humano (hCMECs) pueden ser otra herramienta de proyección de alto rendimiento para la penetración del cerebro o estudios mecanísticos. Sin embargo, modelos de cultura de célula endotelial capilar cerebral falta el estrés fisiológico del esquileo del flujo de sangre dentro del lumen capilar están limitados en su complejidad biológica en general y experimentan cambios en la expresión y localización de los componentes importantes de la barrera como las proteínas de Unión estrecha, iones, transportadores, enzimas y receptores de la superficie de canales48,49,50. Por el contrario, monocapas endoteliales derivan de hPSCs, tienen sacarosa baja permeabilidad en comparación con las culturas hCMEC/D3 y contener expresión polarizada de algunos transportadores de la barrera blood - brain, moléculas de adhesión y uniones estrechas51, 52. sin embargo, estas células también están sujetos a cambio de las propiedades en la cultura y el sistema debe ser validado para su recapitulación en vivo barrera propiedades52.
Nuevas tendencias en la investigación de la barrera hemato - encefálica incluyen utilizando sistemas de cultivo de tejidos 3D para crear capilares artificiales, utilizando la tecnología del órgano-on-chip para generar dispositivos microfluídicos, o utilizando la tecnología de fibra hueca53, 54 , 55. los capilares artificiales, sin embargo, tienen significativamente mayores diámetros (100 – 200 μm) que los capilares cerebrales (3 – 7 μm). Por lo tanto, el esquileo las fuerzas en vitro no completamente se asemejan a la situación en vivo . Esto se aborda en los dispositivos microfluídicos "blood-brain-barrier-on-a-chip", donde compartimientos de "sangre" y "cerebro" de forma artificial de las membranas y líquidos son bombeados a través de estos dispositivos microfluídicos fuerzas de esquileo. Del mismo modo, co-cultivos de células endoteliales en varias combinaciones con astrocitos y células musculares lisas vasculares también han sido utilizados con la tecnología de fibra hueca para recrear parámetros reológicos presentes en vivo las condiciones56 , 57 , 58. sin embargo, no está claro cómo este modelo refleja otras propiedades de la barrera hemato - encefálica como transporte, metabolismo, señalización y otros. Estos modelos artificiales capilar y chip son adecuados para la detección de alto rendimiento de drogas, pero las células utilizadas para generar estos modelos también están sujetos a cambio en la cultura.
Rebanadas de cerebro congelado y fijo o cerebro primario, cultivos de células endoteliales capilares son modelos adicionales que pueden utilizarse paraestudiar la microcirculación humana5,59,60,61. Por ejemplo, inmunohistoquímica del tejido de cerebro fija se utiliza para determinar la localización de proteínas y expresión en sana en comparación con el tejido enfermo.
Además de los modelos en vitro y rebanadas de tejido capilares descrita, recientemente aisladas del cerebro pueden ser utilizados para estudiar la función de la barrera blood - brain. Limitaciones de este modelo capilar aislada incluyen la dificultad para obtener tejido cerebral humano fresco, ausencia de astrocitos y neuronas y un proceso relativamente largo de aislamiento. Una ventaja del modelo capilar cerebral aislado es que este modelo se parece a la situación en vivo y, por lo tanto, se puede utilizar para caracterizar la disfunción y la función de barrera. Lo importante, también puede ser utilizado para discernir mecanismos de señalización mediante multitud de ensayos y técnicas moleculares3,19,62,63.
Nuestro laboratorio tiene acceso a ambos tejidos frescos y congelados de cerebro humano a través del centro de Sanders-Brown sobre el envejecimiento (IRB #B15-2602-M)64. En este contexto, las autopsias siguen un protocolo estándar, se obtienen cerebros en < 4 h y todos los procedimientos se ajustan a NIH muestra biológica directrices sobre prácticas idóneas65. Dado este acceso único para el tejido cerebral humano, establecimos y optimizado un protocolo para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano que se traduce en un alto rendimiento de tubos capilares del cerebro humano intacto y viable. Dos extremos comunes de interés son para determinar la expresión de la proteína y la actividad. En este sentido, nosotros y otros hemos establecido varios ensayos que pueden utilizarse para estudiar la expresión de la proteína y niveles de actividad con los capilares del cerebro aislado. Estos ensayos incluyen el Western Blot, Western Simple ensayo, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA), reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), zymography, ensayos de actividad de transporte, y ensayos de fuga capilar. Estos ensayos permiten a los investigadores a estudiar los cambios en la función de barrera en condiciones patológicas humanas, determinar las vías que regulan la actividad y expresión de la proteína e identificar dianas farmacológicas para el tratamiento de la barrera hemato - encefálica asociada enfermedades.
Tomados juntos, recién los capilares del cerebro aislado pueden servir como un modelo robusto y reproducible de la barrera blood - brain. Sobre todo, este modelo puede combinarse con muchos diferentes ensayos para determinar una amplia gama de puntos finales para el estudio de la función barrera.

<table><tbody><tr><td>Equipo de protección personal (EPP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Guantes de látex, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, EE. UU.</td><td>32916-636</td><td>EPI Batas</td></tr><tr><td>de laboratorio protectoras desechables</td><td>VWR, Radnor, PA, EE. UU</td><td>. 470146-214</td><td>EPP; debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de una bata de laboratorio desechable</td></tr><tr><td>Protector facial, desechable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU</td>. <td>19460102</td><td>EPP; Debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de un protector facial desechable</td></tr><tr><td>Materiales de seguridad Bolsas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de autoclave de alta temperatura Clavies 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Papel de banco seco 18" x 20"</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.</td><td>14-206-32</td><td>para cubrir áreas de trabajo</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 75800-272</td><td>para bisturíes usados</td></tr><tr><td>Lejía 8.2% Clorox Germicida 64 oz.</td><td>Centro de suministros del Reino Unido, Lexington, KY, EE. UU</td><td>. 323775</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Refrigerador</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH Accume BASIC AB15</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, EE. UU</td><td>. 501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall LEGEND XTR</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección Leica L2</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, EE. UU.</td><td></td><td>Se utiliza para eliminar las meninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogeneizador</td><td>Kinematica AG, Lucerna, Suiza</td> Escala <td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, EE. UU.</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Mini agitador estándar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 1151050</td><td></td></tr><tr><td>Termo-Frascos de nitrógeno líquido Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, EE. UU</td>. <td>11-670-4C</td><td>utilizado para congelar el tejido?</td></tr><tr><td>Balanza analítica Voyager Pro</td><td>OHAUS, Parsippany, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ZEISS Axiovert</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, EE. UU.</td><td></td><td>se utiliza para comprobar capilares aislados</td></tr><tr><td><herramientas y cristalería > fuerte</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipeta 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 21377823T1</td><td>lavar los capilares filtro</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipeta 100-1.000 &micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. 21377821T1</td><td>pellet de resuspensión en BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, EE. UU.</td><td></td> 739658 <td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos Falcon 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, EE. UU</td><td>. 21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí EISCO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. S95938C</td><td>para picar tejido cerebral</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, EE. UU</td><td>. 52858-000</td><td>para cubrir vaso de precipitados y matraz aforado</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU.</td><td>21-377-304</td><td>para lavar los capilares del filtro</td></tr><tr><td>Jeringa de 60 mL con Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE. UU</td><td>. BD309653</td><td>utiliza con anillo conector para filtrar capilares</td></tr><tr><td>Mango de bisturí #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU.</td><td>10060-13</td><td>utilizado para picar</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU</td><td>. 11251-10</td><td>utilizado para eliminar meninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Amoladora de tejidos</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EE. UU</td>. <td>3431E25</td><td>50 mL volumen, espacio libre: 150-230 &mu; m</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL volumen, holgura: 80-130 &mu; m</td></tr><tr><td>Filtros tejidos Spectra/Mesh (300 &micro; m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA, EE.UU.</td><td>146424</td><td>Se utiliza para filtrar la suspensión capilar para eliminar cualquier meninge que pueda quedar</td></tr><tr><td>en los filtros (tamaño de poro: 30 y micro; m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Anillo conector</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania</td><td>41-50000-03</td><td>reutilización múltiple</td></tr> Termo <tr><td>aforado</td><td></td><td></td> de 1 L <td>para la preparación de tampón de aislamiento</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td> de 1 L <td>para la preparación de barra</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de agitación BSA al 1%para la preparación de 1% BSA y Ficoll&reg; </td></tr><tr><td>Schott Frasco (60 mL)</td><td></td><td></td> <td>para la preparación de Ficoll&reg; </td></tr><tr><td>Cubitera</td><td></td><td></td><td>para mantener todo frío</td></tr><tr>Placa <td></td><td></td> de<td>Petri de 100 mm</td><td>para picar tejido cerebral</td></tr><tr><td>Raspador de células de cultivo de tejidos</td><td>VWR, Radnor, PA, EE. UU</td><td>. 89260-222</td><td>para eliminar el sobrenadante después de la centrifugación</td></tr><tr><td><fuerte>químicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fracción V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>A9647-500g</td><td>preparar en DPBS con Ca2 + & Mg2+ el día anterior. Evite las burbujas durante la preparación. Guárdelo en el refrigerador. Revuelva lentamente durante 10 minutos antes de usar.</td></tr><tr><td>DPBS con Ca2+ & Mg2+</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - parte del tampón de aislamiento</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>La medición exacta es importante aquí. Pesar en botella con barra para revolver. Agite enérgicamente después de agregar DPBS. Conservar en la nevera O/N. Estará despejado por la mañana. Revuelva suavemente durante 10-15 minutos antes de usar. Mantener en hielo hasta su uso.</td></tr><tr><td>Glucosa (D-(+) Dextrosa)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>G7528</td><td>Glucosa (D-(+) Dextrosa) Concentración: 5 mM</td></tr><tr><td>Solución estándar de hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td><td>. 71474</td><td>para ajustar el pH del DPBS</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>P2256</td><td>Concentración: 1 mM</td></tr></tbody></table>

aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Función de barrera blood - brain de comprensión bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es crítica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que tienen la promesa de mejorar la entrega de la droga de cerebro, mejorar la protección del cerebro y tratar el cerebro trastornos. Sin embargo, es difícil estudiar la función humana barrera blood - brain. Así, hay una necesidad crítica de modelos apropiados. En este sentido, los capilares del cerebro aislados de tejido cerebral humano representan una herramienta única para estudiar la función de barrera cerca de la situación humana en vivo como sea posible. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar los tubos capilares del tejido de cerebro humano en un alto rendimiento y con pureza y calidad constante. Los capilares están aislados del tejido de cerebro humano fresco mediante homogeneización mecánica, gradiente de densidad centrifugación y filtración. Después del aislamiento, los capilares del cerebro humano pueden utilizarse para diversas aplicaciones, incluyendo ensayos de fugas, imágenes de células vivas y ensayos inmune para estudiar la expresión de la proteína y función de la actividad enzimática y señalización intracelular. Los capilares del cerebro humano aisladas son un modelo único para aclarar la regulación de la función humana barrera blood - brain. Este modelo puede proporcionar penetraciones en la patogenesia de sistema nervioso central (SNC), que ayudará al desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de trastornos de la CNS.

Los aislamientos de tejido de cerebro humano producen una suspensión enriquecida en capilares del cerebro humano (figura 1B) con pequeñas cantidades de recipientes más grandes, células de sangre rojas, otras células y algunos restos de células. Algunos capilares se ramifican, y, en algunos, las células de sangre rojas son atrapadas en los lúmenes capilares. El capilar típico tiene un diámetro de 3 – 7 μm y es aproximadamente de 100-200 μm largo con lúmenes ab...

Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de la barrera hematoencefálica, como la disfunción de la barrera hematoencefálica, la fuga de la barrera y las vías de señalización específicas de la barrera hematoencefálica humana. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de capilares cerebrales humanos intactos y fisiológicamente activos que se han aislado de tejido cerebral humano fresco. Para comenzar este procedimiento, documente el peso del tejido cerebral humano, que debe ser de unos 10 gramos.Bajo el microscopio, retire cuidadosamente todas las meninges con pinzas y use un bisturí para cortar la materia blanca. A continuación, corta con cuidado el tejido cerebral y pícalo con un bisturí durante unos cinco minutos. Transfiera el tejido cerebral al triturador de pañuelos y agregue 30 mililitros de tampón de aislamiento.Posteriormente, homogeneizar cada muestra con 100 golpes a 50 rpm. No revuelva en el aire para evitar burbujas. Documente el tiempo cada 25 trazos y el tiempo total necesario para 100 golpes.Después, transfiera el homogeneizado a un homogeneizador Dounce en hielo. Homogeneizar la suspensión durante unos 20 golpes y evitar burbujas. A continuación, distribuya el homogeneizado cerebral en partes iguales en cuatro tubos de centrifugación de 50 mililitros.Y documentar el volumen total del homogeneizado. Asegúrese de agregar el volumen correcto de Ficoll. Demasiado poco o demasiado Ficoll dará como resultado una densidad incorrecta para separar los capilares de los desechos celulares y, por lo tanto, reducirá la paleta capilar y limitará el rendimiento.Utilice 10 mililitros de tampón de aislamiento para enjuagar el mortero y el homogeneizador y distribuirlo en los cuatro tubos de centrifugación. A continuación, distribuya 50 mililitros de tampón de gradiente de densidad en los tubos de centrifugación. Cierre herméticamente los tubos de la centrífuga con tapas.A continuación, mezcle el homogeneizado, el medio de gradiente de densidad y el tampón agitando vigorosamente los tubos. Centrifugar a 5.800 veces la gravedad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Posteriormente, desechar el sobrenadante y resuspender cada pellet en dos mililitros de 1%BSA.Después de volver a suspender el pellet, filtre la suspensión a través de la malla de 300 micrómetros. Los capilares se filtran a través de la malla, mientras que los vasos más grandes y los desechos cerebrales más grandes permanecen en la malla. Lave cuidadosamente la malla con hasta 50 mililitros de 1%BSA.A continuación, desecha la malla. Para separar los capilares de los glóbulos rojos y otros desechos cerebrales, distribuya el filtrado capilar en cinco filtros de cepa celular de 30 micrómetros. Los capilares son retenidos por este filtro, mientras que los glóbulos rojos, otras células individuales y pequeños restos cerebrales pasan a través del filtro y se recogen en el filtrado.A continuación, lave cada filtro con 25 mililitros de 1%BSA. Vierta todos los filtrados sobre el sexto filtro para aumentar el rendimiento. Lave cada filtro con 50 mililitros de 1%BSA.Conserve los filtros de deformación celular que contienen los capilares y deseche el filtrado. A continuación, dé la vuelta a los filtros y lave los capilares con 50 mililitros de 1%BSA en tubos de 50 mililitros. Aplique presión suavemente con la punta de la pipeta y muévala a través del filtro para lavar los capilares cerebrales.Asegúrese de lavar todos los capilares cerebrales, especialmente del borde del filtro. Evite las burbujas, ya que esto dificulta el proceso de filtración y aumenta la posibilidad de pérdida capilar. Después de recoger los capilares, centrifugar todas las muestras a 1.500 veces la gravedad durante tres minutos a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en aproximadamente tres mililitros de tampón de aislamiento. A continuación, combine todos los gránulos resuspendidos de una muestra en un tubo cónico de 15 mililitros y llénelo con tampón de aislamiento. Centrifugar de nuevo a 1.500 veces la gravedad durante tres minutos a cuatro grados centígrados y lavar dos veces más.Documente la pureza capilar con un microscopio con un aumento de 100 veces y una cámara. Los capilares cerebrales aislados ahora se pueden usar para experimentos, procesar o congelar rápidamente y almacenar a menos 80 grados Celsius en criotubos durante un mínimo de seis a 12 meses. Esta figura muestra una imagen representativa de luz transmitida de un capilar de cerebro humano con un pericito adjunto y un glóbulo rojo en el lumen.El capilar cerebral humano aislado se inmunotiñó para PGP utilizando C219 como anticuerpo primario y los núcleos se contratiñeron con DAPI. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar la pérdida de capilares durante los pasos de pipeteo y filtración para garantizar un buen rendimiento capilar. Siguiendo este procedimiento, los capilares aislados del cerebro humano se pueden utilizar para una amplia gama de estudios, como estudios farmacológicos y fisiológicos, así como estudios genómicos, proteómicos y celómicos.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la barrera hematoencefálica estudiaran la función de barrera en los capilares del cerebro humano lo más cerca posible de la situación in vivo humana. No olvide que trabajar con tejido cerebral humano presenta el riesgo de infección por patógenos transmitidos por la sangre. Se deben tomar precauciones de seguridad, como usar una bata de laboratorio, protector facial y guantes, así como manipular muestras de tejido en un entorno BSL-2 mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video presenta el aislamiento de microvasos del cerebro de una rata utilizando una combinación de centrifugación en gradiente de densidad y mehods de digestión enzimática. Los microvasos aislados se pueden cultivar en un matraz de cultivo prerrecubierto con matriz de colágeno y fibronectina para obtener colonias de células endoteliales.

Cultivo de células endoteliales a partir de microvasos cerebrales de rata: un procedimiento para aislar y cultivar células endoteliales a partir de microvasos de cerebro de rata

En este video, demostramos el procedimiento para aislar y cultivar pericitos de capilares cerebrales bovinos sin contaminación de células endoteliales.

Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales primarios: un procedimiento para aislar y cultivar pericitos de capilares cerebrales bovinos sin contaminación de células endoteliales

Este video presenta el aislamiento de capilares cerebrales de un tejido cerebral humano fresco. Los capilares aislados se pueden utilizar para generar un modelo de barrera hematoencefálica ex vivo.

Aislamiento de capilares cerebrales del cerebro humano: un método optimizado para extraer capilares cerebrales del tejido cerebral humano

Este video muestra el aislamiento de vasos intactos del cerebro de un ratón que constituyen la barrera hematoencefálica (BBB) junto con las neuronas y las células gliales. Los vasos aislados se pueden utilizar como modelo in vitro para estudiar su papel en el mantenimiento de la homeostasis cerebral.

Aislamiento de vasos cerebrales de ratón: un protocolo para aislar vasos intactos de una muestra de cerebro murino

Este video muestra el aislamiento de capilares de cerebros porcinos frescos. El proceso consiste en eliminar las meninges, aislar la materia gris del tejido cerebral, homogeneizar y filtrar la materia gris para aislar los capilares y, finalmente, utilizar la digestión enzimática para purificar aún más los capilares.

Purificación de capilares de un cerebro porcino

Este video muestra el proceso de aislar microvasos cerebrales de ratas sacrificadas. Incluye la disección del cerebro, la limpieza del tejido y la digestión mecánica, seguida de una centrifugación repetida para aislar la fracción pura de los microvasos.

Un método para el aislamiento de unidades neurovasculares a partir de cerebro de rata

Describimos un protocolo que permite la purificación del compartimento vascular del cerebro del ratón. Los vasos cerebrales aislados incluyen células endoteliales unidas por uniones estrechas y rodeadas por una lámina basal continua, pericitos, células musculares lisas vasculares, así como membranas astrogliales perivasculares.

La purificación de los buques de cerebro de ratón

Este manuscrito describe un protocolo simple y reproducible para el aislamiento de arteriolas intracerebrales (un grupo de vasos sanguíneos que abarcan arteriolas parenquimatosas, arteriolas penetrantes y arteriolas precapilares) de ratones, para ser utilizado en miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.

El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas

Presentamos un protocolo para la extracción de pericitas cerebrales murinas. Basado en una extracción de pericita orientada al enriquecimiento libre de antibióticos, este protocolo es una herramienta valiosa para estudios in vitro que proporcionan alta pureza y alto rendimiento, disminuyendo así el número de animales experimentales utilizados.

Un método de alta salida para aislar los pericytes cerebrales del ratón

El presente manuscrito detalla cómo aislar las arterias y capilares del hipocampo del cerebro del ratón y cómo presurizarlas para miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.

Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional

Los pericitos capilares cerebrales son actores esenciales en la regulación de las propiedades de la barrera hematoencefálica y el flujo sanguíneo. Este protocolo describe cómo los pericitos capilares cerebrales pueden ser aislados, cultivados, caracterizados con respecto al tipo de célula y aplicados para investigaciones de señalización de calcio intracelular con sondas fluorescentes.

Cultivo de pericitos capilares cerebrales para mediciones de calcio citosólico y estudios de imágenes de calcio

Aprenda a aislar capilares cerebrales de tejido humano fresco mediante centrifugación en gradiente de densidad. Este método permite estudiar la barrera hematoencefálica intacta y sus vías de señalización en condiciones fisiológicas.

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

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