Una plataforma de microfluidos para la proyección de imagen Longitudinal en Caenorhabditis elegans

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes longitudinales de los procesos dinámicos en nematodos adultos en condiciones ambientales controladas para el seguimiento de las respuestas conductuales de los gusanos y la cinética de la expresión génica de los gusanos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los animales se adaptan a los cambios en su entorno, incluidas las diferencias en los comportamientos básicos, la expresión génica, la memoria y el aprendizaje. Esta técnica permite la observación longitudinal múltiple de animales individuales en entornos controlados dinámicamente, así como el muestreo simultáneo de múltiples aspectos de adaptación a alta resolución.

La implicación de esta técnica se extiende hacia una comprensión cuantitativa de la adaptación animal, ya que la adquisición de datos cinéticos de alta precisión puede facilitar el modelado matemático y la formulación y prueba de hipótesis complejas. Para configurar el dispositivo para el procedimiento, primero conecte la punta de la jeringa de salida a un trozo de tubo de jeringa de 50 centímetros. Para hacer una aguja adaptadora, use alicates para tirar del eje de la aguja del cubo de la aguja de una aguja de calibre 20 por media pulgada y use un mechero Bunsen para eliminar los residuos de plástico restantes.

Sujetando ambos extremos de la aguja con unos alicates, doble la aguja adaptadora de acuerdo con la geometría de la configuración experimental y conecte la aguja hasta la mitad en el otro extremo del tubo de la jeringa de salida. A continuación, conecte una punta de jeringa de entrada de tampón directamente a una válvula de tres vías y conecte una jeringa de entrada de tampón a una pieza de tubo de jeringa de un metro. Insertando la aguja adaptadora hasta la mitad en el extremo abierto del tubo, conecte la jeringa de intercambio de tampón a un trozo de tubo de jeringa de 50 centímetros a través de la punta de la jeringa.

Conecte el tubo de la jeringa al puerto restante de la válvula de tres vías y cierre la válvula. Con una aguja adaptadora, conecte la jeringa de entrada de gusano a una pieza de un metro de tubo de jeringa como se acaba de demostrar. A continuación, enjuague todos los materiales dos veces con medio S y llene las jeringas y los tubos enjuagados con medio S fresco, teniendo cuidado de eliminar las burbujas de aire.

Ahora, conecte el tubo de la jeringa de salida a la salida del dispositivo y conecte la aguja adaptadora en el extremo del tubo de la jeringa de salida al puerto de salida. Inyecte un pequeño volumen de medio S a través de la salida para llenar el dispositivo hasta que el medio S salga de las entradas del tampón y del tornillo sin fin. Conecte el tubo de la jeringa de entrada del tampón al puerto de entrada del tampón del dispositivo y tape la entrada del tornillo sin fin con un pasador de acero inoxidable con un diámetro de treinta segundos de una pulgada.

Monte el dispositivo microfluídico en un microscopio de fluorescencia invertida con una platina motorizada y pegue una bomba de jeringa a un agitador cerca del microscopio para que la bomba no se mueva mientras se agita. A continuación, cargue la jeringa de entrada del tampón en la bomba de jeringa y configure la bomba para que suministre un caudal continuo de medio S en el dispositivo a un caudal de tres microlitros por minuto. Para cargar las bacterias en el dispositivo microfluídico, primero cargue una jeringa nueva con una suspensión de alta densidad de E. coli OP50.

Gire la jeringa verticalmente y golpee el cilindro varias veces para recoger todas las burbujas de aire en la parte superior de la jeringa. Apague el agitador orbital y cierre la válvula de tres vías de las jeringas de entrada del tampón. Reemplace la jeringa de entrada del tampón con la jeringa cargada de bacterias y expulse todo el aire recolectado en la parte superior de la jeringa hasta que un poco de la suspensión bacteriana ingrese al sistema de intercambio de tampón y no queden burbujas en la jeringa cargada con OP50 o en la válvula.

Con la válvula cerrada, conecte la jeringa cargada de bacterias a la bomba de jeringa y encienda el agitador orbital. Ajuste la velocidad de agitación a aproximadamente 200 RPM y el caudal a 100 microlitros por minuto. Una vez que el tampón OP50 se haya extendido por todo el dispositivo, vuelva a ajustar el caudal a tres microlitros por minuto.

Para cargar el dispositivo con nematodos, primero llene un tubo de microcentrífuga de baja unión de 650 microlitros con 100 microlitros de suspensión OP50 fresca y use un pico de lombriz para transferir individualmente de 20 a 30 gusanos adultos jóvenes sincronizados con la edad desde una placa de agar de medio de crecimiento de nematodos al tubo. Llene la jeringa de entrada de tornillo sin fin y el tubo de la jeringa con suspensión OP50 nueva e inyecte aproximadamente 500 microlitros de suspensión en el tubo de microcentrífuga. Luego, extraiga la suspensión de gusano en el tubo de la jeringa de entrada del gusano y conecte la jeringa de entrada del gusano a la entrada del gusano.

Inyecte todos los gusanos a través del tubo de la jeringa de entrada del tornillo sin fin en el dispositivo microfluídico y desconecte la jeringa de entrada del tornillo sin fin y el tubo de la jeringa. Tape la entrada del tornillo sin fin con un pasador y desconecte la jeringa de entrada del tampón de la bomba mecánica. Utilice la jeringa de entrada del tampón para mover manualmente los gusanos a los canales, y la jeringa de salida para revertir el movimiento del gusano según sea necesario.

Cargar los animales requiere cierta coordinación. Use empujones suaves en los émbolos de la jeringa para alinearlos a lo largo del canal y un empuje un poco más fuerte para empujar el gusano hasta el fondo. Luego, deje que los gusanos se adapten a su nuevo entorno durante dos o tres horas antes de comenzar un experimento.

Los gusanos están confinados en sus canales, pero no están inmovilizados. La mayoría de los gusanos permanecerán en sus canales durante el experimento, pero algunos pueden escapar o enredarse en las microfisuras. Aquí, se pueden observar imágenes de campo claro de un solo gusano representativo en el transcurso de diez horas en el dispositivo.

Utilizando gusanos transgénicos que expresan GFP bajo el promotor del gen de respuesta inmunitaria uno, tras la infección por P. Aeruginosa, PA14, la expresión de GFP se observa en la parte media del cuerpo y la cola del gusano durante las primeras cinco horas de exposición al patógeno, aumentando a una expresión robusta de todo el cuerpo durante las siguientes cinco horas. El trazado de la fluorescencia total de cada gusano en función del tiempo posterior a la infección ilustra la dinámica de la inducción del gen de la respuesta inmunitaria, así como la variabilidad de gusano a gusano en el momento y el alcance de la inducción. Las imágenes de lapso de tiempo de los huevos puestos por los gusanos en cada canal permiten trazar el número acumulado de huevos puestos por cada gusano en función del tiempo posterior a la infección y capturan la variabilidad de animal a animal, así como la disminución inducida por el patógeno en la puesta de huevos a medida que avanza la infección.

Una vez dominado, el dispositivo microfluídico se puede preparar y cargar en una hora. Una vez que el dispositivo está cargado y los gusanos se aclimatan, se pueden administrar a los gusanos otros reactivos, como medicamentos específicos o señales químicas de interés, para responder preguntas adicionales sobre el control de los sistemas neuronal y genético de los nematodos. Después de su desarrollo, nosotros y nuestros colaboradores utilizamos esta técnica para diseccionar los comportamientos de alimentación de los nematodos, así como las respuestas genéticas de los gusanos a la infección por choque térmico y la inanición en una variedad de entornos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar un dispositivo microfluídico para realizar ensayos longitudinales.