Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias
21 de marzo de 2018
Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.
El objetivo general de esta metodología es analizar el comportamiento de navegación de la larva de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética simultánea de sus neuronas olfativas. Este método permite la disección completa de la función del circuito olfativo y complementa los estudios sobre cómo la función del circuito olfativo se traduce en la respuesta conductual. La principal ventaja de esta técnica es su especificidad y control temporal mediante el uso de una luz en lugar de los gradientes de olor tradicionales para activar las neuronas olfativas individuales.
Para comenzar el experimento, construya un campo de comportamiento con privación de luz. Construye una caja de 89 por 61 por 66 centímetros, hecha de láminas acrílicas de plexiglás de color negro, de tres milímetros de grosor. Coloque la caja sobre una mesa en la sala de comportamiento.
A continuación, monta una cámara CCD USB 3.0 monocromática equipada con un filtro IR Longpass de 830 nanómetros y una lente de montura F1.4 C de ocho milímetros en el centro del techo de la caja negra. Coloque dos tiras de LED infrarrojos sobre la mesa para iluminar las larvas en la arena oscura. Luego, obtenga una placa de aluminio cuadrada de 22 centímetros por 22 centímetros para construir la plataforma LED.
En el centro de la placa, use un cortador de metal para cortar un agujero que sea lo suficientemente grande como para caber alrededor de la cámara CCD. Cubra la placa de metal con tiras de luces LED rojas. Suelde los cables de la tira de luz LED en serie y alimente los cables de la tira a un relé optoacoplador controlado por un microprocesador Raspberry Pi 2B.
A continuación, monte la plataforma LED alrededor de la cámara CCD. A continuación, instale y configure un sistema operativo basado en Linux Ubuntu MATE Raspbian Jessie en el procesador Raspberry Pi antes de conectar el relé optoacoplador a las tiras de LED. Conecte una fuente de alimentación para alimentar las tiras de LED y el optoacoplador.
Asegúrese de que haya una irradiancia homogénea en varios puntos alrededor de la cámara CCD en el ámbito del comportamiento. Asegure la irradiancia absoluta en la superficie de la arena con la ayuda de un espectrómetro y determine que es de aproximadamente 1,3 vatios por metro cuadrado en toda la superficie de la arena. Mantenga las moscas en el alimento estándar para moscas a 25 grados Celsius, 50 a 60% de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y 12 horas.
Para expresar CsChrimson en un solo par de ORNs, cruce las hembras vírgenes de una línea UAS-IVS-CsChrimson con machos de una línea ORX-GAL4. Después de que se haya permitido que las moscas macho y hembra en un cruce se apareen y pongan huevos durante 48 horas, transfiera los adultos a un vial nuevo. En la superficie del vial alimenticio que contiene huevos, agregue 400 microlitros de una mezcla que contenga 400 micromolares todo-trans-retinal, o ATR, disueltos en dimetilsulfóxido, o DMSO, en 89 milimolares de sacarosa disuelta en agua destilada.
Una vez que se agrega ATR a los viales de alimentos que contienen huevos, incube los viales en la oscuridad durante 72 horas adicionales. Después de la incubación, extraiga las larvas del tercer estadio de la superficie del alimento para moscas haciéndolas flotar con una solución de sacarosa al 15% de alta densidad. Con una micropipeta P1000, separe las larvas que flotan en la superficie de la solución de sacarosa en un vaso de precipitados de vidrio de 1.000 mililitros.
Lave las larvas cuatro veces intercambiando 800 mililitros de agua fresca destilada en el vaso de precipitados de vidrio cada vez. Después del lavado final, deje que las larvas descansen durante 10 minutos antes de someterlas al ensayo de comportamiento. Para el ensayo de comportamiento, mantenga una temperatura y humedad constantes en la sala de comportamiento.
Prepare el medio rastrero para larvas vertiendo 150 mililitros de agarosa derretida al 1,5% en una placa de Petri cuadrada de 22 centímetros por 22 centímetros. Deje que la agarosa se solidifique y se enfríe durante una o dos horas en las placas de Petri antes de usarlas en el ensayo de comportamiento. Después de que la agarosa se haya solidificado, transfiera no más de 20 de las larvas del tercer estadio preparadas al centro de la placa de Petri y cubra la placa de Petri con su tapa.
Coloque la placa de Petri en la arena de comportamiento debajo de la cámara CCD. Encienda la fuente de luz LED infrarroja de 850 nanómetros para visualizar las larvas en el video. Encienda la cámara CCD para registrar el movimiento de las larvas.
Por último, pase al procesamiento y análisis de datos. Cuando la luz estimuló ORN 7a que expresaba CsChrimson, hubo una disminución significativa en la longitud de la carrera en comparación con los animales de control. Por el contrario, cuando la luz estimuló la expresión de ORN 42a que expresaba CsChrimson, hubo un aumento significativo en la longitud de la carrera en comparación con los animales de control.
Descubrimos que para ORN 42a, diferentes patrones temporales de estimulación lumínica provocaron diferentes respuestas conductuales. Si bien hemos demostrado este método para las neuronas receptoras olfativas de primer orden, nuestro método también permite una variedad de aplicaciones futuras, como la medición del impacto de las neuronas aguas abajo, como las neuronas de proyección y las neuronas locales, en el comportamiento de las larvas. Esperamos que esta técnica allane el camino para una disección completa de la función del circuito olfativo de las larvas.
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Descripción general
Este protocolo analiza el comportamiento de navegación de la larva de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética simultánea de sus neuronas olfativas. Emplea una luz de longitud de onda de 630 nm para activar neuronas olfativas específicas que expresan una rrodopsina del canal desplazada hacia el rojo, lo que permite estudios detallados de la función del circuito olfativo y la respuesta conductual.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia Conductual
- Optogenética
- Genética de Drosophila
Antecedentes
- Esta metodología permite explorar cómo la función del circuito olfativo se correlaciona con las respuestas comportamentales.
- Ofrece control temporal sobre la activación mediante luz en lugar de gradientes tradicionales de olores.
- El enfoque facilita el examen de neuronas específicas en el sistema olfativo de Drosophila.
Objetivo del estudio
- Para diseccionar con precisión la función de los circuitos olfativos.
- Para observar las respuestas conductuales de larvas a la estimulación neuronal dirigida.
- Para obtener información sobre cómo las neuronas olfativas individuales influyen en las decisiones de navegación.
Métodos Utilizados
- El estudio utiliza una arena de comportamiento diseñada personalizada para el análisis del movimiento larval.
- Se estimularon con luz larvas de Drosophila que expresaban CsChrimson en neuronas receptoras olfativas (ORNs).
- El ensayo conductual implica la preparación de un medio de arrastre de agarosa y la grabación en video de los movimientos larvales.
- Los pasos importantes incluyen la construcción de la arena, la instalación del equipo y la preparación de larvas bajo condiciones específicas.
Resultados principales
- La estimulación luminosa de neuronas receptoras olfativas específicas provocó variaciones significativas en la longitud del desplazamiento larval, lo que indica respuestas conductuales distintas.
- Diferentes patrones temporales de estimulación indujeron efectos diversos sobre el comportamiento de navegación.
- Este método está preparado para facilitar la futura exploración de los impactos neuronales descendentes sobre el comportamiento larval.
Conclusiones
- El estudio ejemplifica un enfoque novedoso para analizar los circuitos olfativos y sus implicaciones conductuales.
- Permite a los investigadores estudiar los roles específicos de neuronas diana en un contexto de organismo vivo.
- Estos hallazgos mejoran nuestra comprensión de los mecanismos neuronales en el procesamiento sensorial y la conducta.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la disección precisa de la función del circuito olfativo mediante el reemplazo de estímulos odorantes por control optogenético, abordando un desafío clave en la validación de objetivos, donde las respuestas conductuales deben vincularse a actividad neuronal específica. Facilita la desaceleración mecanicista en las primeras etapas del descubrimiento al aislar la contribución de neuronas individuales receptoras del olfato al comportamiento de navegación, mejorando la confianza predictiva en la selección de objetivos. El enfoque mejora la continuidad traslacional desde el objetivo molecular hasta el fenotipo a nivel de circuito, lo que resulta relevante para reducir riesgos en objetivos dentro de programas de descubrimiento centrados en neurociencia.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la activación específica de neuronas olfativas con resultados conductuales definidos.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para la validación funcional de dianas neuronales mediante estimulación basada en luz.
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la manipulación aislada de ORN individuales para aclarar su papel en el comportamiento de navegación de las larvas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas conductuales cuantitativas (por ejemplo, cambios en la longitud de carrera) que permiten la evaluación estandarizada de los efectos de modulación neuronal.
- Valor operativo: Establece una plataforma de ensayo escalable para cribar moduladores genéticos o farmacológicos de la función del circuito olfativo.
- Valor científico: Facilita la estandarización del ensayo al eliminar la volatilidad de los odorantes y la variabilidad en la entrega mediante estimulación optogenética.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades al permitir la disección de la traducción de lo sensorial al comportamiento en un organismo genéticamente tratable.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo compatible con estudios preclínicos para evaluar los efectos de dianas neuronales sobre el comportamiento antes de la validación en mamíferos.
- Valor científico: Permite la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar cómo la actividad neuronal ascendente se traduce en fenotipos conductuales descendentes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la validación del blanco mediante la caracterización fenotípica del comportamiento e informando la identificación de compuestos prometedores al aclarar los blancos neuronales que generan respuestas medibles.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis sobre la función individual de neuronas olfativas en el comportamiento de navegación de larvas.
- Selección: Proporciona métricas conductuales cuantitativas y reproducibles (longitud de desplazamiento) adecuadas para la evaluación de compuestos o moduladores genéticos.
- Análisis: Ofrece resultados conductuales rastreables y comparaciones estadísticas entre condiciones estimuladas y de control.
- Investigación Traducional: Relaciona la actividad de circuitos neuronales con respuestas conductuales, facilitando la extrapolación a modelos de orden superior.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la interrogación sistemática de dianas neuronales en circuitos olfativos y otros circuitos sensoriales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad en la vinculación de la activación neuronal con resultados conductuales.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante el control optogenético que sustituye a los estímulos olfativos variables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de ir/no ir al proporcionar vínculos mecanicistas más claros entre objetivos y fenotipos conductuales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en el impacto conductual validado en un sistema relevante para el descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de Drosophila, optogenética y diseño de ensayos conductuales.
- Depende de instrumentación especializada que incluye una arena de comportamiento, iluminación infrarroja, cámara CCD y control de estimulación basado en Raspberry Pi.
- Necesita estandarización entre equipos para la preparación de larvas, preparación del medio de agarosa y protocolos de seguimiento mediante video.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a diferentes tipos neuronales (por ejemplo, neuronas de proyección, neuronas locales) o etapas del desarrollo.
- Está limitado por la necesidad de acceso genético y alimentación retiniana en el sistema modelo, lo cual puede restringir la escalabilidad a sistemas no-Drosophila.
