Name: Construcción de Thioether/sulfuro de vinilo-atado Hydrothiolation de péptidos helicoidales mediante foto-inducida tiol-eno/Ino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprende a construir péptidos helicoidales con uniones de tioéter/sulfuro de vinilo mediante hidrotiolación fotoinducida tiol-eno/tiol-ino. Este protocolo simplifica la síntesis de péptidos cíclicos estables con alta tolerancia a grupos funcionales.

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Los autores reconocen el apoyo financiero de la Fundación de subvenciones de China de Ciencias naturales (no. 21372023, 21778009 y 81701818); el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China (Nº 2015DFA31590); el Shenzhen Ciencia y tecnología Comité de innovación (no. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 y GJHS20170310093122365); y la Fundación de ciencia Postdoctoral de China (no. 2017 M 610704).

1. preparación de equipo
<ol><li>Para el aparato de síntesis de péptidos manual, coloque un colector de vacío (Tabla de materiales) en una eficiente campana extractora. A continuación, colocar llaves de tres vías sobre el colector de vacío y conectar a una tubería de gas nitrógeno o argón. Todas las entradas no utilizadas mediante tabiques de goma de la tapa.</li>
	<li>Conectar columnas llenas de resina (0,8 x 4 cm, depósito de 10 mL, ver Tabla de materiales) al colector utilizando las llaves de tres vías (figura 1). Utilice una bomba conectada a un sistema de vacío como filtración de vacío o un bulbo de la pipeta de goma por extrusión para eliminar el solvente en las columnas.</li>
	<li>Uso un photoreactor (figura 2), equipado con diez 350 nm (Tabla de materiales) para la radiación ultravioleta. Conectar a un tanque de gas de argón a través de la entrada de aire de photoreactor para asegurar que el photoreactor se llena de gas argón antes y durante las photoreactions.</li>
	<li>Antes de encender la lámpara Ultravioleta de la photoreactor, asegúrese de que se cierre la puerta de photoreactor en caso de irradiación de la luz UV.</li>
</ol>2. preparación de la resina
Nota: en general, la construcción de sustratos de péptido se realiza mediante protocolos de síntesis de péptidos de fase sólida basado en Fmoc. Estas se llevan a cabo utilizando la resina amida de pista que deja un escote de c-terminal amida restante siguiente péptido. Este protocolo se utiliza en todo el documento.
PRECAUCIÓN: N, N- dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), 4-methylmorpholine (NMM) y N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) son tóxicos y nocivos por inhalación, ingestión o contacto con la piel. Éter etílico es altamente inflamable. Ácido trifluoroacético (TFA) es corrosivo. 1, 2-Etanoditiol (EDT) es altamente maloliente. Por lo tanto, todos los disolventes orgánicos y productos químicos deben manejarse con equipo de protección personal (guantes de nitrilo, bata y gafas protectoras) y manejados dentro de una campana de humos químicos.
<ol><li>Calcular la cantidad de resina necesaria utilizando la siguiente fórmula: escala (mmol) / (capacidad de carga (mmol/g) 1.000 (mg/g) de la resina) = masa de la resina (mg) E.g., la cantidad de pista amida MBHA resina (0,5 mmol/g) de 25 μmol = 0,025 mmol / (0,5 mmol/g 1000 mg/g) = 50 mg. A continuación, pesar 50 mg de resina en una columna y establecer en el colector de vacío con llaves de paso de tres vías.</li>
	<li>Añadir a la resina en una columna (0,8 x 4 cm, depósito de 10 mL) 1-2 mL de DCM. Para engrosar la resina, frote suavemente con una corriente de nitrógeno o argón durante 10 minutos. A continuación, eliminar el disolvente utilizando filtración de vacío.</li>
</ol>3 lavado y desprotección de Fmoc N-terminal
<ol><li>Preparar el Fmoc N-terminal deprotecting solución: preparar un volumen adecuado (200 mL) de 50% (v/v) morfolina en DMF en un frasco de vidrio.</li>
	<li>Añadir 1-2 mL de la solución de la desprotección a la resina, frote suavemente durante 10 minutos y luego vaciar la solución usando un vacío. Utilizando DMF (1-2 mL) y DCM (1-2 mL) en ese orden, lave la resina y el recipiente de la reacción durante un total de 3 x. A continuación, repita los procedimientos de desprotección y lavado 1 x.</li>
</ol>4. protección de Fmoc Aminoácidos acoplamiento
<ol><li>Usando el acoplamiento de residuos de alanina como por ejemplo, en el caso de una síntesis del manual de 25 μmol-escala, pesan Fmoc-Ala-OH (5 equiv, 41,4 mg) hexafluorofosfato de 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (HCTU; 4,9 equiv, 50,5 mg) en un contenedor de polipropileno y se disuelve en DMF (0,5 mL).</li>
	<li>Añadir DIPEA (10 equivalente, de 43.5 μl) con el fin de generar un 0.25-M activa solución de aminoácidos (tabla 1). Después de una activación previa de aproximadamente 1 minuto, añadir la solución a la resina, y luego la burbuja con N2 de aproximadamente 1-2 h.</li>
	<li>De este paso, incorporar cada aminoácido en la cadena peptídica como una secuencia de pasos: primero la desprotección del Fmoc-Grupo N-terminal y luego el lavado, seguido por el acoplamiento de los aminoácidos vía activación utilizando HCTU. Nota: Un acoplamiento tiempo (e.g., 2 h) se recomienda si de acoplamiento después de un residuo de aminoácido sterically obstaculizado [e.g., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, OH (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - Fmoc-su]. El alkene/alquino con aminoácidos no naturales se utilizan de 3 equivalentes en vez de 5 y se dejó reaccionar por 3 h.</li>
	<li>Supervisar el progreso de la síntesis de péptidos mediante pruebas Kaiser o Cloranilo descrito por Arora et al. 36 estas pruebas proporcionan evaluaciones cualitativas de la presencia o ausencia de aminas primarias y secundarias gratis. Alternativamente, aproximadamente 2-3 mg del péptido puede ser hendida de la resina y analizado por LC-MS.</li>
</ol>5. tiol-ene Hydrothiolation y ciclización de tiol-Ino
<ol><li>Construir el thioether vinculador mediante ciclización en la resina (figura 3).<ol>
<li>Preparar aproximadamente 50 mL de la solución de desprotección de Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Tratar la Cys y mS5-resina del cojinete [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-resina, 50 mg] con 1-2 mL de la solución de desprotección de Trt en una columna de 10 mL. Frote suavemente la solución por 10 minutos usando N2. Finalmente, la colada con DCM (1-2 mL) para un total de 3 x. Nota: MS5 representa el bloque de edificio de alquileno-cojinete (véase la estructura representada en la figura 6) utilizado por péptido ciclización de acoplamiento y thio-ene38.</li>
		<li>Repita el procedimiento descrito anteriormente para un total de aproximadamente 6 x para quitar el grupo de protección del trityl de cisteína, hasta que el color de la solución ya no es amarillo.</li>
		<li>Burbujas de N2, lave el R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-resina [cisteína con el tio gratis (-SH)] con DMF (1-2 mL) y DCM (1-2 mL) en ese orden. Encogimiento de la resina usando metanol (1-2 mL) por 2 min y luego quitar el disolvente mediante filtración. A continuación, seque secuencialmente la resina en un vapor de gas de2 N durante aproximadamente 5 minutos en la columna.</li>
		<li>Preparar DMF desgasificada previamente, dentro de un matraz de boca, burbujas de nitrógeno durante aproximadamente 1 hora a través de una aguja larga que se extiende en el solvente.</li>
		<li>Transferencia de la resina en un matraz de fondo redondo de 10 mL a través de papel de peso. Suspender la resina en 2 mL de la DMF desgasificada, seguido por la adición del fotoiniciador 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP; 1 equiv, 5,6 mg), 4-methoxyacetophenone (mapa; 1 equiv, 3,8 mg).</li>
		<li>Añadir un stir bar (0,3 cm) en el matraz, el matraz con un tapón de goma conveniente del casquillo y desplazar el aire en el frasco con gas de nitrógeno utilizando una bomba de aceite. Nota: La atmósfera inerte no es estrictamente necesaria para la fotoreducción de thio-ene efectivo en una fase sólida. Sin embargo, es muy necesario la fotoreducción de thio-Ino en fase de solución en la figura 5. De lo contrario, sulfuro se oxida durante la irradiación UV.</li>
		<li>El matraz de reacción en la photoreactor y remover la resina para 1 h bajo irradiación UV a temperatura ambiente (figura 2). PRECAUCIÓN: Antes de encender la lámpara Ultravioleta de photoreactor, asegúrese de que se cierre la puerta de photoreactor en caso de irradiación dañina de la luz UV. Nota: Con frecuencia de muestreo la mezcla de reacción durante los photoreactions recomienda para nuevas secuencias, como el precursor del péptido lineal tiene el idéntico peso molecular del producto. En general, péptidos lineales y cíclicos muestran significativamente diferente hidrofilia. Esto puede distinguirse fácilmente usando HPLC. Por otra parte, el 5, 5' - Ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) reactivo también podría ser utilizado para estudiar la presencia de tiol libre37.</li>
		<li>Transferencia de la resina del frasco en la columna y eliminar el disolvente utilizando filtración de vacío. Lave y seque la resina, tal como se describe en el paso 5.1.3.</li>
		<li>Preparar aproximadamente 10 mL del escote cocktail (TFA/consejos/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) en la campana.</li>
		<li>Transferencia de la resina en un recipiente de polipropileno de 2 mL, añadir 1 mL de escote cocktail (TFA/consejos/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) en el contenedor y cierre el recipiente herméticamente con un tapón de rosca. A continuación, frote suavemente el recipiente en un agitador orbital a una velocidad de 60 rpm en la campana de 1.5-2 h. PRECAUCIÓN: TFA es altamente corrosivo. Use ropa protectora y trabajo en una eficiente campana extractora. EDT es una sustancia muy maloliente y debe manejarse en una campana de humos eficaz.</li>
		<li>Retire el cóctel TFA por evaporación bajo una corriente de gas N2 en la campana. Precipitar a continuación, el residuo usando éter dietílico frío (1 mL) por 30 s y aislamiento que mediante centrifugación a 12.000 x g durante 2 minutos. Después de la centrifugación, suavemente Vierta el componente de éter. Repita los pasos de precipitado y centrifugación para x 2. Evaporar el residuo a sequedad.</li>
		<li>Finalmente, disolver el residuo en 1 mL de H2O/acetonitrilo (2:1) y purificar por HPLC usando una columna analítica de C18 (4.6 x 250 mm, caudal de 1,0 mL/min). Uso H2O (que contiene 0.1% TFA) y acetonitrilo puro como disolventes en un degradado lineal de 2%/min de 20% a 70% acetonitrilo en 25 min espectros de Monitor HPLC con UV 280 nm y 220 nm las longitudes de onda (tabla 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Para construir al thioether vinculador por reacción intermolecular thio-ene y luego cyclize el péptido macrolactamization (figura 4).<ol>
<li>Sintetizar el residuo de alquileno teniendo el péptido lineal H2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'-resina (50 mg) con la síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc estándar (SPPS) como se describe en los pasos 2-4. A continuación, lavar y secar la resina como se describe en el paso 5.1.3.</li>
		<li>Suspender la resina en un matraz de fondo redondo de 10 mL que contiene 2 mL de DMF desgasificada como se describe en el paso 5.1.4.</li>
		<li>Añadir el fotoiniciador mapa y MMP (MMP: 1 equiv, 5,6 mg; MAPA: 1 equiv, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 equiv, 25,7 mg) y un revolver bar (0,3 cm) en el matraz. Tapa el matraz con un tapón adecuado y luego usar la bomba de aceite para reemplazar el aire en el frasco con nitrógeno.</li>
		<li>Coloque el matraz de reacción en el photoreactor. Agitar durante 1-2 h bajo irradiación UV a temperatura ambiente (figura 2).</li>
		<li>Controlar la reacción en un análisis por LC-MS: cleave 2-3 mg de la resina con el cóctel de escote. Entonces precipitar el residuo con éter dietílico frío (300 μL), aislar el residuo por centrifugación y evaporar el residuo a sequedad como se describe en el paso 5.1.11. Después de esto, disolver el residuo en 100 μl de H2O/acetonitrilo (2:1). Filtrar la solución de péptido utilizando una película microporosa de 0.22 μm y analizarlos utilizando LC-MS con el compuesto ionizado en la ionización de electrospray (ESI) y operado en modo positivo.</li>
		<li>Si es necesario, repita los pasos 5.2.2 - 5.2.4 para asegurar la reacción se lleva a cabo hasta su conclusión.</li>
		<li>Después de la finalización de la reacción de la foto, transferencia de la resina del frasco en la columna y eliminar el disolvente utilizando filtración de vacío. Lave y seque la resina, tal como se describe en el paso 5.1.3.</li>
		<li>Añadir la solución DMF de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBob; 2,4 equiv, 31,2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (TOHB; 2,4 equiv, 8,1 mg) y NMM (4 equiv, 11 μL) a la resina en la columna de la macrolactamization. La burbuja de esta solución con N2 h 2.<ol>
<li>Además, controlar esta reacción de acoplamiento utilizando LC-MS, como se describe en el paso 5.2.3. Si es necesario, repita este paso para asegurar la reacción se lleva a cabo hasta su conclusión.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alargar el péptido mediante SPPS Fmoc-base estándar como se describe en los pasos 3 y 4.</li>
		<li>Asamblea de todos los residuos del aminoácido, hienden el péptido de la resina como se describe en los pasos 5.1.10 y 5.1.11 y purifica como se describe en el paso 5.1.12.</li>
	</ol></li>
	<li>Construcción de vinculador de vinilo sulfuro en fase de solución (figura 5).<ol>
<li>Sintetizar el residuo de alquino cojinete lineal péptido mediante SPPS Fmoc-base estándar como se describe en los pasos 2-4. Sintetizar el alquino con aminoácidos según un protocolo bien establecido como se describe en un estudio anterior de20.</li>
		<li>Hender el péptido de la resina y precipitan con éter dietílico frío como se describe en pasos 5.1.9 - 5.1.11. Después de la hendidura y la precipitación de la resina, recoger el péptido mediante centrifugación a 12.000 x g durante 2 minutos.</li>
		<li>Secar el residuo resultante en el vacío. Disolver el residuo en el DMF desgasificada (50 mL) en un matraz de fondo redondo de 100 mL para alcanzar una concentración final de 0,5 mM (basado en la carga de la resina, 0,025 mmol (1000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 mL).<ol>
<li>Añadir el fotoiniciador DMPA (0,5 equiv, 3,2 mg) y luego desgasificar la solución de reacción durante 10 minutos usando N2 a través de una aguja larga que se extendía en la solución. A continuación, irradiar la muestra bajo UV luz a temperatura ambiente durante 0.5 - 1 h sin agitación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Retire la DMF en un alto vacío y precipitar el crudo residuo mediante la adición de éter dietílico para disolver sus subproductos orgánicos. A continuación, aislar el residuo mediante centrifugación a 12.000 x g durante 2 minutos. Después de la centrifugación, suavemente Vierta el componente de éter. Evaporar el residuo a sequedad. Finalmente, disolver el residuo en 1 mL de H2O/acetonitrilo (2:1) y purificarlo mediante HPLC como se describe en el paso 5.1.7.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la ciclización de la resina en intramolecular thio-ene descrita en la figura 3, la eliminación del grupo trityl de un residuo de cisteína fue encontrada para ser un paso crítico para la fotoreducción posterior. Además, el peso molecular de péptidos antes y tras que la reacción fue encontrada para ser idéntico como representan en la Figura 6B. Por lo tanto, el uso de una identificación de HPLC o un ensayo DTNB es necesaria para el seguimiento de la reacción. E...

El desarrollo de ligandos para modular las interacciones proteína-proteína (IBP) proporciona un enfoque atractivo para el descubrimiento de medicamentos modernos. Así, se ha invertido mucho esfuerzo en estudiar modalidades química novedosas que eficientemente podrían modular los IBP1,2,3. Protones generalmente consisten en superficies de interacción superficiales, grandes o descontinuadas, y pequeñas moléculas típicamente se consideran ligandos inadecuados para la modulación de los IBP4,5. Con una conveniente expuesta interacción superficie, péptidos cortos que mímico las características estructurales de las interfaces de proteínas representan los candidatos ideales para abordar este problema6,7. Sin embargo, los péptidos cortos son típicamente no estructurados en una solución acuosa. Esto es debido a que las moléculas de agua que compiten con la red de enlace de hidrógeno intramolecular del esqueleto peptídico y conformaciones bien definidas son entropically desfavorables en agua8. Además, los péptidos inherentemente baja estabilidad y propiedades de permeabilidad de la célula en gran medida limitan su uso en aplicaciones biológicas9,10. Según el análisis del Banco de datos (PDB) de proteínas, > 50% de los IBP implican interacciones de α-hélice corta11. Así, se han desarrollado diferentes métodos químicos con respecto a la estabilización de la hélice. Éstos incluyen disulfuro/thioether enlace formación12,13,14, ring-closing metathesis15, anillo de lactama formación16, "haga clic en" química17, además de perfluoroarenes18,19y de la formación de sulfuro de vinilo20.
Estabilizado los péptidos helicoidales se utilizan ampliamente para diversos objetivos intracelulares, como p53, estrógeno receptores, Ras, BCL-2 familia las proteínas y otros21,22,23,24. ALRN-6924, un hidrocarburo de todo grapado inhibidor dual de péptido de MDM2 y MDMX, está siendo usado para investigación clínica25. En los últimos años, nuestro grupo se ha centrado en el desarrollo de métodos de estabilización de novedoso péptido con tiol-ene y tiol-Ino reacciones26,27,28. En general, hemos demostrado que estas reacciones iniciadas por foto son eficientes condiciones suaves cuando naturalmente se utiliza abundante cisteína. Además, hemos demostrado que estas reacciones tienen una tolerancia excelente grupo funcional, son bio-orthogonal y ha demostrado para ser aplicable para péptidos y proteínas modificaciones29. Los péptidos resultantes de sulfuro atado thioether vinilo en gran medida mejoran el espacio químico de péptidos de restricción, ofrecen un centro de modificación en tether lábil y ha demostrado para ser aplicable para su uso en numerosas aplicaciones biológicas30 ,31,32. Hasta la fecha, se han descrito solamente limitados informes sobre la ciclación de péptidos tiol-ene/tiol-Ino. En un estudio publicado por Anseth et al. , en 2009, una reacción en resina intramolecular tiol-ene para la ciclación de péptidos entre alquenos activados con cisteína fue demostrado33. En el año 2015, Chou et al. se describe una reacción de dos componentes iniciado radical tiol-ene para péptido grapado34 y una reacción de acoplamiento de eno-Ino/tiol posterior, secuencial35. Recientemente, hemos descrito una serie de trabajos basados en vinilo thioether sulfuro atado péptidos20,26,27. Este protocolo describe una detallada síntesis de los péptidos de sulfuro atado de vinilo thioether mencionados en la esperanza de que sea útil para la comunidad de investigación.

<table><tbody><tr><td>Resina MBHA de Rink Amide (0,53 mmol/g)</td><td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos estándar protegidos con Fmoc</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-metil-2-pirrolidinona</td><td>Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.</td><td>3230</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetil formamida dañina para la</td> piel <td>Energía</td><td>B020051</td><td>la piel</td></tr><tr><td>dañina Diclorometano</td><td>Energía</td><td>W330229</td><td>la piel dañina</td></tr><tr><td>N,N-Diisoproiletilamina</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>irritante</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>J& K</td><td>101398</td><td>corrosivo</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>J& K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>J& K</td><td>248897</td><td>hedor</td></tr><tr><td>2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio hexafluorofosfato&nbsp;</td><td>GL Biochem (Shanghái) Ltd.</td><td></td><td></td>851012</tr><tr><td>Morfolina</td><td>Aldrich</td><td></td><td>M109062 irritante</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>inflamable</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicidad Metanol</td></tr><tr><td></td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicidad</td></tr><tr><td>2-hidroxi-1-[4-(2-hidroxietoxi)-fenil]-2-metil-1-propanona</td><td>Energía</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-metoxiacetofenona</td><td>Energía</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona</td><td>Energía</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5'-Dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico)</td><td>J& K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonato de hexafluorofosfato</td><td>Energía</td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-hidroxibenzotriazol</td><td>Energía</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-metilmorfolina</td><td>Energía</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>cromatografía líquida de alta resolución</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>Masa de ionización por electrospray</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de concentración SpeedVac</td><td>Colector</td> de vacío Thermo <td>Savant</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>llaves de paso de tres vías</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>columnas de cromatografía de poli-preparación&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

construcción de thioether/sulfuro de vinilo-atado hydrothiolation de péptidos helicoidales mediante foto-inducida tiol-eno/ino

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de péptidos thioether atado con hydrothiolation en resina intramolecular/intermoleculares tiol-ene. Además, este protocolo describe la preparación de péptidos vinilo-sulfuro-atado con hydrothiolation en solución tiol-Ino intramolecular entre residuos de cisteína y producto que poseen cadenas laterales de alkene/alquino en i, i + 4 posiciones. Péptidos lineales fueron sintetizados usando una síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc estándar (SPPS). Tiol-ene hydrothiolation se lleva a cabo mediante una reacción intramolecular de thio-ene o una reacción intermolecular thio-ene, dependiendo de la longitud del péptido. En esta investigación se lleva a cabo una reacción intramolecular de thio-ene en el caso de péptidos más cortos utilizando en resina de desprotección de los grupos del trityl de después de la completa síntesis del péptido lineal de residuos de cisteína. La resina entonces se fija a la irradiación UV con fotoiniciador 4-methoxyacetophenone (mapa) y 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). La reacción intermolecular tiol-ene se lleva a cabo por Fmoc-Cys-OH se disuelve en un solvente de N, N- dimetilformamida (DMF). Esto es entonces reaccionó con el péptido utilizando el residuo de alkene-rodamiento en la resina. Después de eso, la macrolactamization se lleva a cabo utilizando hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (TOHB) y 4-Methylmorpholine (NMM) como reactivos de activación en la resina. Después de la macrolactamization, se continúa la síntesis de péptidos mediante SPPS estándar. En el caso de la hydrothiolation de thio-Ino, el péptido lineal es hendido de la resina, secado y posteriormente se disuelve en DMF desgasificada. Esto entonces se irradia con luz UV de fotoiniciador 2,2-dimetoxi-2-Fenilacetofenona (DMPA). Después de la reacción, DMF se evapora y el residuo crudo se precipita y purificado utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Estos métodos podrían funcionar para simplificar la generación de péptidos cíclicos thioether atado debido al uso de la química click thio-eno/Ino que posee grupo funcional superior tolerancia y buen rendimiento. La introducción de bonos thioether péptidos aprovecha la naturaleza nucleofílica de residuos de cisteína y es redox inertes con respecto a enlaces de disulfuro.

Los espectros de HPLC y MS del péptido Ac-y más5AAAC-NH2 y su producto ciclizados CA - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 que se generaron con la fotoreducción en resina intramolecular tiol-ene se representan en figura 6B. péptido cíclico fue encontrado para tener un peso molecular idéntico con respecto a su precursor lineal. Sin embargo, su tiempo de retención HPLC se observó que aproximadamente 2 minutos antes que el d...

Presentamos un protocolo para la construcción de vinilo thioether sulfuro atado helicoidales péptidos mediante foto-inducida tiol-ene/tiol-Ino hydrothiolation.

Construcción de Thioether/sulfuro de vinilo-atado Hydrothiolation de péptidos helicoidales mediante foto-inducida tiol-eno/Ino

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Estos métodos simplifican la generación de péptidos cíclicos anclados al tioéter debido al uso de la química de clic de tio-eno o tio-yne que posee una tolerancia de grupo funcional superior y un buen rendimiento. La principal ventaja de esta técnica es que una correa de tioéter proporciona un sitio de modificación sin trazas, que expande significativamente el espacio químico de los péptidos estables después de la modificación de la síntesis de péptidos. Para comenzar el procedimiento, conecte una columna llena de 50 miligramos de resina Rink Amide MBHA a un colector de vacío de sobremesa y a una línea de gas nitrógeno o argón a través de una llave de paso de tres vías.Agregue uno o dos mililitros de diclorometano al lecho de resina e hinche la resina agitando suavemente la mezcla con un chorro de burbujas de gas inerte durante 10 minutos. Drene la resina con una pera de pipeta de goma cuando termine. A continuación, añada uno o dos mililitros de solución de desprotección Fmoc N-terminal a la resina.Agite suavemente la mezcla burbujeando con gas inerte durante 10 minutos y luego escurra la resina con una pera de pipeta de goma. Lave la columna con uno o dos mililitros de DMF de la misma manera, seguido de uno o dos mililitros de DCM. Repita la secuencia de desprotección una vez.A continuación, combine 0,125 milimoles de un aminoácido protegido por Fmoc y 50,5 miligramos de HCTU con 0,5 mililitros de DMF en un recipiente de polipropileno. Agita la mezcla durante un minuto para disolver los sólidos. A continuación, añade 43,5 microlitros de DIPEA, y agita el envase durante un minuto más para obtener una solución de aminoácidos activados de 0,25 molares.Agregue esta solución a la resina lavada y burbujee gas inerte a través de la mezcla durante una o dos horas. Después de eso, desproteja y lave el residuo de aminoácidos ligado. Continúe acoplando aminoácidos a la cadena peptídica de esta manera para formar el péptido lineal.Utilice la síntesis de péptidos en fase sólida para preparar resina que soporte un péptido lineal que incluya un residuo de cisteína protegido con tritilo separado por tres unidades de un residuo mono-S-cinco. Agregue de uno a dos mililitros de solución de desprotección de tritilo a 50 miligramos de la resina que contiene péptidos. Burbujea gas nitrógeno a través de la mezcla durante 10 minutos.Drene la solución de desprotección y lave la resina con porciones de uno a dos mililitros de DCM tres veces. Repita el procedimiento de desprotección seis veces o hasta que la solución ya no tenga un aspecto amarillo para desproteger completamente la cisteína. La desprotección completa del grupo Trt de la cisteína es muy importante para el siguiente paso de la fotorreacción.Lava la resina con porciones de uno a dos mililitros de DMF y DCM en secuencia. Luego, remoja la resina en uno o dos mililitros de metanol durante dos minutos para encoger la resina. Escurre el metanol y seca la resina con gas nitrógeno durante cinco minutos.Transfiera la resina seca a un matraz de fondo redondo de 10 mililitros a través de papel de pesaje. Suspende la resina en dos mililitros de DMF rociado con nitrógeno. A continuación, agregue 5,6 miligramos de MMP y 38 miligramos de MAP como fotoiniciadores.Coloque una barra de agitación en el matraz y cubra el matraz con un tabique de goma. Purgue la atmósfera del matraz con gas nitrógeno tres veces, para un tiempo total de purga de unos cinco minutos. Fije el matraz de reacción en un fotorreactor equipado con lámparas UVA, una entrada de gas nitrógeno inerte y una placa de agitación.Comience a remover la mezcla y cierre el fotorrereactor. Purgar el fotorreactor con argón durante 10 minutos. Luego, ajuste el caudal de argón a un litro por minuto e irradie la mezcla con luz UVA durante una hora a temperatura ambiente.Monitoriza la reacción con HPLC. Lavar, escindir y purificar el péptido cíclico cuando termine. Prepara 50 miligramos de resina con un péptido lineal que incluye un residuo mono-S-cinco sustituido por rayos gamma.Lavar la resina con DMF y DCM en secuencia. Encoge la resina con metanol y sécala con gas nitrógeno. Luego, en un matraz de fondo redondo de 10 mililitros, suspenda la resina en dos mililitros de DMF rociado con nitrógeno.Agregue a la mezcla 5.6 miligramos de MMP, 3.8 miligramos de MAP y 25.7 miligramos de cisteína protegida con Fmoc. Agregue una barra agitadora al matraz, séllelo con un tabique de goma y purgue la atmósfera del matraz con gas nitrógeno. A continuación, irradie la mezcla con luz UVA en un fotorreactor inerte lleno de gas nitrógeno mientras se agita a temperatura ambiente durante una o dos horas.Monitorice la reacción con LC-MS. Cuando se complete la fotorreacción, lave el péptido unido y realice la reacción de macrolactamización. A continuación, reanude el acoplamiento de los aminoácidos al péptido cíclico para formar la estructura deseada.Corta y purifica el péptido cuando termines. Prepare 50 miligramos de resina con un péptido lineal que incluye un residuo con un alquino terminal separado por tres unidades de un residuo con un tiol terminal. Escinde el péptido de la resina y precipita con un mililitro de éter dietílico frío.Centrifugar la mezcla de péptidos a 12.000 veces g durante dos minutos. Decanta suavemente el sobrenadante y añade otro mililitro de éter dietílico frío. Repita el lavado dos veces más y luego seque el residuo de péptido al vacío.Disuelva el residuo en 50 mililitros de DMF rociado con nitrógeno en un matraz de fondo redondo. Agregue 3,2 miligramos de DMPA a la solución peptídica y burbujee nitrógeno a través de la mezcla de reacción durante 10 minutos. Se requiere estrictamente una atmósfera inerte para una fotorreacción eficaz de tio-yne en una fase de solución.De lo contrario, observamos oxidación del azufre durante la irradiación UV. A continuación, irradie la mezcla con luz UVA sin agitar en un fotorreactor inerte lleno de gas nitrógeno a temperatura ambiente durante 30 minutos a una hora. Aísle y purifique el péptido cíclico cuando termine.La ciclación en resina de este péptido produjo un péptido cíclico unido a tioéter con un peso molecular idéntico al péptido lineal. El tiempo de retención de HPLC del producto cíclico fue dos minutos más corto que el del péptido lineal. También se observó una buena conversión para la ciclación en resina de varios otros péptidos cortos.Los péptidos lineales se examinaron para determinar su capacidad de someterse a un grapado de péptidos mediante hidrotiolación de tiol-ino fotoinducida. El bajo rendimiento de dos c se atribuyó a una preferencia conformacional por atrapar el radical tiilo en el extremo N-terminal durante la contracción a un macrociclo de 20 miembros. Los péptidos uno a y uno b generaron dos isómeros con un enlace cruzado de sulfuro de vinilo de ocho miembros.Los péptidos del producto, dos a-A y dos a-b, tuvieron tiempos de retención distintos y se produjeron en diferentes proporciones en diferentes tiempos de irradiación. La espectroscopia de RMN de protones indicó que dos a-A eran el isómero E del sulfuro de vinilo y dos a-B eran el isómero Z. El isómero Z fue el producto principal al formar los péptidos dos d, dos e y dos f, lo que se atribuyó a la preferencia conformacional durante la formación del reticulado de sulfuro de vinilo de siete miembros.La espectroscopia de dicroísmo circular mostró una bobina aleatoria para todas las formas de péptidos dos a y dos b y una conformación helicoidal para el péptido dos d. Desarrollamos una serie de protocolos químicos para la construcción de péptidos anclados con tioéter y sulfuro de vinilo mediante el uso de la química de tio-eno y tio-ino clic fotoinducida. Creemos que será útil para la comunidad investigadora.

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Investigación

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Chemistry

Química

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