Construcción de Thioether/sulfuro de vinilo-atado Hydrothiolation de péptidos helicoidales mediante foto-inducida tiol-eno/Ino

Estos métodos simplifican la generación de péptidos cíclicos anclados al tioéter debido al uso de la química de clic de tio-eno o tio-yne que posee una tolerancia de grupo funcional superior y un buen rendimiento. La principal ventaja de esta técnica es que una correa de tioéter proporciona un sitio de modificación sin trazas, que expande significativamente el espacio químico de los péptidos estables después de la modificación de la síntesis de péptidos. Para comenzar el procedimiento, conecte una columna llena de 50 miligramos de resina Rink Amide MBHA a un colector de vacío de sobremesa y a una línea de gas nitrógeno o argón a través de una llave de paso de tres vías.

Agregue uno o dos mililitros de diclorometano al lecho de resina e hinche la resina agitando suavemente la mezcla con un chorro de burbujas de gas inerte durante 10 minutos. Drene la resina con una pera de pipeta de goma cuando termine. A continuación, añada uno o dos mililitros de solución de desprotección Fmoc N-terminal a la resina.

Agite suavemente la mezcla burbujeando con gas inerte durante 10 minutos y luego escurra la resina con una pera de pipeta de goma. Lave la columna con uno o dos mililitros de DMF de la misma manera, seguido de uno o dos mililitros de DCM. Repita la secuencia de desprotección una vez.

A continuación, combine 0,125 milimoles de un aminoácido protegido por Fmoc y 50,5 miligramos de HCTU con 0,5 mililitros de DMF en un recipiente de polipropileno. Agita la mezcla durante un minuto para disolver los sólidos. A continuación, añade 43,5 microlitros de DIPEA, y agita el envase durante un minuto más para obtener una solución de aminoácidos activados de 0,25 molares.

Agregue esta solución a la resina lavada y burbujee gas inerte a través de la mezcla durante una o dos horas. Después de eso, desproteja y lave el residuo de aminoácidos ligado. Continúe acoplando aminoácidos a la cadena peptídica de esta manera para formar el péptido lineal.

Utilice la síntesis de péptidos en fase sólida para preparar resina que soporte un péptido lineal que incluya un residuo de cisteína protegido con tritilo separado por tres unidades de un residuo mono-S-cinco. Agregue de uno a dos mililitros de solución de desprotección de tritilo a 50 miligramos de la resina que contiene péptidos. Burbujea gas nitrógeno a través de la mezcla durante 10 minutos.

Drene la solución de desprotección y lave la resina con porciones de uno a dos mililitros de DCM tres veces. Repita el procedimiento de desprotección seis veces o hasta que la solución ya no tenga un aspecto amarillo para desproteger completamente la cisteína. La desprotección completa del grupo Trt de la cisteína es muy importante para el siguiente paso de la fotorreacción.

Lava la resina con porciones de uno a dos mililitros de DMF y DCM en secuencia. Luego, remoja la resina en uno o dos mililitros de metanol durante dos minutos para encoger la resina. Escurre el metanol y seca la resina con gas nitrógeno durante cinco minutos.

Transfiera la resina seca a un matraz de fondo redondo de 10 mililitros a través de papel de pesaje. Suspende la resina en dos mililitros de DMF rociado con nitrógeno. A continuación, agregue 5,6 miligramos de MMP y 38 miligramos de MAP como fotoiniciadores.

Coloque una barra de agitación en el matraz y cubra el matraz con un tabique de goma. Purgue la atmósfera del matraz con gas nitrógeno tres veces, para un tiempo total de purga de unos cinco minutos. Fije el matraz de reacción en un fotorreactor equipado con lámparas UVA, una entrada de gas nitrógeno inerte y una placa de agitación.

Comience a remover la mezcla y cierre el fotorrereactor. Purgar el fotorreactor con argón durante 10 minutos. Luego, ajuste el caudal de argón a un litro por minuto e irradie la mezcla con luz UVA durante una hora a temperatura ambiente.

Monitoriza la reacción con HPLC. Lavar, escindir y purificar el péptido cíclico cuando termine. Prepara 50 miligramos de resina con un péptido lineal que incluye un residuo mono-S-cinco sustituido por rayos gamma.

Lavar la resina con DMF y DCM en secuencia. Encoge la resina con metanol y sécala con gas nitrógeno. Luego, en un matraz de fondo redondo de 10 mililitros, suspenda la resina en dos mililitros de DMF rociado con nitrógeno.

Agregue a la mezcla 5.6 miligramos de MMP, 3.8 miligramos de MAP y 25.7 miligramos de cisteína protegida con Fmoc. Agregue una barra agitadora al matraz, séllelo con un tabique de goma y purgue la atmósfera del matraz con gas nitrógeno. A continuación, irradie la mezcla con luz UVA en un fotorreactor inerte lleno de gas nitrógeno mientras se agita a temperatura ambiente durante una o dos horas.

Monitorice la reacción con LC-MS. Cuando se complete la fotorreacción, lave el péptido unido y realice la reacción de macrolactamización. A continuación, reanude el acoplamiento de los aminoácidos al péptido cíclico para formar la estructura deseada.

Corta y purifica el péptido cuando termines. Prepare 50 miligramos de resina con un péptido lineal que incluye un residuo con un alquino terminal separado por tres unidades de un residuo con un tiol terminal. Escinde el péptido de la resina y precipita con un mililitro de éter dietílico frío.

Centrifugar la mezcla de péptidos a 12.000 veces g durante dos minutos. Decanta suavemente el sobrenadante y añade otro mililitro de éter dietílico frío. Repita el lavado dos veces más y luego seque el residuo de péptido al vacío.

Disuelva el residuo en 50 mililitros de DMF rociado con nitrógeno en un matraz de fondo redondo. Agregue 3,2 miligramos de DMPA a la solución peptídica y burbujee nitrógeno a través de la mezcla de reacción durante 10 minutos. Se requiere estrictamente una atmósfera inerte para una fotorreacción eficaz de tio-yne en una fase de solución.

De lo contrario, observamos oxidación del azufre durante la irradiación UV. A continuación, irradie la mezcla con luz UVA sin agitar en un fotorreactor inerte lleno de gas nitrógeno a temperatura ambiente durante 30 minutos a una hora. Aísle y purifique el péptido cíclico cuando termine.

La ciclación en resina de este péptido produjo un péptido cíclico unido a tioéter con un peso molecular idéntico al péptido lineal. El tiempo de retención de HPLC del producto cíclico fue dos minutos más corto que el del péptido lineal. También se observó una buena conversión para la ciclación en resina de varios otros péptidos cortos.

Los péptidos lineales se examinaron para determinar su capacidad de someterse a un grapado de péptidos mediante hidrotiolación de tiol-ino fotoinducida. El bajo rendimiento de dos c se atribuyó a una preferencia conformacional por atrapar el radical tiilo en el extremo N-terminal durante la contracción a un macrociclo de 20 miembros. Los péptidos uno a y uno b generaron dos isómeros con un enlace cruzado de sulfuro de vinilo de ocho miembros.

Los péptidos del producto, dos a-A y dos a-b, tuvieron tiempos de retención distintos y se produjeron en diferentes proporciones en diferentes tiempos de irradiación. La espectroscopia de RMN de protones indicó que dos a-A eran el isómero E del sulfuro de vinilo y dos a-B eran el isómero Z. El isómero Z fue el producto principal al formar los péptidos dos d, dos e y dos f, lo que se atribuyó a la preferencia conformacional durante la formación del reticulado de sulfuro de vinilo de siete miembros.

La espectroscopia de dicroísmo circular mostró una bobina aleatoria para todas las formas de péptidos dos a y dos b y una conformación helicoidal para el péptido dos d. Desarrollamos una serie de protocolos químicos para la construcción de péptidos anclados con tioéter y sulfuro de vinilo mediante el uso de la química de tio-eno y tio-ino clic fotoinducida. Creemos que será útil para la comunidad investigadora.