Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Este método puede permitir a los investigadores adquirir un número suficiente de tipos de células para responder a preguntas clave en el campo de la inmunología del desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que se basa en unos pocos marcadores seleccionados para aislar un gran número de células que tradicionalmente se encuentran en números bajos ex vivo. La implicación de esta técnica se extiende hacia el trasplante terapéutico de médula ósea, ya que permite el aislamiento de un gran número de progenitores.

Para comenzar el protocolo, sature las patas traseras y el torso de un ratón previamente preparado con etanol al 75% y haga cortes poco profundos a través de la piel alrededor de la articulación de la cadera con tijeras de tejido curvas. Luego, retira y quita las patas traseras. Con pinzas, tire firmemente de la piel desde la cadera hacia el tobillo, revelando el músculo, y use unas tijeras para quitar el colgajo de piel.

Corta justo por encima del fémur y la articulación de la cadera, y retira toda la pata trasera cortando el hueso. Trabajando en un gabinete de bioseguridad estéril, transfiera las patas a una de las placas de Petri preparadas previamente. Use unas tijeras para cortar justo debajo del tobillo y retire con cuidado la mayor cantidad posible de músculo y tejido conectivo elástico.

Transfiera el hueso limpio a la segunda placa de Petri preparada. A continuación, separe el fémur, la rodilla y la tibia. Con pinzas, sostenga la pierna a la altura de la rodilla y ubique la médula, una línea roja tenue dentro de la cavidad ósea en la parte superior del fémur y hacia el final de la tibia.

Con unas tijeras, corta la tibia justo por encima de donde parece terminar la médula. Corte justo debajo de la articulación de la rodilla, corte justo por encima de la articulación de la rodilla. A continuación, enjuague la médula ósea del fémur y la tibia.

Llene una jeringa de 10 mililitros con medios completos del tubo cónico de 50 mililitros y tape la jeringa con una aguja de calibre 23. Sosteniendo el hueso con pinzas por encima de la tercera placa de Petri preparada, inserte la aguja en el canal óseo y empuje el medio a través de él, expulsando las células. Repita este paso hasta que no se pueda ver más color a través del hueso.

Continúe el procedimiento triturando la epífisis. Mientras aún está en la segunda placa de Petri, sostenga la rótula firmemente con pinzas y aplaste las rodillas con la punta de la jeringa. Continúe hasta que las epífisis ya no estén rojas.

Con la jeringa, transfiera las células de la segunda y tercera placas de Petri al tubo de 50 mililitros. Rompe los grumos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y trata de evitar la formación de burbujas. Centrifuga las células.

A continuación, retire el sobrenadante con la pipeta serológica, desaloje el pellet agitando y lise los glóbulos rojos incubándolos en un mililitro de cloruro de amonio potásico o tampón de lisis ACK, durante un minuto a temperatura ambiente. Con una pipeta serológica, agregue 40 mililitros de tampón HBSS. Con una pipeta serológica, filtre las células a través de un filtro de células de 70 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue las células.

Con una pipeta serológica, extraiga el sobrenadante y cultive las células de la médula ósea en medios completos con 10 nanogramos por mililitro de GM-CSF de ratón recombinante a una densidad de una vez 10 a la sexta célula por mililitro. Con una pipeta serológica, transfiera las células a placas de cultivo de tejidos e incube a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%, hasta que estén listas para proceder a la tinción. Suavemente, pero minuciosamente, pipetea las células hacia arriba y hacia abajo para desalojar las células poco adheridas.

Con una pipeta serológica, transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue las células. Vierta suavemente el sobrenadante y lave las células peletizadas añadiendo 30 mililitros de tampón de lavado FACS, o SFWB, con la pipeta serológica. A continuación, centrifugar las células y repetir el lavado.

A continuación, suspenda y tiña las células según las instrucciones del fabricante del anticuerpo. Vuelva a suspender cinco veces 10 a la séptima célula en un mililitro de FWB, y agregue dos microgramos de anti Ly-6C y anti CD115, marcados con fluoróforos. Para distinguir aún más CMP de MODC, agregue dos microgramos de anticuerpos anti CD11C.

Incubar las muestras durante 30 minutos en hielo. Después de la incubación, use una pipeta serológica para agregar 10 mililitros de FWB y centrifugue las células. Vierta suavemente el sobrenadante y lave las células granuladas agregando 30 mililitros de FWB con una pipeta serológica.

Centrifuga las células y repite el lavado. Antes de suspender las células, agite el tubo a fondo para desalojar el pellet. Utilice una pipeta serológica para resuspender las células de una vez 10 a la séptima célula por mililitro de FWB y filtrarlas a través de un filtro de células de 35 micrómetros.

Utilice una pipeta serológica para transferir las células filtradas a un tubo de polipropileno y coloque el tubo en hielo hasta que estén listas para ser clasificadas. Pase el control sin manchar a través del clasificador de celdas y aplique una compuerta para excluir pequeños desechos y partículas altamente granulares. Pase las muestras de control fluorescentes individuales a través del clasificador de células y ajuste la compensación según sea necesario.

Ejecute una muestra de la muestra multietiquetada y observe cuatro poblaciones distintas. Aplique una puerta para aislar cada una de las cuatro poblaciones principales. Prepare los tubos de recolección agregando suficiente suero fetal de ternero, o FCS, para lograr al menos el 20% de concentración final cuando esté lleno.

Por ejemplo, si usa tubos de cinco mililitros, agregue un mililitro de FCS antes de clasificar y retire el tubo cuando alcance un volumen total de cinco mililitros. Para evitar el recambio de la membrana y la absorción de anticuerpos, mantenga todas las muestras a cuatro grados centígrados en todo el rango. Una vez que se haya recolectado el número deseado de células, use una pipeta serológica para transferir las células a un nuevo tubo cónico y centrifugar las células.

Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de FWB, y centrifugue las células nuevamente. Repita la suspensión FWB durante un total de dos lavados. Finalmente, retire el sobrenadante después del segundo lavado y proceda según el diseño del experimento.

Para mantener el mayor número posible de canales disponibles para el análisis, se seleccionaron células viables de forma rutinaria, en función de la dispersión directa y lateral, excluyendo eventos muy pequeños y muy granulares. Para determinar si esta estrategia de activación excluía de manera confiable las células muertas, las muestras se tiñeron con 7-aminoactinomicina D. Las células analizadas inmediatamente después de la cosecha tenían aproximadamente el 10% de las células 7-AAD positivas, cuando se aplicó una puerta típica de FSC, SSC a las células recién aisladas de la médula ósea. Una proporción similar de células muertas también estuvo presente en la estancia 1 y en la estancia 3 del cultivo.

Para el día cinco, el número de células muertas dentro de la puerta se redujo al 5%, por lo tanto, el uso de una puerta de viabilidad de este tipo es generalmente apropiado para clasificar el día cinco y después. La citometría de flujo reveló que dentro de la población CD115 negativa para Ly6C, las células CD3, CD45R positivas persistieron con fuerza desde el día cero hasta el día tres. Al cuarto día, solo quedaban unas pocas células CD3, CD45R positivas, y para el quinto y sexto día, no había células que expresaran CD3, CD45R presentes; por lo tanto, dentro de los cuatro días de cultivo en GM-CSF, las células positivas para el linaje estaban esencialmente ausentes y no se detectaron en absoluto a los días cinco y seis de cultivo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la composición celular depende de la duración del cultivo. La clasificación tres días después de la cosecha produce un alto número de etapas tempranas y pocas etapas tardías, y viceversa para los cultivos clasificados después de cinco días.