Name: Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende a fabricar un andamio de polímero conductor para cultivar células madre con estimulación eléctrica in vitro e implantación in vivo mínimamente invasiva. Este método optimiza el comportamiento celular para investigación en recuperación post-ictus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Dr. Kati Andreasson (Departamento de Neurología y ciencias neurológicas, Universidad de Stanford) para el uso de la máquina de qRT-PCR. El trabajo fue financiado por institutos nacionales de salud subvenciones K08NS098876 (a P.M.G.) y Beca Postdoctoral del Decano de la Facultad de medicina de Stanford (en B.O.).

Todas las células y procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de supervisión de investigación de la célula de vástago de Stanford y por el Panel administrativo de la Universidad de Stanford en laboratorio Animal Care (SCRO-616 y APLAC-31909).
1. de la aguafuerte del vidrio de ITO
<ol><li>Preparar el óxido de estaño indio (ITO)-portaobjeto cubierto mediante la colocación de un agente de enmascaramiento sobre el lado del conductor del vidrio. Nota: Cintas transparentes más comerciales pueden utilizarse como un agente de enmascaramiento.<ol>
<li>Quitar la máscara exceso usando una hoja, dejando solamente la forma deseada del diseño ITO final cubierto en el cristal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezcle 5% (v/v) de ácido nítrico y 45% (v/v) de HCl en un matraz de vidrio dentro de una campana de humos para preparar la solución de la aguafuerte.<ol>
<li>Utilizar una placa y un termómetro para asegurar que la temperatura de la solución de la aguafuerte se mantiene a 70 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que la solución de la aguafuerte alcanza los 70 ° C, coloque el portaobjetos de vidrio de ITO enmascarado en la solución por 2 minutos eliminar la capa de ITO exceso. Nota: Masking Tape protege la capa de ITO de la exposición a la solución de ácido.</li>
	<li>Quitar la corredera de la solución y enjuague con desionizada (DI) H2O.</li>
	<li>Retire con cuidado la máscara y medida resistencia con un multímetro para asegurarse de que el ITO restante está intacta. Lecturas de la zona grabada deseada deben ser aproximadamente 0 Ω.</li>
</ol>2. preparación de solución de pirrol
<ol><li>En una botella de vidrio de 1000 mL, disolver 70 g de dodecylbenzenesulfonate del sodio (NaDBS) en 600 mL de DI H2O.</li>
	<li>Una vez que el NaDBS es disuelto, añadir 14 mL de 0,2 M pirrol y 386 mL de DI H2O a la solución.</li>
	<li>Cubrir la solución con papel de aluminio y almacenar a 4 ° C.</li>
</ol>3. electrochapado de Polypyrrole en vidrio de ITO
<ol><li>Caliente la solución de pirrol a temperatura ambiente hasta que NaDBS es completamente se redisuelve. Nota: Esto toma unos 15 a 20 minutos.</li>
	<li>Vierte 25 mL de la solución de pirrol en un vaso de precipitados.</li>
	<li>Conectarse el vidrio ITO de un multímetro y sumerja el portaobjetos en la solución de pirrol.<ol>
<li>Asegúrese de que el lado con resistencia Ω 0 es hacia el electrodo de referencia de malla de platino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicar una corriente eléctrica para iniciar la galvanoplastia de PPy en la superficie de ITO con un multímetro (corriente controlado a 3 mA/cm2 durante 4 horas).</li>
	<li>Saque el vidrio de ITO el multímetro y lavar electroplated-PPy en DI H2O para eliminar agente tensioactivo residual.</li>
	<li>Separe suavemente la placa PPy electrochapado del vidrio de ITO con una cuchilla de afeitar.<ol>
<li>Guarde la placa del PPy a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. elaboración de polidimetilsiloxano (PDMS)
<ol><li>Usando una espátula y un plato de pesaje, mezcla de 18 g de agente de base con 2 g de agente de curado y vierta la mezcla en moldes de cristal dos de 10 x 8 cm.</li>
	<li>Quite las burbujas de los moldes utilizando una cámara de vacío durante 15-20 minutos.</li>
	<li>Coloque los moldes en un horno de 70 ° C durante 3 h.</li>
	<li>Una vez fríos, use una espátula plana para quitar los PDMS de los moldes.</li>
</ol>5. fabricación de la cámara de estimulación eléctrica In Vitro
<ol><li>Autoclave de las chapas (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) y flujo de las válvulas a 120 ° C durante 1 hora.</li>
	<li>Con una diapositiva de la cámara como una plantilla, corte dos pedazos de PDMS. Nota: Una sola pieza de PDMS sirve como el perímetro de la cámara del celular con los recortes de dos cuadrados adyacentes de dentro de la cámara del celular. La otra pieza PDMS es un contorno del perímetro de la cámara.<ol>
<li>Cortar el interior cámara de celular para que sea cuadrado en forma de y coincide con la forma de la cámara del celular. Asegúrese de que la forma general de ambas piezas de PDMS es rectangular y coincide con el de la diapositiva de la cámara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los materiales de la capa siguiente de abajo hacia arriba: (1) placa de Metal (2) PDMS (sin recortes), (3) PPy placa (perpendicular a PDMS), (4) PDMS (con los recortes) y la cámara del celular (5).</li>
	<li>Empotrar el aparato una vez que está totalmente alineada.</li>
	<li>Cortar dos piezas de 60 cm de un alambre de metal y pasta de plata para conectar un cable a cada extremo de la placa de PPy que sobresale desde el exterior de la cámara. Asegúrese que los cables sean lo suficientemente largos que se extiende desde el aparato hacia el exterior de una incubadora.</li>
	<li>Una vez que la pasta de plata es curada, reforzar y sellar la conexión de cable con epoxy.<ol>
<li>Expediente de la resistencia con un multímetro para asegurarse de que el campo aplicado es el mismo en cada cámara.</li>
		<li>Para la implantación, quitar los cables; Suelte las cámaras de celular y PDMS y luego ellos separan el andamio conductivo. La dimensión de las matrices de soporte implantados es de aproximadamente 1 mm x 3 mm x 0,25 mm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. revestimiento humano células progenitoras neuronales (hNPCs) en PPy
<ol><li>Esterilizar las cámaras reunidas bajo la luz UV durante 2 horas.<ol>
<li>Después de 1 hora, gire el montado cámaras de 90°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la esterilización, capa de la superficie del PPy en la parte inferior de la cámara con 800 μl de un substrato de capa y permitir que el sustrato solidificar en la placa de PPy en una incubadora a 37 ° C en 5% CO2 para 1 h.</li>
	<li>Después de 1 hora, retire el sobrenadante de cámaras y enjuague suavemente con 1 mL de DPBS + Ca + Mg por pozo. Nota: Evite lavar la superficie del PPy con fuerza ya que el desprendimiento del sustrato de la capa.</li>
	<li>Medios celulares frescos, disocian mecánicamente las células cultivadas para su uso con las cámaras de una placa de cultivo de tejidos con pipeteo suave. Nota: Las células deben ser confluente de 90-100% a la disociación.</li>
	<li>Recoger pastillas hNPC mediante centrifugación a 8000 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Utilizando un hemocitómetro, cuenta y resuspender las células en un volumen de 100.000 células/cm2.</li>
	<li>Placa de 100.000 células en cada cámara bien (100.000 células/cm2 en 1 mL de medio).</li>
	<li>Volver cámaras a la incubadora a 37 ° C en 5% CO2.
</li>
</ol>7. electroestimulación de hNPCs
<ol><li>Un día después de la siembra de las células en las cámaras, utilizar un generador de forma de onda a aplicar estimulación eléctrica a las células.</li>
	<li>Antes de la estimulación, retire media vieja de cada cámara bien y reponer con 800 μl de medio fresco.</li>
	<li>Después de cambiaron los medios de comunicación, coloque la cámara en la incubadora, extender los cables fuera de la incubadora y conecte a un generador de forma de onda</li>
	<li>Aplicar el estímulo a las células con una señal de onda cuadrada en ±400 mV con 100 Hz por 1 h.</li>
	<li>Después de la estimulación, quitar los cables e incubar las cámaras para otro día en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Realizar posteriores análisis biológicos, incluyendo la viabilidad de las células y la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
</ol>8. implantación de PPy en Vivo
<ol><li>Realizar modelos de movimiento de Oclusión arteria cerebral media distal (dMCA) en deficiencia de células T ratas desnudas macho adulto (NIH-RNU 230 ± 30 g) como describen anteriormente2. Realizar oclusión de implantación una semana post-dMCA.</li>
	<li>Un día antes de la cirugía, dar ampicilina (1 mg/mL) a las ratas en el agua de la jaula.</li>
	<li>Anestesiar la rata en una cámara de inducción usando 0.5 - 3% mg/kg de isoflurano administrado por inhalación.</li>
	<li>Confirmar la anestesia de la rata por la falta de respuesta reflejo de pellizco del dedo del pie.<ol>
<li>Mientras el animal está bajo anestesia, continúe visualizándolo su membrana color, patrón respiratorio y temperatura rectal cada 15 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez confirmada la anestesia, aplicar lágrimas artificiales en los ojos de rata para evitar la sequedad.</li>
	<li>Asegurar que se mantenga una técnica aséptica durante este procedimiento utilizando guantes estériles y paño quirúrgico estéril13. Mantener el instrumental quirúrgico estéril dentro de un campo estéril.</li>
	<li>Mientras que la rata está bajo anestesia, perfore una craniectomía sobre la corteza izquierda. Abrir la duramadre.<ol>
<li>Retirar la duramadre del cerebro usando una aguja quirúrgica micro-fina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Implante los conductoras andamios del sistema in vitro sobre la corteza de la rata. Nota: Para nuestros experimentos, hemos implantado andamios en vitro día 3 después de hNPC chapado.<ol>
<li>Colocar el implante sobre todo en la penumbra corteza medial a la lesión de accidente cerebrovascular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de coloca el andamio, colocar surgicel sobre el implante para prevenir el movimiento con el cierre de la piel.</li>
	<li>Sutura la herida cerrada e inyectar por vía subcutánea las ratas con SR de buprenorfina a dosis de 1 mg/kg para manejar el dolor asociado con la cirugía estereotáctica y la obstrucción de la dMCA.</li>
	<li>Colocar la rata en una jaula de recuperación como recupera la conciencia.<ol>
<li>Nunca descuide el animal mientras está inconsciente.</li>
		<li>No coloque el animal con otros hasta que se ha ganado totalmente el sentido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vigilar animales diariamente para detectar signos de dolor incluyendo pérdida de peso corporal, ingesta disminuida de alimentos y agua, reducida capa arreglo desarreglado, disminuido, aumentado la actividad espontánea, postura anormal, deshidratación, piel acampar, ojos hundidos, ocultar, uno mismo-mutilación, respiración rápida, respiración de boca abierta, fasciculaciones, temblor, temblor y vocalización.<ol>
<li>Monitorear los animales todos los días hasta que se vea que son comer, beber, aseo personal y aumentar de peso; y luego semanal después de aumento de peso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanization temprana mediante inhalación de CO2 y la confirmación secundaria de euthanization (para el animal no revivirá debido al CO2 inhalación de oxígeno normal suministro post) ocurrirá a cualquier animal que parece ser no comer, beber y aumentar de peso después del procedimiento quirúrgico inicial; aparece en el dolor; o aparece incapaz de completar las pruebas de comportamiento debido a una mayor de lo esperado déficit motor de la corteza.</li>
</ol>

<ol><li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Science+of+Stroke%3A+Mechanisms+in+Search+of+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Preconditioning+of+Stem+Cells+with+a+Conductive+Polymer+Scaffold+Enhances+Stroke+Recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery.</a> Biomaterials. 142, 31-40 (2017).</li>
<li>Steinberg, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+of+Transplanted+Modified+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Stroke%3A+A+Phase+1%2F2a+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study.</a> Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Stroke+Therapeutics%3A+Unraveling+Stroke+Pathophysiology+and+Its+Impact+on+Clinical+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Schabitz, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Enhances+Poststroke+Sensorimotor+Recovery+and+Stimulates+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis.</a> Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).</li>
<li>Liauw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+1+and+2+Are+Necessary+For+Synaptic+Plasticity+and+Functional+Recovery+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).</li>
<li>Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Encapsulating+Biomaterial+Regulates+Mesenchymal+Stromal%2FStem+Cell+Differentiation+and+Macrophage+Immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+Tunable+Stress+Relaxation+Regulate+Stem+Cell+Fate+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
<li>Ballios, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hyaluronan-Based+Injectable+Hydrogel+Improves+the+Survival+and+Integration+of+Stem+Cell+Progeny+following+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+Injured+Spinal+Cord+by+Transplantation+of+Neural+Stem+Cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+Biomaterials%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Cases%22%5BJournal%5D)">Implant Biomaterials: A Comprehensive Review.</a> World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).</li>
<li>Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Stimulation+Elicits+Neural+Stem+Cells+Activation%3A+New+Perspectives+in+CNS+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair.</a> Front Hum Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Abdelwahid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Death+and+Survival+in+Heart+Regeneration+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair.</a> Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Status+of+Stem+Cell+Therapy+for+Ischemic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+Biocompatibility+of+Polypyrrole+Implants+Suitable+for+Neural+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics.</a> Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).</li>
<li>Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Induces+Proliferation+of+Human+Airway+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells.</a> J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).</li>
<li>Lopes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+2+Regulates+Cell+Proliferation+Induced+by+Rac1+Redox-Dependent+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).</li>
<li>Ploughman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Contributes+to+Recovery+of+Skilled+Reaching+After+Focal+Ischemia+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats.</a> Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).</li>
<li>Baker, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Stem+Cell+Therapy+Enhances+Recovery+in+an+Ischemic+Stroke+Pig+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model.</a> Sci Rep. 7 (1), 10075(2017).</li>
<li>Bacigaluppi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Transplantation+Induces+Stroke+Recovery+by+Upregulating+Glutamate+Transporter+GLT-1+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses con este trabajo.

Creciente evidencia ha demostrado la promesa de las células madre como terapia de movimiento nuevo. Esta promesa ha dado lugar a un importante esfuerzo para avanzar en la terapéutica de células madre a la cabecera del paciente con al menos 40 ensayos clínicos completados o en curso. Patología cerebrovascular ofrece un único trastorno neurológico que se presta a la terapia de células madre porque después de la injuria aguda, no existe ningún proceso de neurodegenerativas prevención recuperación. El mecanismo exacto de la ...

Accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte en el mundo y la quinta causa de muerte en los Estados Unidos. A pesar de estas tasas de mortalidad altas, tratamientos para la recuperación del derrame cerebral en la actualidad siguen siendo un desafío no viables opciones médicas disponibles en la actualidad1. Hay actualmente sobre 300 ensayos clínicos relacionados con accidentes cerebrovasculares isquémicos, de los cuales sólo 40 utilizar células madre. Estudios previos han demostrado que terapias con células madre tienen un efecto beneficioso sobre tiempos reparación2,3. Factores paracrinos como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y la tromboespondina-1 (THBS-1) liberado de las células progenitoras neurales humanas trasplantadas (hNPCs) han demostrado mejor recuperación funcional a través de mecanismos asociados con un aumento en formación, angiogénesis, ramificación dendrítica y nuevas proyecciones axonales de la sinapsis, así como modular el sistema inmune4,5,6. Sin embargo, los métodos de entrega óptima de las células madre permanecen fuera de alcance.
Entrega exitosa la célula de vástago en el cerebro sigue siendo un desafío. En la actualidad, hidrogel inyectable y sistemas de andamios poliméricos se han introducido para proporcionar células madre. Estos métodos de entrega protegen células madre durante el trasplante, así como ofrecen protección contra el ambiente áspero del poste-movimiento como respuesta inflamatoria del hospedador y condiciones hipóxicas7,8,9 , 10. sin embargo, los materiales más comúnmente usados son inertes, que limita el uso de modulación continua (es decir, estimulación eléctrica) de la células11. La estimulación eléctrica es una clave que influye en la diferenciación, densidad de canales de iones y consecuencia del neurite de células madre12. En comparación con polímeros inertes, polímeros conductores pueden llevar un actual lo que permite la estimulación eléctrica y la manipulación de células madre2. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual la estimulación eléctrica modula la liberación de factor neurotrófico (es decir, BDNF y THBS-1) es todavía no explorado.
En este protocolo, describimos los pasos para construir un sistema de cultivo celular que consiste en un andamio de polímero conductor, polypyrrole (PPy), que permite en vitro la estimulación eléctrica. Debido a la forma en que está fabricado el sistema de cultivo celular, es posible la implantación posterior del andamio sembrado de células sobre la corteza peri infarto. Para este sistema, nos requisito eléctricamente las células madre en el andamio para un corto período de tiempo antes de la implantación. Después de la estimulación eléctrica, el andamio de polímero conductor llevando las células es implantado con éxito intracranealmente mediante un método mínimamente invasivo.

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>20 ng/mL para medios de trabajo</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>cb40234a</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>LIF Protein, Recom. Hum. (10 &micro; g/mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>LIF1010</td><td>10 ng/mL para medios de trabajo</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicona 3,9 kg</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisherbrand</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>Concentrado de ácido nítrico (certificado) ACS, Fisher Chemical</td><td>Fisherbrand</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>ITO Glass</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilbencenosulfonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma</td><td>131709-500ML</td><td>Proteja la solución de pirrol de la luz y la temperatura ambiente</td></tr><tr><td>8 cámaras de deslizamiento de vidrio de pocillos</td><td>Thermo Sci Nuc&nbsp;</td><td>125658</td><td>Separe la cámara de la celda y manténgala en condiciones esterilizadas</td></tr><tr><td>Soporte de superficie plana, 3"x1"</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>PINTURA PLATEADA DE DOS PARTES 14G</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica&nbsp;</td><td>1264214</td><td>Mezcle dos partes (1:1) en una placa de plástico</td></tr><tr><td>DPBS, 1x, con Ca y Mg, sin Phenol Red</td><td>Genesse&nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA Kit de medios de cultivo de células neuronales</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1 Kit de expansión de progenitores neurales humanos</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>&nbsp; hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>Válvula de ajuste de flujo sin contacto, latón niquelado, para tubo de 3/32" a 5/8" de diámetro exterior</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>5330K22</td><td></td></tr><tr><td>Multímetro</td><td>Keysight&nbsp;</td><td>E3641A Generador de</td><td></td></tr><tr><td>espuma de onda</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>Mallas Pt</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>Electrodo de referencia con dimensiones, 1x1 cm</td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad, para células de mamíferos</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02718934_s1</tr><tr><td>THBS1</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs00962908_m1</tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>Mini Kit RNeasy (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAtrituradora (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>Juego de DNasa sin RNasa (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc, 100 x 20 y micro; L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>4369510</tr><tr><td>7-8 semanas de edad, macho, ratas RNU</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethicon Sutura de seda</td><td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Sistema de anestesia de mesa para animales de laboratorio</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Original Hemostático Absorbible</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico estándar de laboratorio, Rat</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; Safeskin Guantes de examen estériles de nitrilo púrpura</td><td>Fisherbrand</td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>Cortina estéril</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Mango de hoja de bisturí de acero inoxidable Shandon, sostiene n.º 20-25 hojas</td><td>Fisherbrand</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>Walter Stern Hoja de bisturí serie 300</td><td>Fisherbrand</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>Frazier Micro Seccionador Aparato</td><td>Harvard</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Terapia de células madre se ha convertido en una carrera emocionante terapéutica, pero el método óptimo de entrega es incierto. Mientras que la técnica de microinyección se ha utilizado durante décadas para proporcionar células madre en modelos de ictus, esta técnica está limitada por la falta de capacidad para manipular las células madre antes de la inyección. Este artículo detalla un método de usar un andamio de polímero conductivo para la entrega de la célula de vástago. Estimulación eléctrica de las células madre utilizando un andamio de polímero conductor altera la supervivencia celular, respuesta inflamatoria y remodelación sináptica en los genes de la célula de vástago. Después de preacondicionamiento eléctricos, las células madre en el andamio se trasplantan intracranially en un modelo de rata de oclusión distal de la arteria cerebral media. Este protocolo describe una técnica poderosa para manipular las células madre a través de un andamio de polímero conductor y crea una nueva herramienta para desarrollar terapia basada en células madre.

El esquema que se muestra en la figura 1 representa el flujo de trabajo general de la estimulación eléctrica de hNPCs y posibles aplicaciones posteriores. Una limitación actual en terapia de células madre es que las células madre están expuestas a un ambiente áspero de poste-trasplante incluyendo inflamación y condiciones isquémicas. Estas difíciles condiciones que puedan limitan su eficacia terapéutica14,1...

Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para permitir la siembra de células madre en un andamio de polímero conductor en vitro la estimulación eléctrica y posterior en vivo la implantación del andamio sembrado de células madre usando un técnica mínimamente invasiva.

Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

El objetivo general de este procedimiento es crear una plataforma para la estimulación eléctrica in vitro de células madre en un andamio de polímero conductor, con su posterior implantación in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de accidentes cerebrovasculares y la biología de las células madre, ya que proporciona un medio para modular las células madre. La principal ventaja es que las células madre pueden ser optimizadas in vitro, y posteriormente implantadas.Aunque este método puede proporcionar información sobre la recuperación del ictus, también se puede aplicar a otros sistemas como un nuevo método de administración de células. Por lo general, los usuarios nuevos en esta técnica tendrán dificultades debido a la precisión requerida para el ensamblaje de la cámara celular y la técnica involucrada con la craneectomía. En preparación, autoclave las placas metálicas de 2,5 por 12,5 centímetros y las válvulas de flujo.A continuación, utilizando un portaobjetos de cámara como plantilla, corte dos trozos de PDMS. Una sola pieza sirve para delinear el perímetro de la cámara. En la segunda pieza, corte dos piezas adyacentes del interior de la corredera de la cámara.Ambas piezas deben ser rectangulares y coincidir con la corredera de la cámara. Ahora, superponga los materiales. Comience con la placa de metal, luego el PDMS sin cortar, luego la placa de polipirrol, orientada perpendicularmente, luego el PDMS con recortes y, finalmente, la cámara de celdas.Alinee las capas con cuidado y sujete el aparato. A continuación, corte dos trozos de un alambre metálico para extenderlo desde el aparato hasta el exterior de la incubadora que lo contendrá. Las longitudes de 60 centímetros suelen ser suficientes.A continuación, use pasta de plata para unir un cable a cada extremo de la placa de polipirrol que sobresale del exterior de la cámara. Una vez que la pasta de plata esté curada, refuerce y selle las conexiones con un epoxi. Ahora, registre la resistencia a través del ensamblaje con un multímetro.El campo aplicado debe ser el mismo en cada cámara. A continuación, coloque las células en el conjunto y estimulícelas eléctricamente como se describe en el protocolo de texto. Antes de implantar las células, retire los cables del conjunto.A continuación, desenganche las cámaras de las celdas y separe el PDMS del andamio conductor. El andamio ya está listo para la implantación. Un día antes de la cirugía, proporcionar al animal en cuestión ampicilina en su agua potable.El día de la cirugía, anestesiar a la rata con isoflurano y confirmar la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. Ahora, aplica lágrimas artificiales a los ojos de la rata para mantenerlos húmedos. Después de afeitar el cráneo, cubra al animal y prepárese para una cirugía estéril.Use prendas protectoras, desempaque las herramientas esterilizadas y esterilice el cuero cabelludo. Para la craneectomía, perfore un orificio por encima de la corteza izquierda hasta la duramadre. Haga la abertura un poco más grande que 1 por 3 milímetros, del tamaño del implante.A continuación, abra la duramadre y extraiga la duramadre del cerebro con una aguja quirúrgica microfina. Retire el equipo de la incubadora de cultivo TC y desactive los equipos. A continuación, implante cuidadosamente el andamio conductor del sistema in vitro en la corteza de la rata.A continuación, cubra el implante con Surgicel para asegurarlo, o puede moverse durante el cierre de la piel. Ahora, sutura la herida con una sutura de seda 4-0. Después de completar las suturas, inyecte por vía subcutánea a las ratas buprenorfina SR. Luego, coloca a la rata en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia.El procedimiento postoperatorio se detalla en el protocolo de texto. Las células progenitoras neurales humanas se expusieron a estimulación eléctrica y luego se tiñeron con ensayos de viabilidad celular. El color verde es indicativo de una célula viva.Las células fueron claramente capaces de sobrevivir a la estimulación eléctrica. Los factores liberados por las células neuroprogenitoras que son importantes en la recuperación del accidente cerebrovascular se evaluaron a partir de un microgramo de ARN total utilizando RTPCR cuantitativo. Después de normalizar los resultados utilizando el método del umbral del ciclo delta delta, revelan que la exposición a la estimulación eléctrica reguló al alza la expresión de BDNF y THBS1.Después de ver este procedimiento, debe tener una buena comprensión de cómo crear un sistema de cultivo celular para células madre conductoras de electricidad y la posterior implantación de esas células madre en un modelo de rata. Una vez que se domina, el procedimiento se puede realizar en 45 minutos si se realiza correctamente. Mientras intenta este procedimiento, es importante recordar que siempre debe monitorear a los animales para verificar el patrón de respiración y el color de la membrana adecuados, para garantizar una anestesia adecuada.No olvide que trabajar con ratas y células madre puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar el EPP adecuado.

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de...

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Este video muestra el procedimiento de fabricación de microportadores derivados de matriz extracelular por electroaspersión. Estos microportadores simulan el microambiente específico del tejido nativo y son estables en modelos de cultivo celular in vitro en 3D a largo plazo.

Fabricación de bioandamios por electropulverización: una técnica para generar andamios de microportadores derivados de la matriz extracelular de tejido descelularizado

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Este artículo describe una gama de configuraciones para sembrar células madre mesenquimales humanas en materiales, en este caso hilos electrohilados, que no cubren la base de las placas de pocillos de cultivo estándar con el fin de maximizar y cuantificar el número de células que se adhieren inicialmente en comparación con la densidad de siembra conocida.

Optimización de unión de las células madre mesenquimales humanas en poli (ε-caprolactona) electrohiladas Hilos

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Este artículo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de hojas de varias capas de células madre con células madre favorable propiedad.

Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D

Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

Aquí presentamos un protocolo para la construcción de una cámara de cultivo celular diseñada para exponer distintos tipos de estimulación eléctrica y su uso en el tratamiento de células madre mesenquimales para realzar la diferenciación osteogénica de las células.

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Esta metodología tiene como objetivo ilustrar los mecanismos por los cuales las señales de matriz extracelular tales como rigidez del sustrato, composición de proteínas y morfología celular regulan el fenotipo de células Schwann (SC).

Preparación de microambientes de matriz extracelular sintonizable para evaluar la especificación del fenotipo celular Schwann

Este artículo presenta una estrategia para construir modelos de elementos finitos de materiales conductores fibrosos expuestos a un campo eléctrico (EF). Los modelos se pueden utilizar para estimar la entrada eléctrica que reciben las células sembradas en dichos materiales y evaluar el impacto de cambiar las propiedades, la estructura o la orientación del material constituyente del andamio.

Modelado de elementos finitos de un microambiente eléctrico celular

Aprende a fabricar un andamio de polímero conductor para cultivar células madre con estimulación eléctrica in vitro e implantación in vivo mínimamente invasiva. Este método optimiza el comportamiento celular para investigación en recuperación post-ictus.

Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

Explorar más videos