Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre
13 de abril de 2018
Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para permitir la siembra de células madre en un andamio de polímero conductor en vitro la estimulación eléctrica y posterior en vivo la implantación del andamio sembrado de células madre usando un técnica mínimamente invasiva.
El objetivo general de este procedimiento es crear una plataforma para la estimulación eléctrica in vitro de células madre en un andamio de polímero conductor, con su posterior implantación in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de accidentes cerebrovasculares y la biología de las células madre, ya que proporciona un medio para modular las células madre. La principal ventaja es que las células madre pueden ser optimizadas in vitro, y posteriormente implantadas.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la recuperación del ictus, también se puede aplicar a otros sistemas como un nuevo método de administración de células. Por lo general, los usuarios nuevos en esta técnica tendrán dificultades debido a la precisión requerida para el ensamblaje de la cámara celular y la técnica involucrada con la craneectomía. En preparación, autoclave las placas metálicas de 2,5 por 12,5 centímetros y las válvulas de flujo.
A continuación, utilizando un portaobjetos de cámara como plantilla, corte dos trozos de PDMS. Una sola pieza sirve para delinear el perímetro de la cámara. En la segunda pieza, corte dos piezas adyacentes del interior de la corredera de la cámara.
Ambas piezas deben ser rectangulares y coincidir con la corredera de la cámara. Ahora, superponga los materiales. Comience con la placa de metal, luego el PDMS sin cortar, luego la placa de polipirrol, orientada perpendicularmente, luego el PDMS con recortes y, finalmente, la cámara de celdas.
Alinee las capas con cuidado y sujete el aparato. A continuación, corte dos trozos de un alambre metálico para extenderlo desde el aparato hasta el exterior de la incubadora que lo contendrá. Las longitudes de 60 centímetros suelen ser suficientes.
A continuación, use pasta de plata para unir un cable a cada extremo de la placa de polipirrol que sobresale del exterior de la cámara. Una vez que la pasta de plata esté curada, refuerce y selle las conexiones con un epoxi. Ahora, registre la resistencia a través del ensamblaje con un multímetro.
El campo aplicado debe ser el mismo en cada cámara. A continuación, coloque las células en el conjunto y estimulícelas eléctricamente como se describe en el protocolo de texto. Antes de implantar las células, retire los cables del conjunto.
A continuación, desenganche las cámaras de las celdas y separe el PDMS del andamio conductor. El andamio ya está listo para la implantación. Un día antes de la cirugía, proporcionar al animal en cuestión ampicilina en su agua potable.
El día de la cirugía, anestesiar a la rata con isoflurano y confirmar la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. Ahora, aplica lágrimas artificiales a los ojos de la rata para mantenerlos húmedos. Después de afeitar el cráneo, cubra al animal y prepárese para una cirugía estéril.
Use prendas protectoras, desempaque las herramientas esterilizadas y esterilice el cuero cabelludo. Para la craneectomía, perfore un orificio por encima de la corteza izquierda hasta la duramadre. Haga la abertura un poco más grande que 1 por 3 milímetros, del tamaño del implante.
A continuación, abra la duramadre y extraiga la duramadre del cerebro con una aguja quirúrgica microfina. Retire el equipo de la incubadora de cultivo TC y desactive los equipos. A continuación, implante cuidadosamente el andamio conductor del sistema in vitro en la corteza de la rata.
A continuación, cubra el implante con Surgicel para asegurarlo, o puede moverse durante el cierre de la piel. Ahora, sutura la herida con una sutura de seda 4-0. Después de completar las suturas, inyecte por vía subcutánea a las ratas buprenorfina SR. Luego, coloca a la rata en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia.
El procedimiento postoperatorio se detalla en el protocolo de texto. Las células progenitoras neurales humanas se expusieron a estimulación eléctrica y luego se tiñeron con ensayos de viabilidad celular. El color verde es indicativo de una célula viva.
Las células fueron claramente capaces de sobrevivir a la estimulación eléctrica. Los factores liberados por las células neuroprogenitoras que son importantes en la recuperación del accidente cerebrovascular se evaluaron a partir de un microgramo de ARN total utilizando RTPCR cuantitativo. Después de normalizar los resultados utilizando el método del umbral del ciclo delta delta, revelan que la exposición a la estimulación eléctrica reguló al alza la expresión de BDNF y THBS1.
Después de ver este procedimiento, debe tener una buena comprensión de cómo crear un sistema de cultivo celular para células madre conductoras de electricidad y la posterior implantación de esas células madre en un modelo de rata. Una vez que se domina, el procedimiento se puede realizar en 45 minutos si se realiza correctamente. Mientras intenta este procedimiento, es importante recordar que siempre debe monitorear a los animales para verificar el patrón de respiración y el color de la membrana adecuados, para garantizar una anestesia adecuada.
No olvide que trabajar con ratas y células madre puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar el EPP adecuado.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para sembrar células madre en un andamio de polímero conductor. Permite la estimulación eléctrica in vitro e implantación subsiguiente in vivo mediante una técnica mínimamente invasiva.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología de Células Madre
- Técnicas de Estimulación Eléctrica
Antecedentes
- El método tiene como objetivo optimizar las células madre para la investigación en la recuperación del accidente cerebrovascular.
- Proporciona un enfoque novedoso para modular el comportamiento de las células madre.
- La precisión es crucial para el ensamblaje exitoso de la cámara celular.
- Incluye una técnica de craneotomía mínimamente invasiva para la implantación.
Objetivo del estudio
- Crear una plataforma para la estimulación eléctrica in vitro de células madre.
- Facilitar la implantación in vivo de células madre optimizadas.
- Explorar aplicaciones en la investigación del accidente cerebrovascular y otros sistemas.
Métodos Utilizados
- Fabricación de un andamiaje de polímero conductor.
- Siembra de células madre sobre el andamiaje.
- Estimulación eléctrica in vitro de las células madre.
- Técnica de implantación mínimamente invasiva.
Resultados principales
- Optimización exitosa de células madre para implante.
- Conocimientos sobre la modulación del comportamiento de las células madre.
- Aplicaciones potenciales en la recuperación tras un accidente cerebrovascular y en métodos de administración celular.
- Dificultades identificadas para nuevos usuarios respecto a la precisión y la técnica.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para la investigación con células madre.
- Mejora la comprensión de los mecanismos de recuperación tras un accidente cerebrovascular.
- Una exploración adicional podría conducir a avances en la terapia celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los andamios conductores eléctricos para la administración de células madre ofrecen una plataforma novedosa para modular el fenotipo celular antes del trasplante, abordando un desafío clave en la medicina regenerativa y la modelización de enfermedades neurológicas. Este enfoque permite la optimización in vitro de las propiedades de las células madre, lo que respalda la confianza predictiva en estudios posteriores in vivo y facilita el avance ajustado al riesgo en las fases preclínicas. La modularidad del método lo posiciona como una capacidad reutilizable para diversas aplicaciones en terapia celular e ingeniería de tejidos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la respuesta de las células madre a estímulos eléctricos, aclarando las vías mecanicistas relacionadas con la supervivencia celular y la neuroregeneración.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al permitir la modulación y evaluación previas al implante de la expresión génica asociada a resultados terapéuticos.
- Facilita la validación funcional de objetivos al correlacionar el acondicionamiento in vitro con el desempeño in vivo en modelos de enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara poblaciones estandarizadas de células madre preacondicionadas eléctricamente para ensayos posteriores reproducibles.
- Permite la evaluación cuantitativa de la expresión génica y la viabilidad celular tras la estimulación, apoyando el desarrollo de ensayos.
- Ofrece una plataforma para la evaluación escalable de parámetros de andamiaje y estimulación en diferentes tipos celulares.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la modulación celular in vitro con modelos in vivo relevantes para la enfermedad, favoreciendo el descubrimiento traslacional de biomarcadores.
- Permite la continuidad desde la optimización celular en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica en modelos de lesión neurológica.
- Apoya decisiones ajustadas al riesgo mediante la vinculación de los efectos del acondicionamiento con resultados funcionales tras el implante.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la modulación de células madre in vitro, seguida de pruebas in vivo en modelos de enfermedades como el accidente cerebrovascular. Apoya la optimización iterativa y los análisis comparativos en diferentes condiciones experimentales.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona una plataforma para la prueba de hipótesis sobre el impacto de la estimulación eléctrica en el fenotipo de las células madre y la expresión génica.
- Cribado Proporciona poblaciones celulares reproducibles y preacondicionadas para ensayos funcionales posteriores.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de la expresión génica y la viabilidad, favoreciendo la toma de decisiones basada en datos.
- Investigación traslacional Vincula la optimización in vitro con estudios de eficacia in vivo en modelos animales pertinentes.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo modular adaptable a diversos tipos celulares y contextos terapéuticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los resultados de la terapia celular al permitir la modulación y evaluación previas al implante.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de preparación y estimulación celular, mejorando la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción al vincular la optimización in vitro con el rendimiento in vivo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos a terapias celulares y modalidades de administración.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, estimulación eléctrica y cirugía en animales pequeños.
- Exige un ensamblaje preciso de cámaras celulares multicapa y andamios conductores.
- Necesita instrumentación validada para la estimulación eléctrica y el análisis cuantitativo de la expresión génica.
- La estandarización entre equipos es esencial para la reproducibilidad entre experimentos y sitios.
- La adaptación a otros tipos celulares o modelos de enfermedad puede requerir optimización y validación del protocolo.
