Name: El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células epicárdicas derivadas de tejido cardíaco humano para estudiar su comportamiento en desarrollo y enfermedad. Este método permite investigar la transición epitelio-mesenquimal.

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Esta investigación es apoyada por la organización de países bajos para la investigación científica (NWO) (VENI 016.146.079) y una beca de investigación LUMC a AMS y Stichting LUMC de Bontius (MJG).

Todos los experimentos con muestras de tejido humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Leiden University Medical Center y se ajusta a la declaración de Helsinki. Todas las medidas se realizan con equipo estéril en un flujo de la cultura de célula gabinete.
1. preparaciones
<ol><li>Preparar medio de DAPC mezcla de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM low-glucosa) y medio 199 (M199) en una proporción 1:1. Agregar 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS, calor inactivada durante 25 minutos a 56 ° C) y completar con 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL. Caliente previamente el medio de DAPC en un baño de agua de 37 ° C.</li>
	<li>Caliente previamente la tripsina 0.25%/EDTA (1:1) en un baño de agua de 37 ° C.</li>
	<li>Pozos de la capa con la gelatina. Añadir 0.1% gelatina/PBS a cada pocillo e incubar las placas durante al menos 15 min a 37 ° C. Directrices para la placa de cultivo celular requiere se resumen en la tabla 1. Retire con cuidado todo el líquido antes de las células de la galjanoplastia.</li>
	<li>Preparar una solución stock de 10 mM SB431542 (SB), diluida en DMSO (PRECAUCIÓN). 50 alícuotas de μL en tubos de centrífuga de polipropileno de fondo cónico, como tubos de Eppendorf y almacenar a-20 ° C. Nota que alícuotas SB pueden ser descongelados una sola vez.</li>
</ol>2. recuperación y almacenamiento de las muestras del corazón Fetal y adulto
<ol><li>Tienda humanas aurículas adultos directamente en la remoción durante la cirugía en un tubo de 50 mL con 15 mL alta glucosa DMEM con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. Las muestras son generalmente 3-5 cm de tamaño y se pueden almacenar hasta 48 h después de la disección.</li>
	<li>Guarde el corazón fetal obtenidos de material de aborto en medio de la CDEP a 4 ° C hasta 24 horas después de aislamiento. De este protocolo, utilizar muestras con una edad gestacional entre las semanas 12-22. Tenga en cuenta que el corazón entero se puede utilizar para el aislamiento del epicardio.</li>
</ol>3. aislamiento de la capa epicárdica
<ol><li>En el gabinete de flujo laminar, preparar un plato de cultivo celular de 100 mm con PBS y coloque una gota de separado (~ 200 μL) de PBS en la tapa. Llene un tubo de 15 mL con medio de DAPC precalentado 5 mL.</li>
	<li>Coloque el tejido en el plato de cultivo de células con PBS. Asegúrese de que el tejido se humedece frecuentemente durante el procedimiento.</li>
	<li>Mediante un estereomicroscopio, quitar tanto de la capa epicárdica de la muestra de tejido como sea posible por pelar apagado con unas pinzas. Nota: El epicardio puede reconocerse como una capa muy fina, transparente firmemente adherido al exterior del corazón (figura 1A). Trate de evitar la contaminación con tejido adiposo epicárdico y los vasos sanguíneos ya que esto obstaculizará el aislamiento.</li>
	<li>Recoge piezas de tejido epicárdico en la gota de PBS en la tapa.</li>
	<li>Cortar el tejido epicárdico en trozos pequeños (0.5 mm3) usando un bisturí (figura 1B), o usando las afiladas puntas de pinzas pequeñas. Tenga en cuenta que las piezas puedan pasar un P1, 000 punta de la pipeta (paso 3.6).</li>
	<li>Añadir 1 mL de tripsina en el tejido epicárdico y recoger los pedazos y tripsina con un P1, 000 punta de la pipeta. Transferir el tejido en un tubo de centrífuga cónico de 1,5 mL (figura 1).</li>
	<li>Incubar el tubo en un baño de agua de 37 ° C durante 10 min, agitando a ~ 60 rpm.</li>
	<li>Retire el tubo del baño y limpie el exterior del tubo con etanol al 70%.</li>
	<li>Permitir que el tejido se hunden hasta el fondo del tubo (figura 1) y transferir cuidadosamente el sobrenadante que contiene las células epicárdicas al tubo de 15 mL que contiene 5 mL medio de DAPC para inactivar la tripsina.</li>
	<li>Reponer el tejido restante en el tubo de centrífuga cónico con tripsina 1 mL y mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Repita el paso 3.7 a 3.10 dos veces. En la etapa final, después de un total de 30 min de incubación de la tripsina, transferir el sobrenadante y el restante tejido epicárdico en el tubo que contiene medio de DAPC.</li>
	<li>Cuando todas las células se recogen en medio de la CDEP, suavemente pasar la suspensión a través de una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 19 a un nuevo tubo de 15 mL a disociar mecánicamente las células (Figura 1E). Nota: Asegúrese de homogeneizar la suspensión mediante pipeteo arriba y abajo antes de pasar la solución a través de la aguja para evitar que la aguja que obstruye.</li>
	<li>Para más disociar las células, repita el paso 3.12 con una aguja de calibre 21.</li>
	<li>Coloque un colador celular de 100 μm en la parte superior un tubo de 50 mL y transferir el medio que contiene las células epicárdicas en el filtro con una pipeta de 10 mL para eliminar los grupos restantes (Figura 1F).</li>
	<li>Lave el filtro para recoger células residuales mediante pipeteo medio de DAPC 5 mL en el colador.</li>
	<li>Pipetear la suspensión de la célula del tubo 50 mL en un tubo de 15 mL. Puesto que las células se hunden hasta el fondo del tubo, agite suavemente la solución antes de pipetear. Nota: Aunque este paso no es necesario, un tubo más pequeño ayuda a la visualización de la pelotilla después de la centrifugación.</li>
	<li>Centrifugue a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (figura 1).</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células (figura 1 H) en el volumen requerido de medio CDEP (tabla 1). Nota: Para EPDCs fetales, utilizar directamente medio DAPC conteniendo 10 μm ALK5 kinase del inhibidor de la (DAPC + SB). Las células adultas se pueden platear sin SB durante el primer paso.</li>
	<li>Placa de la suspensión de células en las placas recubierta de gelatina (figura 1I). El tamaño del pozo depende del tamaño de la muestra de tejido epicárdico (tabla 1). Nota que confluencia baja induce la ocurrencia de la EMT.</li>
	<li>Colocar las células en la incubadora durante al menos 48 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir que las células fijar a la placa de cultivo.</li>
</ol>4. cultura de EPDCs
<ol><li>Reponer el medio DAPC + SB al menos cada 3 días.</li>
	<li>Inspeccione las celdas por lo menos cada 3 días con el microscopio. Cuando las células alcanzan confluencia, es decir, cuando la placa de cultivo se cubre totalmente con las células, las células en una proporción de 1:2 superficie del paso. Tenga en cuenta que llegar a confluencia puede tomar ~ 5-10 días.<ol>
<li>Aspire el medio con una pipeta o un sistema de aspiración, por ejemplo, una pipeta de vidrio.</li>
		<li>Lave cuidadosamente las células mediante la adición de PBS a las células. Suavemente la placa del remolino y aspirar el PBS.</li>
		<li>Añadir tripsina a la placa. Gire suavemente la placa para cubrir todas las celdas con tripsina e Incube la placa durante 1 min a 37 ° C. Nota: Utilizar como tripsina poco como sea posible (indicación: 200 μL por pozo de 6 bien la placa)</li>
		<li>Toque en la placa para separar mecánicamente las células de la parte inferior de la placa. Utilizar el microscopio para comprobar visualmente si las células han separado. Si no, incubar la placa de cultivo celular por un minuto.</li>
		<li>Añadir el volumen necesario de medio DAPC + SB a las células, suspender mediante pipeteo arriba y abajo y transferir la suspensión a una placa de cultivo gelatina cubierta nueva. Nota: en general, las células pueden tener una morfología de adoquines hasta el paso 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. inducción de la EMT en EPDCs
<ol><li>Para inducir la EMT, disociar las células con tripsina y transferencia de las células a la nueva gelatina cubierto de pozos en una proporción de superficie de 1:2 en medio de la CDEP + SB, como se describe en 4 e incuban durante al menos 24 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Compruebe si confluency es 50-70% y si EPDCs tienen una morfología de adoquines. Nota: Confluencia afecta la capacidad de EPDCs a EMT.</li>
	<li>Aspirar el medio de las células y lavar las células con PBS (vea el paso 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>Estimular las células con 1 ng/mL TGFβ3 en medio DAPC y colocarlos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 durante 5 días. Tenga en cuenta que durante la estimulación, el medio de DAPC con TGFβ3 no tiene que ser reemplazados.</li>
	<li>Monitorear diariamente las células. Después de 5 días, las células que experimentaron la EMT son reconocidas por una morfología en forma de huso (figura 2A).</li>
	<li>Cultura en forma de huso EPDCs según el método descrito en 4 sin adición de SB o TGFβ al medio de DAPC. Tenga en cuenta que en general, fusiformes EPDCs puede cultivarse hasta el paso 20.</li>
	<li>Validar la ocurrencia de la EMT con la tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la vimentina marcadores mesenquimales αSMA o phalloidin para detectar la formación de fibras de estrés de F-actina (figura 2B), o uso de qRT-PCR para genes relacionados con la EMT ( por ejemplo,, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Caderina, MMP3, Snail, Slug) (figura 2 y tabla 2).</li>
</ol>

<ol><li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells%3A+Their+origin%2C+role+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li>
<li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li>
<li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li>
<li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-Derived+Heart+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li>
<li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li>
<li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor%2C+FGFR-1%2C+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).</li>
<li>Lavine, K. J., Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).</li>
<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li>
<li>Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li>
<li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation%2C+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li>
<li>Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+and+Orifice+Development+Is+Associated+With+Proper+Timing+of+Epicardial+Outgrowth+and+Correlated+Fas+Ligand+Associated+Apoptosis+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns.</a> Circulation Research. 96 (5), (2005).</li>
<li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li>
<li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692(2012).</li>
<li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li>
<li>Smart, N., Bollini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+cardiomyocytes+from+within+the+activated+adult+heart+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury.</a> Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).</li>
<li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells%3A+a+novel+model+to+study+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li>
<li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li>
<li>Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+epithelial-to-mesenchymal+transformation+in+human+adult+epicardial+cells+is+regulated+by+TGF%CE%B2-signaling+and+WT1%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1.</a> Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).</li>
<li>Chechi, K., Richard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermogenic+potential+and+physiological+relevance+of+human+epicardial+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+Supplements%22%5BJournal%5D)">Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue.</a> International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un protocolo detallado para aislar y la cultura primarias epicárdicas células derivadas de los corazones humanos adultos y fetales. Amplia caracterización de estas células ha sido previamente publicado17. Hemos demostrado que se pueden mantener ambos tipos de células como las células epiteliales de adoquines-como cuando se cultivan con el inhibidor de la cinasa del ALK5 SB431542. EMT es una parte integral de activación epicárdica en vivo durante el desarrollo y la respues...

El epicardio, un capa epitelial unicelular que sobres el corazón, es de vital importancia para el desarrollo cardíaco y reparación (revisado en Smits et al. 1). retraso mental, el epicardio deriva el órgano proepicárdicas, una pequeña estructura situada en la base del corazón en desarrollo. Desarrollo día E9.5 en Concepción después de 4 semanas en ser humano y el ratón, las células comienzan a migrar desde esta estructura de coliflor y cubrir el desarrollo del miocardio2. Una vez que se forma una capa única de células epiteliales, una porción de las células epicárdicas sufre epitelial de transición mesenquimal (EMT). Durante la EMT, las células pierden sus características epiteliales, tales como adhesiones célula-célula y obtención un fenotipo mesenquimal que les da la capacidad de migrar en el miocardio en vías de desarrollo. Las células derivadas epicárdicas formadas (EPDCs) pueden distinguir en varios tipos de células cardiacas incluyendo fibroblastos, células musculares lisas y potencialmente cardiomiocitos y células endoteliales3, aunque la diferenciación de estos últimos dos celulares las poblaciones sigue siendo objeto de debate (revisado en Smits et al. 4). Además, el epicardio proporciona señales instructivas paracrina al miocardio para regular su crecimiento y vascularización5,6,7,8. Múltiples estudios han demostrado que formación epicárdica deteriorada conduce a defectos de desarrollo en músculo cardiaco9,10, vasculatura11y conducción sistema12, haciendo hincapié en lo esencial contribución de epicardio a la formación del corazón.
Aunque el epicardio está presente como una capa inactiva en el corazón adulto, se llega a ser reactivado a isquemia13. Después de la lesión epicárdica reactivación recapitulan varios de los procesos describen para el desarrollo cardíaco, incluyendo proliferación y14de la EMT, aunque menos eficientemente. Curiosamente, aunque el mecanismo exacto no se entiende completamente, la contribución epicárdica a reparar se puede mejorar mediante tratamiento con, por ejemplo, timosina β415 o modificado ARNm del VEGF-A16, dando por resultado cardiaco mejoró función después de infarto de miocardio. El epicardio, por tanto, se considera una fuente interesante de celular para mejorar la reparación endógena del corazón lesionado.
Mecanismos del desarrollo cardíaco a menudo son recapitulados durante la lesión, aunque de manera menos eficiente. En busca de activadores epicárdicos, es de suma importancia que podemos determinar y comparar la capacidad total de epicardio fetal y adulto. Por otra parte, desde un punto de vista terapéutico, es importante que, además de los experimentos con animales, ampliamos conocimientos sobre la respuesta del epicardio humana. Aquí, describimos un método para aislar y adulto y fetales epicárdicas derivado las células humanas (EPDCs) en una morfología epitelial-célula-como de la cultura y para inducir la EMT. Con este modelo, nuestro objetivo es explorar y comparar el comportamiento adulto y fetal la célula epicárdico.
La principal ventaja de este protocolo es el uso de material epicárdico humano, que no ha sido bien estudiado. Lo importante, el protocolo de cultivo aislamiento y celular descrito proporciona un método uniforme para derivar ambos EPDCs adoquín fetal y adulto, lo que permite una comparación directa entre estas fuentes de dos células. Además, desde el epicardio está aislado basado en su ubicación, se asegura que las células son realmente epicardially derivada17.
Mientras que previamente se han establecido métodos de aislamiento de DAPC humanos, estos en su mayoría dependen de protocolos de derivación donde se platean pedazos de tejido cardiaco o epicárdico en una célula cultura plato18,19. Este enfoque lo selecciona específicamente por células que pierden parcialmente su fenotipo epitelial para migrar, y que son más propensos a experimentar la EMT espontánea. En el protocolo actual, el epicardio se transforma primero en una solución única célula que permite el EPDCs aislados mantener su estado epitelial. Este método por lo tanto proporciona un modelo sólido en vitro para estudiar la EMT epicárdico.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal sódica</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 1:250 de páncreas bovino</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 24 pocillos</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000y micro; L Puntas de pipeta filtradas</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td>pipeta</tr><tr><td>de 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 5 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td> O tubos Eppendorf <td>caseros y esterilizados</td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml Jeringa</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td> 10 mL Becton Dickinson Agujas 305959 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibre 19</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Agujas Calibre 21</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Tamices celulares EASYstrainer, 100 &micro; m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Antiactina monoclonal, &alpha;-Músculo liso</td><td>Sigma</td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios </td></tr><tr><td>Pipeta P1.000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipetas</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz invertida</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y fetal

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

El epicardio, un capa de células epiteliales que cubre el miocardio, tiene un papel fundamental durante el desarrollo cardíaco, así como en la respuesta de reparación del corazón después de lesión isquémica. Cuando se activa, las células epicárdicas se someten a un proceso conocido como epitelial de transición mesenquimal (EMT) para proporcionar a las células para regenerar miocardio. Además, el epicardio contribuye mediante la secreción de factores paracrinos esencial. Para apreciar el potencial regenerativo del epicardio, se requiere un modelo de célula humana. Aquí esbozamos un modelo de cultura de célula novela para derivar las células derivadas epicárdicas primarias (EPDCs) del tejido cardiaco adulto y fetal humano. Para aislar EPDCs, el epicardio es disecado desde el exterior de la pieza de corazón y transformar en una suspensión unicelular. A continuación, EPDCs son plateados y cultivadas en medio de la CDEP que contiene el inhibidor de la 5-quinasa ALK SB431542 mantener su fenotipo epitelial. EMT es inducida por la estimulación con TGFβ. Este método permite, por primera vez, el estudio del proceso de EMT epicárdico humano en un ambiente controlado y facilita el obtener una visión más clara en el secretoma de EPDCs que puede ayudar a la regeneración del corazón. Además, este enfoque uniforme permite la comparación directa de la conducta humana adulta y fetal epicárdico.

Aquí, describimos un protocolo sencillo para aislar EPDCs de tejido humano adulto y fetal cardiaco (figura 1). Este protocolo aprovecha la ubicación fácilmente accesible del epicardio en la parte exterior del corazón (figura 1A). La coloración de la aurícula del corazón después de disección demuestra que el WT1 + epicardio se retira mientras que la subyacente subepicárdico matriz extracelular y tejido miocárdico permanecen intact...

El epicardio desempeña un papel crucial en el desarrollo y la reparación del corazón células y factores de crecimiento para la pared miocardio. Aquí, describimos un método para las células epicárdicas primaria humanas cultura que permite el estudio y comparación de sus características de desarrollo y adultos.

El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar células derivadas del epicardio humano con el fin de estudiar el comportamiento de las células epicárdicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación cardíaca, como cómo se activa el epicardio durante el desarrollo y la enfermedad cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a muestras de tejido cardíaco humano, lo que puede ayudar a la traducción de los resultados a un entorno clínico.Nuestro protocolo describe la investigación de la transición epitelial a mesenquimal de las células derivadas del epicardio. Sin embargo, también se puede utilizar para estudiar la proliferación o secreción de factores. Para comenzar, llene un plato de cultivo celular de 100 milímetros con PBS dentro del gabinete de flujo laminar.Coloque aproximadamente 200 microlitros de PBS en la tapa, luego agregue 5 mililitros de medio EPDC precalentado a un tubo de 15 mililitros. Coloque el tejido cardíaco, aislado de un corazón humano adulto, en el plato. Bajo un microscopio estereoscópico, use fórceps para extraer cuidadosamente la capa epicárdica.A continuación, recoge los trozos

the-isolation-culture-primary-epicardial-cells-derived-from-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este protocolo, w e identificado una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a la arritmia auricular provoca en ratones.

Aislar las células melanocitos como primarios del corazón alfombrillas

Cultivo celular primaria es una técnica útil para el análisis de poblaciones específicas de células, en particular a partir de embriones de ratones transgénicos en etapas de desarrollo específicas. En esto, los ventrículos embrionarias se disecan y se disociaron, y los granos de anticuerpos conjugados reconocen y se separan las células endoteliales para su posterior análisis.

Aislamiento de células endoteliales embrionarias ventriculares

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Aquí, describimos métodos para aislar células epicárdicas primarias de ratón mediante un ensayo de cultivo de excrecencia y evaluamos la migración funcional de células derivadas del epicardio (EPDC) utilizando un sistema de cultivo cardíaco ex vivo. Estos protocolos son adecuados para identificar moduladores genéticos y químicos de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la motilidad epicárdicos.

Consecuencia del epicardio y Ensayo de Cultivo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluación de la migración de células derivadas del epicardio

El epicardio es una fuente esencial de células progenitoras cardiovasculares multipotentes y factores paracrinos que son necesarios para el desarrollo y la regeneración cardiovascular. Describimos aquí un método para cultivar células epicárdicas embrionarias de ratón.

Cultivo in vitro de células a partir de epicárdicos del corazón de embriones de ratón

tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.

Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

El objetivo de este trabajo es desarrollar un método para aislar reproduciblemente los cardiomiocitos del corazón adulto y medir el contenido de ADN y la nucleación.

Aislamiento de cardiomiocitos de corazones fijos para inmunocitoquímica y análisis de ploide

Presentamos un protocolo para el aislamiento de células endoteliales endocardiales y coronarias de corazones de rata a través de la digestión secuencial del tejido en un tampón de digestión, la recolección celular de ciclos de centrífuga recurrentes y la purificación celular mediante microperlas CD31 anti-rata.

Aislamiento de células endoteliales endocardiales y coronarias de la pared libre ventricular del corazón de rata

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (&lt;50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Aprende a aislar y cultivar células epicárdicas derivadas de tejido cardíaco humano para estudiar su comportamiento en desarrollo y enfermedad. Este método permite investigar la transición epitelio-mesenquimal.

El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

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