Name: Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a evaluar el potencial de suero convaleciente de virus Zika para potenciar la infección por virus Dengue mediante citometría de flujo. Este protocolo simple y de alto rendimiento utiliza partículas virales reporteras.

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El proyecto descrito fue apoyado por fondos de la Universidad de servicios uniformados de Ciencias de la salud a JJM. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son los privados de los autores y no son ser interpretados como oficiales o refleja las opiniones del Departamento de defensa, la Universidad de servicios uniformados de Ciencias de la salud o cualquier otra agencia de los Estados Unidos Gobierno.
VGP realizó todos los experimentos y analiza los datos; JJM diseñado y supervisado el estudio; WGW y JJM escribieron el libro.

Las muestras de suero utilizadas para demostrar el protocolo descrito aquí se obtuvieron de macacos rhesus que fueron alojadas y atendidas según local, estatal y federales políticas en una asociación para la evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care Internacional (AAALAC)-acreditado centro. Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal y las muestras fueron adquiridas a través de un tejido de intercambio de protocolo.
1. día 1
Nota: Realice todos los pasos que se describen a continuación en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar estéril utilizado para cultivo de tejidos en un laboratorio BSL-2.
<ol><li>Las muestras de suero a temperatura de descongelar y transferir 100 μl de cada muestra de suero a un tubo estéril. Inactive por calor durante 30 minutos a 56° C en un baño de agua o un Termomezcladores temperatura ajustable. Hacer 10 veces diluciones seriadas de la muestra de suero que van de 1:1 para 1:1,000 con RPMI-10 frío (RPMI con 10% suero bovino fetal).</li>
	<li>Transferir 10 μl de la muestra de suero en serie diluido en cada pocillo de una placa de V-inferior de 96 pocillos estéril. Incluyen dos sistemas de control de pozos, RPMI-10 con RVPs sólo y sin muestra de suero y RPMI-10 sin RVPs y sin muestra de suero. Configurar cada muestra de suero y RPMI-10 controles en triplicado.</li>
	<li>Retire el Dengue-1, 2, 3 y 4 RVPs del congelador de-80 ° C y descongelar en baño de agua de 37 ° C. La transferencia de los RVPs descongelados inmediatamente en hielo. Obtener RVPs aproximadamente 170 μl de cada muestra de suero (10 μl de los RVPs x 3 pozos para cada dilución de suero (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) y 10 μl de los RVPs x 3 pozos para cada uno de los 10 de RPMI con RVP sólo control de pozos).</li>
	<li>Pipetear 10 μl de RVPs en cada pozo de la placa de 96 pocillos V-parte inferior que contiene la muestra de suero y el RPMI-10 con pocillos de control RVPs (no suero). No añadir pozos de RVPs RPMI-10 solamente (ninguna muestra de suero y no RVP). Mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo 5 – 10 veces. Añadir 10 μl de frío RPMI-10 en lugar de RVPs cada RPMI-10 frío sólo (ninguna muestra de suero y no RVP) de control de pozos.</li>
	<li>Transferir la placa de 96 pocillos fondo V a una incubadora e Incube la placa durante 1 hora a 37 ° C en presencia de 5% CO2. Mientras está incubando la placa de 96 pocillos fondo V, limpie la superficie de la bioseguridad con etanol al 70% y ejecute la UV luz durante 15 minutos.</li>
	<li>Retire un frasco de T75 completamente confluente de células K562 de la incubadora, mezclar las células bien utilizando una pipeta estéril 5 mL y transferir 5 mL de células a un tubo cónico de 15 mL estéril. Nota: Las células K562 son mantenidas en RPMI-10 y subcultivadas en 1 x 106/ml.</li>
	<li>Contar el número de las células mediante la eliminación de 10 células μl del tubo cónico de 15 mL estéril y mezclar con azul de tryphan de 10 μl. Contar las células usando un hemocitómetro para determinar el número total de células en el tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue el 15 mL cónico con células ~ 1.200 x g durante 10 minutos, decantar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI-10 caliente en una concentración de 80.000 células/30 μl de medios (2,66 x 106 células /mL).</li>
	<li>Retire la placa de 96 pocillos V-fondo de la incubadora (criterio 1.6), transferir 30 μl de las células K562 a cada pocillo de la placa de 96 pocillos fondo V y homogeneizar mediante pipeteo arriba y abajo 5 – 10 veces. Transferir la placa de 96 pocillos fondo V a una incubadora e Incube la placa durante 1 hora a 37 ° C en presencia de 5% CO2.</li>
	<li>Después de incubar durante 1 h, retire la placa de 96 pocillos fondo V de la incubadora y centrifugar a 1.200 ~ x g durante 5 minutos. Después de la centrifugación, decantar los medios de comunicación de los pozos girando la placa boca abajo en un recipiente que contiene 10% de lejía.</li>
	<li>Lavar las células en cada pozo a resuspender en 125 μl de RPMI-10 caliente, mezclar bien con una pipeta y centrifugar la placa a ~ 1.200 x g durante 5 min, decantar los medios girando la placa boca abajo en un recipiente que contiene 10% de lejía. Repetir este lavado dos veces.</li>
	<li>Después del lavado, añada 100 μl de RPMI-10 para cada uno, de la mezcla hacia arriba y hacia abajo con la pipeta caliente e Incube la placa durante 48 h a 37 ° C en presencia de 5% CO2.</li>
</ol>2. día 3
<ol><li>Retire la placa de V-inferior de 96 pocillos con 100 μl de células y los medios de comunicación/de la incubadora y a un gabinete de bioseguridad. Utilizando una pipeta multicanal, mezclar el contenido de cada uno así y transferencia de las células y los medios de comunicación a un bien U-fondo 96 platean o a previamente etiquetado como tubos de polipropileno de 5 mL.</li>
	<li>Lave cada pocillo de la placa V-inferior de 96 pocillos con 100 μl de 1% paraformaldehido (PFA) en 1 x fosfato tampón salino (PBS) y traslado a los respectivos pozos en la 96 bien U inferior placa o etiqueta 5 mL tubos de polipropileno en el paso 2.1 para rendir un final concentración de 0.5% PFA/pozo o tubo. Mezclar bien con una pipeta multicanal, cubra la placa con papel de aluminio y lo deje reposar en la incubadora durante 30 minutos para fijar las células.</li>
	<li>Preparar el citómetro de flujo (véase Tabla de materiales por ejemplo) mediante la ejecución de las células K562 sin mancha para calibrar el lado y dispersión hacia adelante junto con los valores de fluorescencia. El canal de fluorescencia sólo requerido es FL1, como GFP es el único fluorescencia emitida por las células. Adquirir 30, 000-50.000 células de cada muestra. Nota: Cualquier citómetro de flujo capaz de leer una sola de la fluorescencia puede utilizarse para la adquisición de los datos, como las células infectadas con RVPs sólo emite fluorescencia verde debido a la presencia de GFP, y ningún otro canal de fluorescencia son necesarios.</li>
</ol>3. Análisis de los datos
<ol><li>
Analizar los datos adquiridos en el citómetro de flujo utilizando cualquier software de análisis de citometría de flujo (véase tabla de materiales).
	<ol>
<li>Conjunto de la primera puerta basado en FSC-A (avance dispersión – área) vs FSC-H (forward scatter – altura) son las células y excluir a auto-fluorescente dobletes de análisis12. Entonces, la puerta cerrada camiseta células basadas en SSC-A (dispersión de lado – zona) vs FSC-A excluir cualquier escombro autofluorescent.</li>
		<li>Analizar vs SSC-A células cerradas FSC-A para la expresión de GFP en base a vs SSC-A GFP-A. Determinar el porcentaje de células GFP + para cada dilución de las muestras de suero y control estableciendo una puerta alrededor de las células GFP +.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar el porcentaje de células GFP + para cada dilución de la muestra de suero y pocillos de control dividiendo el porcentaje total de células GFP + en los pozos por triplicado 3.</li>
	<li>Calcular doble-mejora de la infección al dividir el porcentaje medio de células GFP + en las muestras de suero para cada dilución dividido por el porcentaje medio de células GFP + en el RPMI-10 con pocillos de control RVPs (ninguna muestra de suero).</li>
	<li>Ver pliegue-mejora (eje y) versus dilución (eje x) y realizar análisis estadístico con ANOVA seguido de post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Flaviviruses DENV como ZIKV compartir evidencia significativa de homología en ambos sus proteínas estructurales y no estructurales que generan anticuerpos que cruz-reaccionan con otros13,14. Estas respuestas de anticuerpos cruz-reactivos se han demostrado para mejorar de la infección tanto en vivo como en vitro con un serotipo heterólogo u otros relacionados con flaviviruses1,2. El poten...

Mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección es un proceso por el que las respuestas de anticuerpos cruz-reactivos parcialmente inducidas por un serotipo de virus mejora la absorción de otro serotipo del virus, llevando a mayor replicación viral y viremia. ADE ha sido ampliamente documentado en las infecciones del virus (DENV) Dengue donde predominan cuatro serotipos principales. En un subgrupo de pacientes, ADE se asocia con la fiebre hemorrágica de Dengue (FHD). Recientemente hemos demostrado que la infección del virus (ZIKV) Zika inducido significativamente altos niveles de respuestas de anticuerpos cruz-reactivos de DENV que causaron ADE de DENV en vitro y probablemente contribuyeron a la mejora de la viremia DENV en vivo1 , 2. ensayos de mejora dependiente de anticuerpo son una herramienta valiosa para evaluar la capacidad de anticuerpos para mejorar la infección secundaria con virus relacionados y proporcionar información valiosa en la patogenesia de infecciones por flavivirus e informar a la desarrollo de vacunas.
El descrito aquí emplea DENV RVPs junto con las células K562 que son normalmente inadmisibles a la infección. RVPs son estructuralmente intacto replicación incompetente DENV partículas virales que codifican un replicón de sub-genomic proteína verde fluorescente (GFP) que se expresa después de una sola ronda de replicación3. Así, las células que se infectan con RVPs fluorescencia verde y pueden ser fácilmente detectadas mediante citometría de flujo o microscopia. Los RVPs utilizados en este ensayo se obtuvieron de fuentes comerciales. Sin embargo, se pueden generar contra otros virus y utilizado en el ensayo se describe en este manuscrito. Mientras tanto, las células K562 son una línea de células de leucemia FcγIII-receptor-expresión que se unen a la región Fc de los anticuerpos y se infectan en la presencia de neutralizar las concentraciones de anticuerpo4,5.
ADE los ensayos se han utilizado en estudios que investigaron los factores de riesgo para dengue grave y delinear los mecanismos de en vitro ADE6,7,8. El ensayo de ADE descrito aquí puede ser rápidamente y fácilmente usado para determinar la capacidad del suero para mejorar en vitro infección usando RVPs y flujo cytometry, en comparación con otros ensayos utilizados en la actualidad, que requieren ya sea la determinación de la formación de placa unidades (pfu) en células Vero o tinción de anticuerpos de la infección las células6,7,8,9,10,11, los cuales son desperdiciadores de tiempo y mano de obra intensivo.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Molecular integral</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 células</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS en RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>MP biomédicos</td><td>1670049</td><td>100 UI Pen/mL, 100 ug Estreptococo/mL en RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M en RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100&times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x en RPMI-10</td></tr><tr><td>Piruvato de Sodio</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM en RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific MT25005CI</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas inferiores en V estériles</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polipropileno 5 ml Tubos FACS VWR</td><td></td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Placas inferiores en U no estériles</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>Una alternativa de alto rendimiento a los tubos FACS 5</td></tr><tr><td>ml, estériles, pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL puntas</td> <td>de pipeta estérilesPuntas</td> de pipeta estériles Denville <td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL</td><td>Pipeta multicanal Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL Pipeta</td> multicanal <td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadehído</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>Una alternativa a un baño de agua para la inactivación del calor</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Lejía líquida</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Software de análisis por citometría de flujo</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo BD LSR II</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

una citometría de flujo simple basado en análisis para determinar in vitro anticuerpo dependiente del realce del virus del dengue usando suero convaleciente zika virus

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Mejora dependiente de anticuerpos de la infección se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la patogenia viral de Dengue. Los análisis tradicionales que miden la capacidad de los anticuerpos o del suero para mejorar la infección en líneas celulares han confiado en usar salida viral en los medios de comunicación seguido por ensayos de placa para cuantificar la infección. Más recientemente, estos ensayos han examinado la infección del Dengue virus (DENV) en las líneas celulares usando los anticuerpos de fluorescencia marcados. Ambos estos métodos tienen limitaciones que restringen el uso generalizado de estas técnicas. Aquí, describimos un análisis simple en vitro con Dengue virus reportero partículas virales (RVPs) que expresan la proteína verde fluorescente y las células K562 a examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por DENV usando el suero que se obtiene de macaco de la India macacos 16 semanas después de la infección con el virus Zika (ZIKV). Esta técnica es confiable, implica la mínima manipulación de las células, no implica el uso de virus competentes de replicación directo y puede realizarse en un formato de alto rendimiento para obtener una lectura cuantitativa mediante citometría de flujo. Además, este análisis pueden ser adaptado fácilmente para examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de otras infecciones de flavivirus como el virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de la encefalitis equina (JEEV), virus del Nilo Occidental (VNO) etc. donde RVPs están disponibles. La facilidad de establecer el ensayo, análisis de los datos y la interpretación de los resultados hacen altamente susceptibles a más valores de laboratorio.

Sera de 4 rhesus macacos fueron recogidos 16 semanas después de la infección con ZIKV y probaron por su potencial para mejorar el DENV-1, 2, 3 y 4 la infección en células K562. Los animales tenían viremia pico de ~ 1 x 105 copias de ZIKV ARN/mL de plasma por día 3 después de la infección que se negó a niveles por debajo del límite de detección por 7 días después de la infección. No hay viremia se detectó en el plasma en la infección después de 16 semanas. Luego, se realizó el e...

Se describe un protocolo simple y fácil para medir la mejora dependiente de anticuerpos de la infección por Zika virus suero convaleciente con partículas virales de Dengue virus reportero.

Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la capacidad de los sueros recolectados de macacos rhesus infectados con el virus del Zika para mediar el aumento dependiente de anticuerpos de la infección por el virus del dengue in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con el aumento dependiente de anticuerpos de la infección por dengue causada por anticuerpos reactivos cruzados inducidos por el virus del Zika. La principal ventaja de esta técnica es que es de alto troper, sencilla y fácil de realizar.William Valiant, un estudiante graduado de enfermedades infecciosas emergentes, demostrará este procedimiento en mi laboratorio. Comience descongelando las muestras de suero a temperatura ambiente. Cuando se descongele, transfiera 100 microlitros de cada muestra de suero a un tubo estéril y caliente y actívelo durante 30 minutos a 56 grados centígrados.A continuación, realice diluciones en serie de 10 veces de la muestra de suero que van desde uno a uno hasta uno a mil en RPMI 10 frío. A continuación, transfiera 10 microlitros de cada muestra de suero diluido a los pocillos de una placa estéril de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, descongele una, dos, tres y cuatro partículas virales proportadoras del dengue en un baño de agua a 37 grados centígrados, asegurando un volumen de aproximadamente 170 microlitros de cada RVP por muestra de suero.Una vez descongelados, transfiera inmediatamente los tubos de RVP a hielo. A continuación, pipetee 10 microlitros de RVP en los pocillos que contienen diluciones de muestras de suero en los pocillos de control sin suero. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a diez veces.Transfiera la placa inferior en V de 96 pocillos a una incubadora e incube durante una hora a 37 grados centígrados, en presencia de 5% de dióxido de carbono. Mientras se incuba la placa inferior en V de 96 pocillos, limpie la superficie de la cabina de bioseguridad con etanol al 70% y haga funcionar la luz ultravioleta durante 15 minutos. A continuación, retire de la incubadora un matraz T-75 completamente confluente de células K562.Mezcle bien las células con una pipeta estéril de cinco milímetros y transfiera cinco mililitros a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. A continuación, retire 10 microlitros de células del tubo, mezcle con 10 microlitros de azul de tripano y cárguelo en un hemocitómetro. Cuente las celdas y calcule el número total de celdas.Después de centrifugar las células a 12 centenares veces G durante 10 minutos, decantar el sobrenadante y volver a suspender las células en RPMI 10 caliente a una concentración de 80 mil células por 30 microlitros de medio. Después de retirar la placa inferior en V de 96 pocillos de la incubadora, transfiera 30 microlitros de células K562 a cada pared de la placa en V de 96 pocillos. Y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a diez veces.Luego regrese la placa a la incubadora durante una hora. Después de la incubación, centrifugar la placa a 12 centurias veces G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, decantar el medio de los pocillos girando la placa boca abajo en un recipiente que contenga un 10% de lejía.A continuación, lave las celdas de cada pared volviéndolas a suspender en 125 microlitros de RPMI 10 caliente y centrifugando como antes. Después de decantar el último lavado, agregue 100 microlitros de RPMI 10 tibio a cada pocillo. Mezclar hacia arriba y hacia abajo con la pipeta e incubar la placa durante 48 horas a 37 grados centígrados en presencia de un 5% de dióxido de carbono.Dos días después, retire la placa de la incubadora y transfiérala a un gabinete de bioseguridad. Con una pipeta multicanal, mezcle el contenido de cada pocillo y transfiéralo a una placa de fondo en U de 96 pocillos. Enjuague cada pocillo de la placa inferior en V de 96 pocillos con 100 microlitros de paraformaldehído al 1% y PBS y transfiera las celdas restantes y el PBS a los pocillos respectivos en la placa inferior en U de 96 pocillos.Mezcle bien con una pipeta multicanal. Cubra la placa con papel de aluminio y déjela reposar en la incubadora durante 30 minutos para fijar las celdas. Prepare el citómetro de flujo ejecutando celdas K562 sin teñir para calibrar los ajustes de dispersión lateral y frontal utilizando el canal etil-ona para la fluorescencia GFP.Luego adquiera de 30 mil a 50 mil células de cada muestra. Con el software de análisis de citometría de flujo, establezca la primera puerta en función del área de dispersión directa frente a la altura de dispersión directa para incluir células individuales y excluir los dublets autofluorescentes del análisis. Calcule el porcentaje promedio de células positivas para GFP para cada condición y luego calcule el aumento del pliegue de la infección para cada dilución sérica.Mejora del pliegue del gráfico en el eje Y frente a la dilución en el eje X y realice análisis estadísticos utilizando ANOVA seguido de la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Aquí se muestran los datos de un animal representativo que utiliza partículas del virus del dengue uno. El porcentaje de células GFP positivas para la muestra de control sin suero fue del 0,253%La muestra de suero sin diluir fue del 2,58%GFP positiva.La proporción de células positivas para GFP alcanzó un máximo del 12,8% en la dilución sérica de uno a diez, siguiendo al 0,735% en una dilución de uno a cien y al 0,022% en una dilución de uno a mil. Se examinó el realce dependiente de anticuerpos de la infección por dengue para los cuatro tipos de sueros del virus del dengue. Los datos muestran que el suero recolectado 16 semanas después de la infección mejoró significativamente la infección de las células K562 por todos los tipos de sueros del virus del dengue en una dilución de uno a diez.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 48 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe adquirir los datos dentro de una o dos horas después de completar el paso de fijación final de 30 minutos. No olvide que trabajar con suero infectado puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el EPP y las prácticas de nivel BSL2 mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Este video muestra un ensayo para medir el aumento dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por el virus del dengue utilizando suero de convaleciente del virus del Zika. El ensayo utiliza partículas virales reporteras del dengue (RVP) que codifican una proteína verde fluorescente. Los anticuerpos séricos contra el virus del Zika reaccionan de forma cruzada con los RVP para formar un complejo. Los anticuerpos unidos mejoran la absorción de RVP por parte de las células que expresan el...

Un ensayo in vitro para examinar el aumento dependiente de anticuerpos de la infección viral

El video muestra un ensayo in vitro para la detección de interferones con actividad antiviral contra el virus del Zika, un patógeno humano. Dentro de la célula huésped, el virus del Zika se multiplica al internalizarse, infectando a las células vecinas y creando zonas distintas o placas virales. El interferón tipo I, que actúa como agente antiviral, dificulta la multiplicación del virus, evitando así la formación de placas virales en la monocapa de la célula huésped.

Un ensayo in vitro para la detección de interferones como inhibidores potentes del crecimiento del virus del Zika

El virus del Zika (ZIKV), un patógeno emergente, está relacionado con anomalías del desarrollo fetal y microcefalia. El establecimiento de un sistema eficaz de cultivo de células infecciosas es crucial para los estudios de replicación del ZIKV, así como para el desarrollo de vacunas y fármacos. En este estudio, se ilustran y discuten varios ensayos virológicos relacionados con el ZIKV.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Los virus o vesículas extracelulares fueron inmunocapturados con nanopartículas magnéticas de 15 nm acopladas a anticuerpos que reconocen antígenos de superficie. Los viriones o vesículas capturadas se marcaron con anticuerpos fluorescentes contra otros antígenos de superficie. Los complejos resultantes se separaron en un campo magnético alto y se analizaron con citómetros de flujo convencionales activados por fluorescencia.

Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1- / - modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

Se describe un método para evaluar el efecto de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección del virus Zika mediante el uso de suero humano, las células humanas primarias y cuantificación de la infección por reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real.

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).

Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

Aquí, demostramos el uso de la impedancia eléctrica basada en células (CEI) como un método muy fácil y directo para estudiar la infección y replicación del virus Zika en células humanas en tiempo real. Además, el ensayo CEI es útil para la evaluación de compuestos antivirales.

Plataforma de impedancia eléctrica basada en células para evaluar los inhibidores del virus del Zika en tiempo real

Aprende a evaluar el potencial de suero convaleciente de virus Zika para potenciar la infección por virus Dengue mediante citometría de flujo. Este protocolo simple y de alto rendimiento utiliza partículas virales reporteras.

Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus (Video) | JoVE Journal

Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

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