Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

El objetivo general de este procedimiento es determinar la capacidad de los sueros recolectados de macacos rhesus infectados con el virus del Zika para mediar el aumento dependiente de anticuerpos de la infección por el virus del dengue in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con el aumento dependiente de anticuerpos de la infección por dengue causada por anticuerpos reactivos cruzados inducidos por el virus del Zika. La principal ventaja de esta técnica es que es de alto troper, sencilla y fácil de realizar.

William Valiant, un estudiante graduado de enfermedades infecciosas emergentes, demostrará este procedimiento en mi laboratorio. Comience descongelando las muestras de suero a temperatura ambiente. Cuando se descongele, transfiera 100 microlitros de cada muestra de suero a un tubo estéril y caliente y actívelo durante 30 minutos a 56 grados centígrados.

A continuación, realice diluciones en serie de 10 veces de la muestra de suero que van desde uno a uno hasta uno a mil en RPMI 10 frío. A continuación, transfiera 10 microlitros de cada muestra de suero diluido a los pocillos de una placa estéril de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, descongele una, dos, tres y cuatro partículas virales proportadoras del dengue en un baño de agua a 37 grados centígrados, asegurando un volumen de aproximadamente 170 microlitros de cada RVP por muestra de suero.

Una vez descongelados, transfiera inmediatamente los tubos de RVP a hielo. A continuación, pipetee 10 microlitros de RVP en los pocillos que contienen diluciones de muestras de suero en los pocillos de control sin suero. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a diez veces.

Transfiera la placa inferior en V de 96 pocillos a una incubadora e incube durante una hora a 37 grados centígrados, en presencia de 5% de dióxido de carbono. Mientras se incuba la placa inferior en V de 96 pocillos, limpie la superficie de la cabina de bioseguridad con etanol al 70% y haga funcionar la luz ultravioleta durante 15 minutos. A continuación, retire de la incubadora un matraz T-75 completamente confluente de células K562.

Mezcle bien las células con una pipeta estéril de cinco milímetros y transfiera cinco mililitros a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. A continuación, retire 10 microlitros de células del tubo, mezcle con 10 microlitros de azul de tripano y cárguelo en un hemocitómetro. Cuente las celdas y calcule el número total de celdas.

Después de centrifugar las células a 12 centenares veces G durante 10 minutos, decantar el sobrenadante y volver a suspender las células en RPMI 10 caliente a una concentración de 80 mil células por 30 microlitros de medio. Después de retirar la placa inferior en V de 96 pocillos de la incubadora, transfiera 30 microlitros de células K562 a cada pared de la placa en V de 96 pocillos. Y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a diez veces.

Luego regrese la placa a la incubadora durante una hora. Después de la incubación, centrifugar la placa a 12 centurias veces G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, decantar el medio de los pocillos girando la placa boca abajo en un recipiente que contenga un 10% de lejía.

A continuación, lave las celdas de cada pared volviéndolas a suspender en 125 microlitros de RPMI 10 caliente y centrifugando como antes. Después de decantar el último lavado, agregue 100 microlitros de RPMI 10 tibio a cada pocillo. Mezclar hacia arriba y hacia abajo con la pipeta e incubar la placa durante 48 horas a 37 grados centígrados en presencia de un 5% de dióxido de carbono.

Dos días después, retire la placa de la incubadora y transfiérala a un gabinete de bioseguridad. Con una pipeta multicanal, mezcle el contenido de cada pocillo y transfiéralo a una placa de fondo en U de 96 pocillos. Enjuague cada pocillo de la placa inferior en V de 96 pocillos con 100 microlitros de paraformaldehído al 1% y PBS y transfiera las celdas restantes y el PBS a los pocillos respectivos en la placa inferior en U de 96 pocillos.

Mezcle bien con una pipeta multicanal. Cubra la placa con papel de aluminio y déjela reposar en la incubadora durante 30 minutos para fijar las celdas. Prepare el citómetro de flujo ejecutando celdas K562 sin teñir para calibrar los ajustes de dispersión lateral y frontal utilizando el canal etil-ona para la fluorescencia GFP.

Luego adquiera de 30 mil a 50 mil células de cada muestra. Con el software de análisis de citometría de flujo, establezca la primera puerta en función del área de dispersión directa frente a la altura de dispersión directa para incluir células individuales y excluir los dublets autofluorescentes del análisis. Calcule el porcentaje promedio de células positivas para GFP para cada condición y luego calcule el aumento del pliegue de la infección para cada dilución sérica.

Mejora del pliegue del gráfico en el eje Y frente a la dilución en el eje X y realice análisis estadísticos utilizando ANOVA seguido de la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Aquí se muestran los datos de un animal representativo que utiliza partículas del virus del dengue uno. El porcentaje de células GFP positivas para la muestra de control sin suero fue del 0,253%La muestra de suero sin diluir fue del 2,58%GFP positiva.

La proporción de células positivas para GFP alcanzó un máximo del 12,8% en la dilución sérica de uno a diez, siguiendo al 0,735% en una dilución de uno a cien y al 0,022% en una dilución de uno a mil. Se examinó el realce dependiente de anticuerpos de la infección por dengue para los cuatro tipos de sueros del virus del dengue. Los datos muestran que el suero recolectado 16 semanas después de la infección mejoró significativamente la infección de las células K562 por todos los tipos de sueros del virus del dengue en una dilución de uno a diez.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 48 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe adquirir los datos dentro de una o dos horas después de completar el paso de fijación final de 30 minutos. No olvide que trabajar con suero infectado puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el EPP y las prácticas de nivel BSL2 mientras se realiza este procedimiento.