Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

Este video muestra nuestros métodos para el cribado de siRNA de alto rendimiento en un modelo de células epiteliales corneales de lesión tóxica. Este trabajo es importante, porque el cribado de siRNA de alto rendimiento es un método rentable y eficiente en el tiempo para dilucidar las vías y los reguladores de la respuesta celular a los tóxicos. Este trabajo puede ayudar a comprender mejor cómo responde la córnea a las agresiones tóxicas.

Prepare una suspensión de células epiteliales de la córnea en un medio precalentado que contenga 0,5 microgramos por mililitro de hidrocortisona en un frasco medio desechable. Gire la botella para suspender uniformemente las celdas y viértala en un depósito en el nido agitador orbital de un manipulador de líquidos automatizado. Mantenga la suspensión de la celda en una placa de calentamiento de 37 grados durante el proceso de recubrimiento de la celda.

Utilice un manipulador de líquidos automatizado para agregar celdas a las placas a una densidad de mil celdas por pocillo en 70 microlitros de medio por pocillo en una placa de 96 pocillos. Siembre un mínimo de 14 placas de 96 pocillos con células para cada placa de biblioteca de siRNA que se vaya a estudiar. Haga funcionar el agitador orbital a 100 ciclos por minuto constantemente durante el proceso de siembra y utilice una velocidad de pipeteo de 50 microlitros por segundo para todos los pasos.

Mezcle la suspensión de celdas con el manipulador de líquidos automatizado antes de sembrar la primera placa. Aspire 140 microlitros de la suspensión celular y dispense 70 microlitros en cada pocillo de dos placas de cultivo celular. Repita la mezcla y dispense hasta que todos los platos se hayan sembrado con células.

Vuelva a llenar el depósito de suspensión de celdas según sea necesario. Una vez que se hayan sembrado las placas, retírelas del manipulador de líquidos e incubelas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiéralos a una incubadora de cultivos celulares.

Evalúe la densidad celular de todas las placas a la mañana siguiente utilizando un sistema de imágenes automatizado, que se encuentra en la incubadora de cultivo celular. Excluir del estudio las placas que tengan pozos interiores que no sean entre 15 y 22 por ciento confluentes. Transfectar las células 24 horas después de la siembra con cuatro picomoles por pocillo de siRNA y 0,3 microlitros por pocillo de reactivo de transfección, de la siguiente manera.

Adquiera placas de biblioteca de siRNA del proveedor, configuradas para contener 80 objetivos de siRNA por placa con las columnas uno y doce vacías. Reconstituya la placa de biblioteca de siRNA con tampón de siRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta una concentración final de dos picomoles por microlitro para cada pocillo de siRNA. Realice todas las transfecciones utilizando un manipulador de líquidos automatizado y una velocidad de pipeteo de 25 microlitros por segundo para todos los pasos.

Utilice cajas de propinas preconfiguradas para dirigirse solo a los pozos que se transfectarán. Utilice la mitad superior de la placa de la biblioteca para transfectar un conjunto de seis placas replicadas, denominado Juego de placas superiores"Utilice la mitad inferior de la placa de la biblioteca para transfectar un conjunto diferente de seis placas de réplica, denominado Juego de placas inferiores"Juntas, las doce placas componen un conjunto completo de placas, y cada placa de celda contiene el mismo conjunto de controles. Transfecte los pocillos B2 a B6 de todas las placas con siRNA de grupo negativo después de que todos los conjuntos de placas superior e inferior se hayan transfectado con siRNA de biblioteca.

También transfectar los pocillos B2 a B6 de otras dos placas que no reciben siRNA de biblioteca con siRNA de grupo negativo. Estos servirán como controles no expuestos. Incubar todas las placas celulares en una incubadora de cultivos celulares durante cuatro horas después de que se hayan agregado las mezclas de transfección, y mezclar golpeando suavemente cada hora.

Utilice un manipulador de líquidos automatizado para lavar las placas dos veces con medio precalentado, diluido de uno a cinco en PBS y realimentado con 100 microlitros por medio precalentado de pocillo. Utilice una velocidad de pipeteo de 50 microlitros por segundo para todos los pasos. Utilice los pocillos C2 a C6 como controles no transfectados.

Mantenga los pocillos B7 a B11 y C7 a C11 sin transfectar, para ser utilizados como controles de drogas y vehículos para la exposición a tóxicos. 24 horas después de la transfección, use un manipulador de líquidos automatizado para volver a alimentar las placas. Utilice una velocidad de pipeteo de 50 microlitros por segundo para todos los pasos.

Aspire 100 microlitros de cada pozo y deséchelos en un depósito de desechos. Vuelva a alimentar cada pocillo con 100 microlitros por pocillo precalentado con H-Cort.medium. Vacíe el depósito de desechos según sea necesario.

Vuelva a llenar el depósito con medio según sea necesario. Dos días después de la transfección y dos horas antes de la exposición, prepare una solución de 62,5 micromolares de la Cardamonina de control positivo en H-Cort. medio y agregue a la fila B del depósito de dilución de 8 filas.

Prepare una solución al 06,25 por ciento de DMSO en H-Cort. meduim, y agréguela a la fila C del mismo depósito. El DMSO se utiliza como control del vehículo.

Utilice el manipulador de líquidos automatizado para eliminar 10 microlitros de medio de los pocillos B7 a B11 y C7 a C11 de cada placa de celda, y deséchelo en las filas G y H del depósito. Asegúrese de usar cajas de puntas preconfiguradas para abordar solo aquellos pozos que recibirán los controles positivos y del vehículo, y use una velocidad de pipeteo de 50 microlitros por segundo para todos los pasos. Transfiera 10 microlitros de los controles positivos y del vehículo a esos pocillos y mezcle tres veces.

Regrese estas placas de celdas a la incubadora. Repita estos pasos para todas las placas de celda adicionales. Realice todas las operaciones de exposición a productos químicos con una campana de extracción de gases químicos, con guantes dobles de nitrilo, una bata de laboratorio, protectores de mangas de polietileno desechables y gafas de seguridad.

Descontamine las puntas de pipeta y los depósitos que hayan entrado en contacto con el ácido fluorhídrico, y cualquier ácido fluorhídrico líquido con gluconato de calcio al 2,5 por ciento antes de su eliminación en el flujo de residuos peligrosos. Para cada placa de biblioteca bajo investigación, prepare una solución media de ácido fluorhídrico al 0.0036 por ciento agregando 288 microlitros de ácido fluorhídrico al uno por ciento a 80 mililitros de H-Cort precalentado. mediano en una botella de 150 mililitros.

Agite la botella e incube el ácido fluorhídrico diluido en una incubadora a 37 grados en la campana de gases químicos durante diez minutos. Agregue la solución de medio de ácido fluorhídrico a un depósito de reactivo en un calentador de placas. Realice la exposición con dos técnicos trabajando en tándem.

Pida al técnico de la derecha que retire el medio de cultivo celular de la placa celular con una pipeta de doce canales y, a continuación, pase la placa al técnico de la izquierda. Pídale al técnico de la izquierda que agregue 100 microlitros por pocillo de la solución de medio de ácido fluorhídrico. Repita este proceso para todas las placas celulares que vayan a estar expuestas al tóxico.

Además, repita este proceso para placas de control no expuestas, utilizando medio fresco en lugar de la solución de ácido fluorhídrico. Coloque las placas en una incubadora de campana de gases químicos durante 20 minutos y luego devuélvalas a la incubadora de cultivos celulares. Repita el paso de adición de control positivo como se mostró anteriormente, una vez que todas las placas hayan sido expuestas y devueltas a la incubadora de cultivos celulares.

Recoja el sobrenadante del cultivo celular y evalúe la viabilidad celular mediante un ensayo MTT 24 horas después de la exposición. Prepare una solución de sustrato de MTT de 0,5 miligramos por mililitro en PBS que contenga 10 gramos por litro de glucosa y caliéntela a 37 grados. Agregue la solución de sustrato MTT a un depósito en un manipulador de líquidos automatizado.

Utilice una velocidad de pipeteo de 50 microlitros por segundo para todos los pasos. Preconfigure las cajas de puntas para abordar solo los pozos que se van a analizar. Utilice el manipulador de líquidos automatizado para aspirar 95 microlitros de medio de los 60 pocillos internos de la placa de celdas y deposite 42,5 microlitros en cada una de las dos placas de almacenamiento de 384 pocillos.

Agregue inmediatamente 100 microlitros por pocillo de la solución de sustrato MTT a las placas celulares e incube a 37 grados en una incubadora de cultivo celular durante una hora. Selle las placas de almacenamiento de 384 pocillos y guárdelas a menos 80 para su posterior análisis. Repita este proceso para todos los juegos de placas superior e inferior y los controles no expuestos asociados.

Rellene el depósito de sustrato MTT según sea necesario. Reutilice las puntas entre réplicas si lo desea, pero lávelas cuando agregue una solución de sustrato MTT y cuando cambie entre juegos de placas. Después de la incubación de una hora, use el manipulador de líquidos automatizado para eliminar la solución de sustrato MTT de los 60 pocillos internos de cada placa de cultivo celular y reemplácela con 100 microlitros por pocillo de DMSO.

Utilice una velocidad de pipeteo de 50 microlitros por segundo para todos los pasos y preconfigure las cajas de puntas para abordar solo los pocillos que se van a analizar. Vacíe el depósito de residuos y vuelva a llenar el depósito de DMSO según sea necesario. Agite los platos en una coctelera durante tres minutos.

Mida la absorbancia a 570 y 690 nanómetros, utilizando un espectrofotómetro de placas. Reste la absorbancia de fondo a 690 nanómetros de la absorbancia a 570 nanómetros y promedie los valores de cada grupo de control en la placa no expuesta. Calcule el porcentaje de viabilidad dividiendo los valores de absorbancia para cada objetivo por el valor promedio de absorbancia de los controles no expuestos.

Utilice el promedio del grupo negativo no expuesto para calcular el porcentaje de viabilidad de la celda para todos los objetivos. Mida la concentración de IL-8 en los sobrenadantes de cultivos celulares utilizando un ensayo basado en perlas sin lavado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cree un diseño de placa de ensayo para acomodar muestras y estándares.

Retire las placas de almacenamiento de 384 pocillos del congelador de menos 80 y descongele a temperatura ambiente. Centrifugar brevemente las placas para recoger la muestra en el fondo de los pocillos. Agregue las perlas aceptoras anti-IL-8 y el anticuerpo biotinilado a una placa de almacenamiento negra de 384 pocillos.

Agregue la mezcla de perlas y anticuerpos a los pocillos designados para su uso para muestras y curva estándar, de acuerdo con la disposición de la placa de ensayo. Reconstituya el patrón en un medio que contenga cloruro de sodio de 354 micromolares. Realice diluciones en serie dobles de la curva estándar y agréguelas por triplicado a una placa de almacenamiento negra diferente de 384 pocillos.

Utilice un manipulador de líquidos automatizado para realizar el ensayo. Utilice cajas de puntas preconfiguradas para direccionar los pocillos de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo. Utilice una velocidad de pipeteo de 50 microlitros por segundo para todos los pasos.

Transfiera 8 microlitros de la mezcla de perlas aceptoras y anticuerpos a placas de ensayo blancas de 384 pocillos poco profundas. Agregue la mezcla de perlas y anticuerpos a los pocillos designados para su uso para muestras y la curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo. A continuación, transfiera la curva estándar a los pocillos apropiados en las placas de ensayo de pozos poco profundos.

A continuación, prepare una solución de cloruro de sodio 3,54 molar en un depósito poco profundo. Ajuste la concentración de sal de las muestras para que coincida con la de la curva estándar transfiriendo 4,5 microlitros de la solución de cloruro de sodio a las muestras en las placas negras de almacenamiento de 384 pocillos. Mezcle las muestras tres veces usando un volumen de mezcla de 30 microlitros y luego transfiera dos microlitros de las muestras a las placas de ensayo blancas y poco profundas de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.

Incubar durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Agregue cuentas secundarias a una placa de almacenamiento negra de 384 pocillos. Agregue las perlas a los pocillos designados para su uso para muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.

Transfiera 10 microlitros de las perlas secundarias a los pocillos de la placa de ensayo blanca de 384 pocillos poco profundos que recibirán una curva estándar o muestras de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo. Lave las puntas entre cada plato. Incubar durante otra hora en la oscuridad a temperatura ambiente.

Selle las placas de ensayo con sellos de placa transparentes y escanee con un lector de placas compatible con el ensayo basado en perlas. Utilice una distancia de 0,2 milímetros entre la placa y el detector, un tiempo de excitación de 180 milisegundos para el escaneo y un tiempo de medición de 550 milisegundos. Importe los datos brutos de los ensayos de IL-8 a una hoja de cálculo.

Utilice el ajuste de curva automatizado para la curva estándar de los ensayos de IL-8 y, a continuación, convierta los datos brutos a picogramos por mililitro para cada muestra. Calcule el promedio de las seis réplicas para cada destino. A continuación, calcule los valores de SSMD y el cambio de pliegue en relación con los controles negativos expuestos.

Muestre los datos en un gráfico de linterna doble, que muestra el cambio de pliegue a lo largo del eje x y SSMD a lo largo del eje y, para cada objetivo. En conclusión, hemos desarrollado métodos y condiciones de cultivo adecuados para el estudio de cribado de alto rendimiento de la lesión ocular por tóxicos. Hemos demostrado la utilidad de estos métodos completando el cribado primario de una biblioteca de siRNA en un modelo de lesión por ácido fluorhídrico.

Los conjuntos de datos genómicos de alto rendimiento pueden contribuir en gran medida a la comprensión del papel que desempeñan genes específicos en lesiones o enfermedades, lo que puede ayudar a enfocar de manera más eficiente los estudios de seguimiento in vitro o in vivo.