Name: Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Aprende el screening de siRNA de alto rendimiento para estudiar lesiones tóxicas en células epiteliales corneales usando fluoruro de hidrógeno y cloropicrina. Este método acelera la investigación toxicológica ocular.

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Esta investigación fue apoyada por el nacional institutos de salud contrarrestar Programa Interinstitucional Convenio # AOD13015-001. Nos gustaría agradecer a Stephanie Froberg y Peter Hurst por sus esfuerzos y conocimientos en producción de vídeo.

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Los autores no tienen nada que revelar.
Descargo de responsabilidad: las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan la política oficial del Departamento del ejército, Departamento de la defensa o el gobierno de Estados Unidos. Esta investigación fue apoyada por un convenio interinstitucional entre NIH/NIAID y el USAMRICD y en parte por una cita para el programa de participación de investigación postgrado en los Estados Unidos Ejército médico investigación Instituto de defensa química administrada por el roble Instituto de Ridge para la ciencia y la educación a través de un acuerdo interagencial entre el Departamento de energía de Estados Unidos y USAMRMC.

Adjunto describimos nuestros métodos y resultados en el desarrollo de una célula epitelial de la córnea de alto rendimiento modelo para el estudio de lesiones en HF y CP de detección. También se presentan los resultados de la pantalla de siRNA primario para lesiones de HF. Hubo muchos desafíos para el desarrollo de modelos HTS para el estudio de las lesiones TIC. Métodos que podríamos encontrar en la literatura relacionada con el estudio de HF, HFA o CP en modelos de cultivo celular fueron de poca ayuda. Mayoría en v...

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Desafortunadamente, tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos sólo son generalmente apoyo no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. La estrategia actual de tratamiento es inespecífica e incluye principalmente los tratamientos terapéuticos tópicos tales como lubricantes, antibióticos, y ciclopléjicos seguida de antiinflamatorios (por ejemplo, esteroides) una vez la córnea ha re-epithelialized1 ,2. A pesar del mejor tratamiento terapéutico opciones actuales disponibles, pronóstico a largo plazo es generalmente pobre debido a la opacificación corneal progresiva y neovascularización2,3.
Modelos animales se han utilizado tradicionalmente para investigar la toxicidad química y entender los mecanismos de lesión. Sin embargo, los estudios en animales son lentos y caros. También hay esfuerzos para reducir los ensayos con animales. Por ejemplo, la legislación REACH (CE 1907/2006) en la Unión Europea tiene disposiciones destinadas a reducir los ensayos con animales. Las disposiciones incluyen un requisito que las empresas comparten datos con el fin de evitar pruebas animales y obtener la aprobación de la Agencia Europea de sustancias químicas antes de realizar pruebas propuestas en animales. Bajo las disposiciones de REACH, la experimentación con animales deben ser un último recurso. También es el Reglamento Europeo de cosméticos (CE 1223/2009) que eliminando la prueba de cosméticos en animales. Cuando se llevan a cabo estudios en animales, son guiados por los principios de las 3Rs (refinamiento, reducción y sustitución), que proporcionan un marco para la investigación animal más humano, reduciendo el número de animales utilizados y uso de alternativas sin animales siempre que sea posible. Por estas razones, el campo de la toxicología ha intentado adoptar en vitro ensayos que permiten comprender mejor los mecanismos moleculares de toxicidad y pueden hacerse en el más alto rendimiento4. Se trata de un enfoque funcional Toxicología donde sustancias tóxicas se definen por su función y no únicamente por su química. Dado un paso más, funcional toxicogenómica busca entender el rol que juegan de genes específicos en los efectos de sustancias tóxicas5. Con la aplicación de la tecnología de siRNA, pantallas para investigar funciones de los genes en las respuestas moleculares y celulares a sustancias tóxicas pueden realizarse en el alto rendimiento. siRNA son doble trenzado RNA moléculas de 19-25 nucleotides largos que, aprovechando el post transcripcional gen silenciamiento vía presente en todas las células mamíferas6. Sintéticamente estos están fabricados y diseñados para un gen específico de destino. Cuando se introduce en una célula, el siRNA se procesa y se carga una sola hebra, la hebra guía, en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). El siRNA dirige el RISC a una región complementaria de una molécula de mRNA, y el RISC degrada el ARNm. Esto resulta en la reducción de la expresión del gen específico. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. Este enfoque se ha utilizado para entender más los mecanismos de la susceptibilidad de la ricina y la inducción de AHR-dependiente de CYP1A17,8.
La lista de evaluación de riesgo de terrorismo químico (CTRA) y la lista de productos químicos industriales tóxicos (TIC) ha detallada seleccionadas productos químicos por su toxicidad y potencial para ser lanzado durante un terrorista, guerra o accidente de trabajo evento9. Estamos solicitando un siRNA alto rendimiento proyección enfoque de toxicogenomic (HTS) para el estudio de sustancias tóxicas de Ctra lista, que han sido identificados en riesgo alto de uso en un incidente terrorista. La toxicología tradicional intenta comprender los efectos adversos que tienen sustancias químicas sobre organismos vivos; sin embargo, tenemos un deseo de comprender los mecanismos de la lesión con el fin de informar el desarrollo de terapias y enfoques terapéuticos y posiblemente, para descubrir las moléculas que pueden ser objeto de desarrollo terapéutico. Este esfuerzo de alguna manera puede considerarse análoga a la utilización de proyección de alto rendimiento siRNA y análisis celular basado en el descubrimiento de drogas proceso10. Una diferencia importante es que el descubrimiento de medicamentos normalmente busca un destino singular para descubrimiento terapéutico Considerando que nuestro enfoque es un poco improbable que exista un objetivo singular de alto valor terapéutico para el tratamiento de la exposición de sustancias tóxicas. Esperamos que cualquier paradigma de tratamiento eficaz para la exposición de sustancias tóxicas requeriría un enfoque multifacético para alcanzar alto valor terapéutico, y datos de toxicogenomic vital pueden informar a un paradigma de tratamiento eficaz.
Automatización de mesa aporta metodología de alto rendimiento a laboratorios fuera de la industria farmacéutica o biotecnológica. Los estudios en vitro en nuestro Instituto han sido históricamente los análisis tradicionales que son de bajo rendimiento11,12,13. En los últimos años, nuestro laboratorio ha transición al uso de la robótica de sobremesa para realizar proyección de siRNA de alto rendimiento. Adjunto, presentamos el refinamiento de modelos celulares ocular y el desarrollo de in vitro métodos de exposición para el fluoruro de hidrógeno (HF) y la cloropicrina (CP) adecuado para el cribado de alto rendimiento siRNA. Nuestro objetivo es identificar moléculas que regulan el daño celular en respuesta a estas sustancias tóxicas. Los objetivos de la biblioteca de siRNA que se seleccionaron son receptores acoplados a proteína G, proteína quinasas, proteasas, fosfatasas, canales iónicos y otros objetivos potencialmente druggable. HF y CP fueron seleccionados para estudio por agentes de lista CTRA ToxNet informes de accidentes de trabajo de referencias cruzadas para encontrar a los que presentan el mayor riesgo de lesión ocular por medio de vapor exposición9,14. CP (fórmula química Cl3CNO2, número CAS 76-06-2) fue utilizado originalmente como un gas lacrimógeno en WWI15. Actualmente se utiliza como un fumigante agrícola y funciones como un nematicida, fungicida e insecticida16. Fluoruro de hidrógeno (HF) se utiliza en procesos incluyendo la alquilación en refinerías de petróleo y la fluoración electroquímica de compuestos orgánicos17. HF (fórmula química HF, número CAS 62778-11-4) es un gas pero en su forma acuosa es el ácido fluorhídrico (HFA, CAS número 7664-39-3). Por lo tanto, elegimos utilizar HFA en nuestra celda en modelos de exposición. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y el marcador inflamatorio IL-8 fueron seleccionados como puntos finales porque los objetivos que están implicados en la lesión celular deben reflejarse en la muerte celular y la respuesta inflamatoria. En concreto, si un objetivo debían jugar un papel protector en la exposición de sustancias tóxicas, muerte celular o a la producción de citoquinas inflamatorias debería aumentar cuando se inhibe la expresión de destino por siRNA. Lo contrario sería cierto para blancos que juegan un papel negativo. Asimismo, la inflamación crónica aparece desempeñar un papel en la patología de la córnea después de la exposición y la intervención en las vías de muerte celular pueden mejorar el resultado clínico2,18.

<table><tbody><tr><td>Plataforma de manipulación de líquidos Bravo</td><td>Agilent o equivalente</td><td>G5409A</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas Bravo</td><td>Agilent o equivalente</td><td>Opción 159</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 96LT Cabezal de punta desechable</td><td>Agilent o equivalente</td><td>Opción 178</td><td>Unidad de cabezal de pipeteo de punta grande de 96 canales</td></tr><tr><td>Bravo 96ST Cabezal de punta desechable</td><td>Agilent o equivalente</td><td>Opción 177</td><td>Pipeteo de punta pequeña de 96 canales unidad principal</td></tr><tr><td>Bravo 384ST cabezal de punta desechable</td><td>Agilent o equivalente</td><td>Opción 179</td> unidad <td>de cabezal de pipeteo de punta pequeña de 384 canales</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &mu; L puntas de barrera estériles</td><td>Agilent o equivalente</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &mu; L puntas de barrera estériles</td><td>Agilent o equivalente</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &mu; L puntas de barrera estériles</td><td>Agilent o equivalente</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas multimodo EnSpire</td><td>Perkin Elmer o equivalente</td><td>2300-0000</td><td>Detector de ensayo AlphaLISA con excitación láser de alta potencia</td></tr><tr><td>IL-8 (humano) Kit de detección AlphaLISA&nbsp;</td><td>Perkin Elmer o</td><td>equivalente AL224F</td> ensayo <td>basado en perlas sin lavado</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus microplacas blancas de 384 pocillos poco profundos</td><td>Perkin Elmer o equivalente</td><td>6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen o equivalente</td><td>13778500</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 Medio de suero reducido</td><td>Invitrogen o equivalente</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco o equivalente</td><td>12605010</td><td>Solución de desprendimiento de células</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments o equivalente</td><td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>Microscopio automatizado alojado en incubadora</td></tr><tr><td>Cloropicrina</td><td>Trinity Manufacturing o equivalente</td><td>N/A</td><td>Toxicidad aguda e irritante</td></tr><tr><td>DMEM-F12 medio de cultivo celular</td><td>Invitrogen o equivalente</td><td>11330-057</td><td>Contiene HEPES</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen o equivalente</td><td>1891471</td><td></td></tr><tr><td>factor de crecimiento epidérmico humano (grado de cultivo celular)</td><td>Invitrogen o equivalente</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Insulina humana recombinante (grado de cultivo celular)</td><td>Invitrogen o equivalente</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina (grado de cultivo celular)</td><td>Invitrogen o equivalente</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona (grado de cultivo celular)</td><td>Sigma o equivalente</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa&nbsp; (grado de cultivo celular)</td><td>Sigma o equivalente</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp; (grado de cultivo celular)</td><td>Sigma o equivalente</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon o equivalentes</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tiazolil bromuro de tetrazolio</td><td>Sigma o equivalente</td><td>M5655</td><td>Tampón</td></tr> de <tr><td>siRNA</td> de sustrato para ensayo MTT <td>Termo o equivalente</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Corning o equivalente</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>T150 matraces</td><td>Corning o</td><td>equivalente CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 campana de cultivo celular</td><td>Nuaire o equivalente</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>Reservorios robóticos de 300 mL</td><td>Thermo o equivalente</td><td>12-565-572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 depósitos de automatización con deflectores</td><td>Termo o equivalente</td><td>1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de almacenamiento desechables estériles de 500 mL</td><td>Corning o equivalente</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>Sellador térmico de microplacas</td><td>Termo o equivalente</td><td>AB-1443A</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de termosellado de microplacas</td><td>Termo o equivalente</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>Cardamonin</td><td>Tocris o equivalente</td><td>2509</td><td>Antiinflamatorio, utilizado como control positivo</td></tr><tr><td>SKF 86002&nbsp;</td><td>Tocris o equivalente</td><td>2008</td><td>Antiinflamatorio, utilizado como control positivo</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma o equivalente</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fluorhídrico al 48%</td><td>Sigma o equivalente</td><td>339261</td><td>Toxicidad corrosiva y aguda</td></tr><tr><td>1000 &mu; L Pipetas monocanal</td><td>Rainin o equivalentes</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipetas monocanal</td><td>Rainin o equivalentes</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L Pipetas monocanal</td><td>Rainin o equivalentes</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L Pipetas de 12 canales</td><td>Rainin o equivalentes</td><td>17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipetas de 12 canales</td><td>Rainin o equivalentes</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L Pipetas de 12 canales</td><td>Rainin o equivalente</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 1000 &mu; L</td><td>Rainin o equivalente</td><td>17002920</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 200 &mu; L</td><td>Rainin o equivalente</td><td>17014294</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 20 &mu; L</td><td>Rainin o equivalente</td><td>17002928</td><td></td></tr><tr><td>Campana de gases químicos</td><td>Productos metálicos Jamestown</td><td>MHCO_229</td><td></td></tr><tr><td>Placas de almacenamiento de muestras de 384 pocillos</td><td>Termo o equivalente</td><td>262261 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Sigma o equivalente</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL Termo</td><td>o equivalente</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 50 mL</td><td>Corning o equivalente</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 25 mL</td><td>Corning o equivalente</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 10 mL</td><td>Corning o equivalente</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 5 mL</td><td>Corning o equivalente</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>SV40-HCEC células epiteliales corneales humanas inmortalizadas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Estas células no están disponibles comercialmente, pero se pueden obtener de los investigadores citados en el artículo</td></tr><tr><td>Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore o equivalente</td><td>PHCC20060</td><td></td></tr><tr><td>GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument</td><td>Affymetrix o equivalente</td><td>00-0372</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 24 y 96-array plates</td><td>Affymetrix o equivalente</td><td>901257; 901434</td><td></td></tr><tr><td>Draegger tubo HF</td><td>Draeger o equivalente</td><td>8103251</td><td></td></tr><tr><td>tubo Draegger CP</td><td>Draeger o equivalente</td><td>8103421</td><td></td></tr><tr><td>bomba Draegger</td><td>Draeger o equivalente</td><td>6400000</td><td></td></tr><tr><td>Sellos de placa transparente</td><td>Resesarch Products International o equivalente</td><td>202502</td><td></td></tr><tr><td>Reservorios de reactivos</td><td>VistaLab Technologies o equivalente</td><td>3054-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xlfit</td><td>IDBS o complemento de</td> Excel <td>N/A</td><td>equivalente utilizado para el ajuste automatizado de curvas</td></tr></tbody></table>

proyección de sirna de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos son generalmente apoyo como no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. En los esfuerzos para el desarrollo de tratamientos y terapias para cuidar de la exposición, puede ser importante comprender los mecanismos moleculares y celulares de estas lesiones. Proponemos que utilización de la detección de RNA (siRNA) inhibitorio pequeño alto rendimiento puede ser una importante herramienta que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. siRNA son doble trenzadas moléculas de ARN que son 19-25 nucleotides largos y utilizan el vía para degradar el mRNA de silenciamiento del gen postranscripcional que tienen homología con el siRNA. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. El desarrollo y validación de modelos de exposición en vitro y métodos para el alto rendimiento (HTS) de detección de fluoruro de hidrógeno (HF) y cloropicrina-(CP) inducida por lesión ocular se presentan en este artículo. Aunque hemos seleccionado estas dos sustancias tóxicas, nuestros métodos son aplicables al estudio de otras sustancias tóxicas, con pequeñas modificaciones en el protocolo de la exposición de sustancias tóxicas. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y la producción de IL-8 fueron seleccionados como puntos finales en el protocolo de investigación. Varios problemas asociaron con el desarrollo de la exposición de sustancias tóxicas y se presentan métodos de cultivo celular adecuados para estudios HTS. El establecimiento de modelos HTS para estas sustancias tóxicas permite estudios adicionales entender mejor el mecanismo de lesión y pantalla para terapéutica potencial para lesión ocular química.

Desarrollo de métodos de exposición
Había refinado y evaluar la idoneidad de la línea de células epiteliales corneales humanas SV40 HCEC para su uso en estudios HTS. SV40-HCEC se inmortalizó con el antígeno T grande de SV-40 y fueron un regalo de Dhanajay Pal23. Había demasiadas variables exploradas en el desarrollo de la metodología de exposición para presentar concisamente aquí, y por l...

Pequeña proyección inhibitoria de RNA alto rendimiento es una herramienta importante que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. Adjunto, presentamos el desarrollo y validación de modelos de exposición y métodos para el cribado de alto rendimiento de lesiones epiteliales de córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno y la cloropicrina.

Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

Este video muestra nuestros métodos para el cribado de siRNA de alto rendimiento en un modelo de células epiteliales corneales de lesión tóxica. Este trabajo es importante, porque el cribado de siRNA de alto rendimiento es un método rentable y eficiente en el tiempo para dilucidar las vías y los reguladores de la respuesta celular a los tóxicos. Este trabajo puede ayudar a comprender mejor cómo responde la córnea a las agresiones tóxicas.Prepare una suspensión de células epiteliales de la córnea en un medio precalentado que contenga 0,5 microgramos por mililitro de hidrocortisona en un frasco medio desechable. Gire la botella para suspender uniformemente las celdas y viértala en un depósito en el nido agitador orbital de un manipulador de líquidos automatizado. Mantenga la suspensión de la celda en una placa de calentamiento de 37 grados durante el proceso de recubrimiento de la celda.Utilice un manipulador de líquidos automatizado para agregar celdas a las placas a una densidad de mil celdas por pocillo en 70 microlitros de medio por pocillo en una placa de 96 pocillos. Siembre un mínimo de 14 placas de 96 pocillos con células para cada placa de biblioteca de siRNA que se vaya a e

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe un ensayo fluorométrico in vitro para evaluar los efectos de las formulaciones de lágrimas artificiales en la actividad metabólica celular de las células epiteliales de la córnea utilizando una solución de azul de Alamar a base de resazurina. Una formulación no tóxica mantiene las células en un estado saludable y metabólicamente activo, lo que facilita la reducción de la resazurina en una resorufina altamente fluorescente.

Ensayo alamarBlue: Un método fluorométrico sensible para evaluar los efectos citotóxicos de las formulaciones de lágrimas artificiales sobre la actividad metabólica de las células epiteliales de la córnea humana

Aquí describimos un ensayo de genes reporteros basado en células como una herramienta valiosa para examinar bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulan los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de 3' UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular que utiliza un modelo de tejido tridimensional epitelial-córnea como humana reconstruida (RHCE). La prueba es capaz de discriminar entre irritante ocular y materiales corrosivos (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

El objetivo del estudio fue evaluar el impacto biológico de 15 componentes del humo de cigarrillo utilizando una combinación de un analizador de células en tiempo real basado en impedancia y una plataforma basada en cribado de alto contenido (HCS) para la evaluación toxicológica in vitro. Este estudio proporciona información sobre las dosis efectivas, la toxicidad y los modos de acción de los compuestos probados.

Análisis alta Content Screening para evaluar los efectos toxicológicos de nocivo Componentes y potencialmente perjudicial (HPHC)

En este artículo, presentamos un protocolo para utilizar el ARN interferente pequeño específico de la proteína de choque térmico 27 (HSP27) para evaluar la función de HSP27 durante la cicatrización de heridas epiteliales corneales. La interferencia de ARN es el mejor método para reducir eficazmente la expresión génica para investigar la función de las proteínas en varios tipos de células.

basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

Este protocolo demuestra la detección simultánea de especies reactivas de oxígeno (ROS), células vivas y células muertas en cultivos primarios vivos a partir de células de superficie ocular de ratón. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodida, y Hoechst tinción se utilizan para evaluar el ROS, las células muertas y las células vivas, respectivamente, seguido de imágenes y análisis.

Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)

Este artículo describe los procedimientos utilizados para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas en una línea celular primaria e inmortalizada.

Determinación de la toxicidad de la radiación UV y los productos químicos en las células epiteliales corneales humanas primarias e inmortalizadas

Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.

Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.

Evaluación de la toxicidad terapéutica y química mediante el cultivo de órganos de córneas porcinas y la cicatrización de heridas epiteliales

Aprende el screening de siRNA de alto rendimiento para estudiar lesiones tóxicas en células epiteliales corneales usando fluoruro de hidrógeno y cloropicrina. Este método acelera la investigación toxicológica ocular.

Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno (Video) | JoVE Journal

Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

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