Procedimiento de ARN Pull-down para identificar dianas de ARN de un ARN largo no codificante
10 de abril de 2018
Este método de pull-down del RNA permite identificar los objetivos de RNA de un ARN largo no codificante (lncRNA). Basado en la hibridación de caseros, diseñadas anti-sentido oligonucleótidos sondas de ADN específicas para este lncRNA en un tejido adecuadamente fijo o línea celular, permite la captura de todos los objetivos de la lncRNA RNA eficientemente.
El objetivo general de este procedimiento es identificar, en células cultivadas o en tejidos, los socios moleculares de ARN de un ARN largo no codificante de interés. Este método puede ayudar a descifrar las funciones biológicas de un ARN largo no codificante al proporcionar nuevos conocimientos significativos sobre la regulación del ARN por ARN largo no codificante. La principal ventaja de este método es que es utilizable para la mayoría de las aplicaciones, ya que lo hemos optimizado, primero para varios ARN largos no codificantes y segundo para células cultivadas y extractos de tejidos.
Nuestro método se basa en la mezcla de dos métodos anteriores, el ChIRP, que significa Aislamiento de Cromatina por Purificaciones de ARN, y el CHART, que es el Análisis de Hibridación de Captura de Dianas de ARN. La especificidad de nuestro método es que las sondas de oligonucleótidos se diseñaron utilizando el modelado bioinformático de una estructura secundaria de un ARN largo no codificante y su objetivo fue identificar las dianas de ARN. Dos técnicas de mi equipo, Benedicte Boyer y Severine Guillén, demostrarán el procedimiento.
Después de cultivar las células GH4C1 de acuerdo con el protocolo de texto, retire el medio de una placa de cultivo celular y use un volumen de PBS para enjuagar las células. Agregue 10 mililitros de PFA al 1% en PBS para fijar las celdas. A continuación, reticular las células bajo agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Apague la acción del PFA añadiendo 1 mililitro de glicina molar 1,25 y agite la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, deseche la solución por aspiración y use 10 mililitros de PBS para enjuagar la placa dos veces durante cinco minutos cada una. A continuación, agregue un mililitro de PBS, use un raspador de células para recolectar células y transfiéralas a un tubo de centrífuga.
Centrifugar la muestra a 510 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante y almacene los gránulos indefinidamente a menos 80 grados centígrados. Para llevar a cabo la reticulación de tejidos, sumerja cinco miligramos de tejido de la glándula pituitaria de ratón recién obtenido en un volumen 10X de PFA al 1% en PBS y agite la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Apague el PFA añadiendo 0,05 mililitros de solución de glicina molar 1,25 y agite el tejido a temperatura ambiente durante cinco minutos. Aspire el medio y use 0,5 mililitros de PBS para enjuagar el pañuelo dos veces. Después de eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante, almacene el tejido reticulado indefinidamente a menos 80 grados centígrados.
A continuación, prepare el tampón de lisis para lisar las muestras sin descongelarlas previamente. Utilice el tampón para resuspender muestras en aproximadamente un mililitro por cada 100 miligramos de gránulos o tejidos celulares. Coloque las muestras lisadas en un baño de agua de cuatro grados centígrados e inicie la serie de sonicación optimizada según el protocolo de texto.
Inmediatamente después de la sonicación, centrifugar las muestras a 12.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos. La serie de sonicación debe optimizarse para que sea lo suficientemente eficiente como para reducir la viscosidad del ADN sin obtener otros ARN fragmentados.
Para realizar la hibridación en las muestras sonicadas, añada dos volúmenes de tampón de hibridación a los tubos y al vórtice. Transfiera 20 microlitros de cada muestra a tubos de centrífuga y almacene a 20 grados centígrados negativos. Añadir 100 picomoles de sondas de oligonucleótidos biotinilados a cada muestra.
Luego, incube las muestras bajo agitación moderada en un rotador de tubos a temperatura ambiente durante cuatro a seis horas. Después de la incubación, agregue 50 microlitros de perlas de estreptavidina magnética suplementadas con 200 unidades por mililitro de una solución inhibidora de ARNasa y un cóctel de inhibidores de proteasa de 5 microlitros por mililitro a las muestras. Incubar los tubos a temperatura ambiente bajo una agitación moderada en el rotador de tubos durante la noche.
Al día siguiente, realice el aislamiento del ARN colocando los tubos sobre un soporte magnético y deseche el sobrenadante. Luego, agregue 900 microlitros de tampón de lavado a las perlas y coloque los tubos en un rotador a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, coloque las muestras en el imán, deseche el tampón y repita el lavado cinco veces.
Después de retirar el lavado final, agregue 95 microlitros de tampón de proteinasa K y cinco microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa-K a la muestra. Luego, en hielo, descongele las muestras de entrada y agregue 75 microlitros de tampón de proteinasa K y cinco microlitros de proteinasa-K. Incube las muestras a 50 grados centígrados durante 45 minutos, luego a 95 grados centígrados durante 10 minutos.
Enfríe las muestras en hielo durante tres minutos, luego colóquelas en el imán y recoja el sobrenadante que contiene los ARN y deseche las perlas. Utilice un kit de purificación de ARN para purificar los ARN. Por último, almacene los ARN a menos 80 grados centígrados y realice RT y qPCR y construya bibliotecas de ADN de acuerdo con el protocolo de texto.
Sobre la base del modelado bioinformático de la estructura secundaria de lncRNA ilustrada aquí, se diseñaron sondas contra dos lncRNAs, ratas Neat1 o Malat1 para células cultivadas GH4C1 y Neat1 de ratón para extractos de tejido hipofisario. Se calculó el enriquecimiento relativo de Neat1 o Malat1 para sondas específicas y no específicas en relación con las muestras de entrada. Esta figura muestra la eficiencia de las sondas específicas para derribar Neat1 en la línea celular pituitaria GH4C1 de rata y en extractos de tejido hipofisario de ratón.
Cuando el protocolo para oligonucleótidos específicos o sondas SO se dirigió a Malat1, se generó una sonda eficiente junto con una sonda ineficiente que se descartó. Después de las extracciones de ARN y la RT qPCR, los ARN asociados con Neat1 en extractos de células GH4C1 también se asociaron con Neat1 en extractos de tejido hipofisario. De hecho, después de la extracción del ARN de Neat1, se descubrió que Malat1 era el objetivo de Neat1 tanto en la línea celular GH4C1 como en extractos de tejido de ratón hipofisario.
Además, Neat1 se enriqueció significativamente después de que se realizara una extracción de ARN de Malat1 con la sonda en células GH4C1. La estrecha relación identificada entre los dos lncRNAs es consistente con el posible papel corregulador de Neat1 y Malat1, sugerido por ratones knock-out de Malat1 que muestran variaciones en la expresión de Neat1 RNA. Una vez dominada, esta técnica permite en dos o tres días la captura de las dianas de ARN de un ARN largo no codificante deseado.
Con el enfoque bioinformático, es importante diseñar varias sondas antisentido y luego comparar experimentalmente su eficiencia, ya que la eficiencia de la sonda puede verse alterada por las preparaciones de lisado celular. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la secuenciación de ARN de alto rendimiento para proporcionar el interactoma de ARN completo de un ARN largo no codificante de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar los socios de ARN de un ARN largo no codificante utilizando sondas eficientes y específicas que se hibridan con las regiones disponibles del ARN largo no codificante según lo determinado por el modelado bioinformático de su estructura secundaria.
Visión general
Este método de pull-down de ARN identifica los objetivos de ARN de ARN largos no codificantes (lncARN) utilizando sondas de oligonucleótidos de ADN antisentido específicas. Es aplicable tanto a células cultivadas como a extractos de tejido, mejorando nuestra comprensión de la regulación del ARN.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Molecular
- Biología del ARN
Antecedentes
- Los ARN largos no codificantes juegan roles significativos en la regulación génica.
- Entender sus socios de ARN es crucial para descifrar sus funciones biológicas.
- Este método combina elementos de las técnicas ChIRP y CHART.
- El modelado bioinformático ayuda en el diseño de sondas específicas para lncARN.
Propósito del estudio
- Identificar los socios moleculares de ARN de lncARN específicos.
- Mejorar el conocimiento sobre la regulación de ARN por lncARN.
- Optimizar un método utilizable para varias aplicaciones.
Métodos utilizados
- Fijación cruzada de células y tejido con PFA.
- Sonicación para lisar muestras y reducir la viscosidad.
- Hibridación de muestras con sondas oligonucleotídicas biotiniladas.
- Aislamiento y purificación de ARN seguida de RT y qPCR.
Resultados principales
- Las sondas específicas lograron pull-down del lncARN Neat1 en extractos tanto celulares como de tejido.
- Malat1 fue identificado como objetivo de Neat1 en ambos contextos.
- Se demostraron relaciones co-reguladoras entre Neat1 y Malat1.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque confiable para estudiar las interacciones de lncARN.
- Los hallazgos sugieren roles regulatorios significativos para Neat1 y Malat1.
- Investigaciones adicionales podrían dilucidar las implicaciones funcionales de estas interacciones.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Identifying RNA interactors of long non-coding RNAs (lncRNAs) is critical for de-risking target validation in early discovery, particularly for regulatory RNAs with poorly defined mechanisms. This pull-down method enables mechanistic interrogation of lncRNA function by mapping direct and indirect RNA partners, supporting hypothesis-driven target assessment. The approach provides predictive confidence in target selection by revealing co-regulatory networks that may influence disease-relevant pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lncRNA-mediated regulatory hypotheses by identifying associated RNA molecular partners.
- Operational Value: Uses bioinformatics-guided probe design to increase specificity and reduce false-positive interactions in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports target de-risking by revealing co-regulatory lncRNA relationships, such as Neat1-Malat1, that may influence phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified RNA complexes suitable for downstream quantitative analysis, including RT-qPCR and high-throughput sequencing.
- Reproducibility: Standardized cross-linking and wash conditions improve consistency across cell and tissue models, supporting assay transferability.
- Scalability: Compatible with both cultured cells and tissue extracts, enabling flexible application across discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated applicability in both rat cell lines and mouse tissue extracts supports cross-species target validation.
- Mechanistic De-risking: Identification of functionally relevant RNA partners, such as Malat1 as a Neat1 target, aids in prioritizing lncRNAs with regulatory impact.
- Predictive Biomarker Alignment: RNA interactome data can inform biomarker strategies when linked to disease-associated expression patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to lead optimization, providing RNA interaction data that informs target suitability and mechanistic rationale.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing RNA-based mechanisms of lncRNA action, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Outputs purified RNA fractions amenable to quantitative profiling, enabling scalable evaluation of lncRNA interactors.
- Analytics: Enables quantitative measurement of RNA enrichment (e.g., via qPCR or sequencing) to compare specific versus control probe conditions.
- Translational Research: Demonstrated consistency between cell and tissue models supports extrapolation to preclinical systems.
- Enterprise Reuse: Standardized probe design and hybridization workflow allows reuse across multiple lncRNA targets with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic uncertainty in lncRNA target validation by defining RNA interaction networks.
- Operational Value: Standardized fixation, lysis, and hybridization steps enhance reproducibility across laboratories and sample types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing whether a lncRNA engages in functionally relevant RNA-mediated regulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lncRNA targets based on demonstrated interactome complexity and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lncRNA bioinformatics to model secondary structure and design effective antisense probes.
- Dependent on access to sonication equipment optimized to reduce viscosity without excessive RNA fragmentation.
- Necessitates standardized cross-linking and quenching protocols to preserve native RNA-protein-RNA interactions.
- Adaptation across model systems may require validation of fixation efficiency and probe accessibility.
- Practical limitation: Probe efficiency can vary with lysate conditions, necessitating empirical testing of multiple candidates.
