Name: Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a realizar inyecciones intraspinales de rAAV en la médula espinal lumbar de ratones para manipular neuronas definidas genéticamente. Esta técnica permite estudiar circuitos neuronales implicados en la percepción del dolor.

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Agradecemos Hanns Ulrich Zeilhofer generosamente apoyando este trabajo. Hendrik Wildner fue apoyado por la Fundación Olga Mayenfisch. Agradecemos a Carmen Birchmeier para el anticuerpo de Lmx1b.

<ol><li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+downunder%3A+an+update+from+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Sandkuhler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li>
<li>Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+in+spinal+sensory+processing+and+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control.</a> Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Early+RET%2B+Deep+Dorsal+Spinal+Cord+Interneurons+in+Gating+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain.</a> Neuron. 91 (6), 1413(2016).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Circuits+for+Persistent+Mechanical+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain.</a> Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).</li>
<li>Petitjean, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Parvalbumin+Neurons+Are+Gate-Keepers+of+Touch-Evoked+Pain+after+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury.</a> Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li>
<li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+the+impact+of+serotypes+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li>
<li>Abraira, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+and+Synaptic+Architecture+of+the+Mechanosensory+Dorsal+Horn%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn.</a> Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).</li>
<li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li>
<li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313(2013).</li>
<li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306(2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li>
<li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li>
<li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate-mapping+approaches%3A+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Inyección intraspinal de aireación puede convertirse en una poderosa técnica en un laboratorio de investigación, lo que permite el análisis de células espinales con solución temporal y espacial de alta. Este protocolo permite la transducción de los tres principales segmentos espinales inervados por neuronas sensoriales ampliando sus axones periféricos a la trasera. Transducción de tres segmentos produce datos conductuales robustos y reproducibles. También permite la prueba de un área sensorial más grande que posible desp...

La médula espinal dorsal es esencial para el intercambio de información entre la periferia del cuerpo y el cerebro. Estímulos sensoriales como calor, frío, tacto, o estímulos nocivos son detectados por las neuronas periféricas especializadas, que transmitan esta información a las neuronas del cuerno dorsal de la médula espinal. Aquí, una compleja red de interneuronas inhibitorias y excitatorias modula y eventualmente relés de información sensorial a través de las neuronas de proyección espinal a supraspinal sitios1,2. Los cálculos realizados por espinal inter- y las neuronas de proyección de información sensorial, determinando así que la información es suprimida o reenviada a que intensidad la puerta. Cambios en la integración de estímulos sensoriales, como un balance alterado entre inhibición y excitación, pueden causar disfunciones sensoriales tales como hipersensibilidad o alodinia (sensaciones dolorosas después del estímulo normalmente no doloroso). Estos cambios se cree que la causa subyacente del dolor crónico de diferentes Estados de3,4. Así, los circuitos espinales son de gran importancia en el procesamiento sensorial y por lo tanto en la percepción del ambiente de un organismo y el yo. Con el advenimiento reciente combinación de molecular, genética y técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación precisa de subpoblaciones genéticamente identificado neurona espinal, los científicos están empezando a entender los circuitos espinales subyacentes responsable de la elaboración de distintas modalidades sensoriales.
Inyección intraspinal de rAAV en ratones de tipo salvaje o transgénicas ha contribuido enormemente a la manipulación, análisis y comprensión de la función de subconjuntos específicos de neuronas espinales5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. esta técnica permite la entrega de proteínas marcadoras (como GFP / proteínas de la fusión de GFP), proteínas de reportero (como GCaMP), o proteínas efectoras (como toxinas bacterianas, channelrhodopsin o receptores Farmacogenético) en un espacial manera restringida a las neuronas espinales. Inyección local de Cre-dependiente rAAVs en ratones transgénicos que expresaban recombinase de Cre en un subconjunto específico de neuronas espinales permite el análisis específico de la población neuronal respectiva. Hemos empleado esta técnica para etiqueta, ablar, inhibir o activar glycinergic espinal neuronas demostrando que son una parte esencial de la columna puerta de control del dolor y picor de transmisión7. En estos experimentos, inyección intraspinal de rAAV Cre-dependiente en ratones GlyT2::Cre permitió la manipulación selectiva de las neuronas glycinergic en la médula espinal lumbar. De tal modo, puede evitarse la manipulación simultánea del supraspinal circuitos que contienen neuronas de glycinergic fundamentales para la supervivencia del animal.
Mientras que una inyección intraspinal de rAAVs limita la infección en el sitio de la inyección, transducción viral puede ocurrir no sólo en las neuronas locales, sino también en las neuronas que conectan con el sitio de la inyección mediante proyecciones axonales. El último es a menudo utilizado para áreas de CNS de seguimiento proporciona entrada neuronal a un núcleo particular en el cerebro. La infección de proyecciones axonales, sin embargo, también puede ser un factor de confusión cuando una población definida de neuronas debe estudiarse en un sitio en particular. Para tratar estos temas, recientemente hemos realizado un análisis exhaustivo de serotipos AAV y cassettes de expresión para identificar los serotipos y los promotores que pueden utilizarse para minimizar o maximizar la transducción retrógrada. En el contexto de esta investigación específica en circuitos espinales, se analizó la capacidad de diferentes serotipos y promotores retrogradely transduce las neuronas en los ganglios de raíz dorsal (GRD), la médula rostral ventromedial (RVM) y la corteza somáticosensorial 12. la técnica se describe en este protocolo, por tanto, puede utilizarse para analizar las neuronas espinales en el sitio de inyección o analizar las neuronas de proyección que aportar en el sitio inyectado de la médula espinal. En el protocolo descrito aquí, tres inyecciones de rAAV en el lado izquierdo de la médula espinal lumbar se realizan para habilitar la transducción de señales de las neuronas en los tres segmentos lumbares (L3-L5). Los segmentos L3-L5 reciben la mayor parte de la entrada sensorial de la trasera ipsolateral en el sitio de inyección. Demostramos que la manipulación funcional de las neuronas genéticamente marcadas en L3-L5 es suficiente para evocar cambios en el comportamiento robustos, proporcionando pruebas funcionales para la función de circuito de un subtipo de neurona marcada genéticamente.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td>micropipeta tirador: DMZ-Universal-Electrode-Puller Zeitz NA unidad de anestesia: Concentrador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>oxígeno Oxymat3</td><td>Weinmann</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>unidad de anestesia: VIP 3000 Vaporizador Veterinario</td><td>Midmark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Esterilla térmica: Mio Star Thermocare 100 Migros <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>717614700000</tr><tr><td>Afeitadora eléctrica</td><td>Philips</td><td>BT9290</td><td></td></tr><tr><td>microscopio quirúrgico (OPMI pico)</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Aparato estereotáxico para animales pequeños</td><td>Kopf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Neurostar StereoDrive (opcional)</td><td>Neurostar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Modelo 51690 Adaptador espinal para ratón Cunningham</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa PHD Ultra con nanomito</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3601</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 701 RN 10 &mu; l jeringa de microlitro de vidrio</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Accesorio de compresión de aguja extraíble (RN) 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>aparato de perforación de odontología fina: Osada success 40</td><td>Osada</td><td>OS-40</td><td></td></tr><tr><td>cortador esférico, 0,5 mm</td><td>Busch</td><td>12001005B</td><td></td></tr><tr><td>anestesiómetro electrónico von Frey</td><td>IITC</td><td>23905</td><td></td></tr><tr><td>pelos flexibles de von Frey</td><td>IITC</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Pascal microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.8 NA &times; 20 Plan-objetivo apocromático</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1.3 NA &times; 40 EC Plan-Neofluar objetivo de inmersión en aceite</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Herramientas quirúrgicas</td>Mango de bisturí #4, 13cm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn Extra Finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Adson, 1 x 2 dientes, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs, curvado, copa de 0,7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de laminectomía Dumont #2</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas Olsen-Hegar, dentado, longitud de abrazadera de 8,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Consumibles y productos químicos</td>Capilar de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vidrio de pared delgada, diámetro exterior de 1 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas (1, 5 y 20 ml)</td><td>B. Braun</td><td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td><td></td></tr><tr><td>26G Aguja biselada</td><td>B. Braun</td><td>4665457</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí estériles</td><td>B. Braun</td><td>BB523</td><td></td></tr><tr><td>Suturas quirúrgicas Safil Quick+ 4/0, reabsorbibles</td><td>B. Braun</td><td>C1046220</td><td></td></tr><tr><td>Suturas quirúrgicas Premilene 5/0, no absorbibles</td><td>B. Braun</td><td>C0932191</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril o solución salina (0,9%)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 70% (desinfectante)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solución de yodo (p. ej., Braunol)</td><td>B. Braun</td><td>18380</td><td></td></tr><tr><td>Anestésicos (p. ej., Attane isoflurano)</td><td>Provet</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>Aldasorber</td><td>Provet</td><td>333526</td><td></td></tr><tr><td>analgésicos (p. ej., buprenorfina: temgesic)</td><td>Indivior</td><td>GTIN: 7680419310018</td><td></td></tr><tr><td>Oftálmico ungüento (p. ej. vita-pos)</td><td>Pharma medica</td><td>GTIN: 4031626710635</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón (p. ej. de)</td><td>FIV Hartmann</td><td>1628100</td><td></td></tr><tr><td>Pañuelos faciales (p. ej. de)</td><td>Uehlinger AG</td><td>2015.10018</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost plus</td><td>ThermoScientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ratones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J ratones (wildtype)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Rorbtm1.1(cre)Ratones Hze/J (ROR&beta; Cre)</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>RRID:IMSR_JAX:023526</td><td></td></tr><tr><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Ratones Hze/J (R26Tom)</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>RRID: IMSR_JAX:007914</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Vectores virales</ fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CB7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)</td><td>Núcleo vectorial Penn</td><td>AV-1-PV1963</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)</td><td>Núcleo vectorial Penn</td><td>AV-1-ALL854</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-ALL864</td><td></td></tr><tr><td>AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)</td><td>Penn Vector Core</td><td>Producción</td><td></td>personalizada</tr><tr><td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td><td>Penn Vector Core</td><td>Producción</td><td></td> personalizada</tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Plásmidos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>44361</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.EF1&alpha;. flex.hChR2(H134R)-eYFP</td><td>Addgene</td><td>20298</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Bacterias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDS42</td><td>ScarabGenomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3</td><td>ThermoScientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Quiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC 500</td><td>Machery & Nagel</td><td>740574</td><td></td></tr><tr><td>clozapina-N-óxido (CNO)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BBL-NS105-0025</td><td></td></tr><tr><td>sal de difosfato de cloroquina</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>histamina</td><td>Sigma</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Anticuerpos (dilución)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-GFP (1:1000)</td><td>Sondas moleculares</td><td>RRID:AB_221570</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-NeuN (1:3000)</td><td>Abcam</td><td>RRID:AB_10711153</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Pax2 (1:200)</td><td>R & D Systems</td><td>RRID:AB_10889828</td><td></td></tr><tr><td>Cobaya anti-Lmx1b (1 : 10 000)</td><td>Dr Carmen Birchmeier</td><td>Muller et al. 2002</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-GFAP (1 : 1000)</td><td>DakoCitomatación</td><td>RRID:AB_10013382</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios criados en burro (1:800)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

expresión de transgenes de mediada por virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Manipulación selectiva de subpoblaciones neuronales espinales se ha logrado principalmente mediante dos métodos diferentes: 1) concurrencia genética, por el que se generan ratones transgénicos dobles o triples con el fin de lograr la expresión selectiva de un reportero o un efector gen (por ejemplo, desde el locus Rosa26) en la población de columna deseada. 2) inyección intraspinal de las virus Cre-dependiente de adeno-asociado recombinante (rAAV); Aquí vectores AAV Cre-dependiente que codifica para el gen reportero o efectora de elección se inyectan en la médula espinal de los ratones que expresaban recombinase de Cre en la subpoblación neuronal deseada. Este protocolo describe cómo generar vectores rAAV de Cre-dependiente y que transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar segmentos L3-L5 con rAAVs. Como los segmentos de columna vertebral lumbares L3-L5 están inervados por las neuronas sensoriales periféricas que transmiten información sensorial de los miembros posteriores, pueden ser espontáneo comportamiento y respuestas a las pruebas sensoriales aplicadas en el miembro posterior ipsolateral al lado de inyección analizados con el fin de interrogar a la función de las neuronas manipuladas en el procesamiento sensorial. Ofrecemos ejemplos de cómo puede utilizarse esta técnica para analizar genéticamente definición subconjuntos de neuronas espinales. Las principales ventajas de la expresión del transgén mediada por virus en Cre ratones transgénicos en comparación con la expresión inducida de ratón transgénico de reportero clásica son los siguientes: 1) diferentes Cre-dependiente rAAVs codificación de varias proteínas de reportero o efector puede ser inyectado en una sola línea transgénica Cre, superando así la necesidad de crear varios Ratón transgénico múltiples líneas. 2) inyección intraspinal limita la manipulación de células expresan Cre para el sitio de inyección y el tiempo después de la inyección. Las principales desventajas son: 1) expresión del gen reportero de rAAVs es más variable. 2) la cirugía es necesaria para transducir las neuronas espinales de interés. Cual de los dos métodos es más apropiado depende de la pregunta de investigación y población neurona a abordarse.

Con el fin de ilustrar los niveles de expresión que pueden ser obtenidos por la inyección intraspinal de rAAV codificando una proteína del marcador, primero inyectamos AAV1. CAG.eGFP en la médula espinal lumbar de los ratones de tipo salvaje. Tres inyecciones espaciadas aproximadamente 1 mm de separación producción una infección casi continua de segmentos espinales lumbares L3 a L5 (figura 1A-C). Inyección de virus a una profundidad de 300 μm...

Inyección intraspinal del recombinase dependiente recombinante virus adeno-asociado (rAAV) puede utilizarse para manipular cualquier tipo de célula genéticamente marcadas en la médula espinal. Aquí describimos cómo transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Esta técnica permite interrogatorio funcional del subtipo neurona manipulada.

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

El objetivo general de la administración intraespinal de virus adenoasociados recombinantes es permitir el marcaje histológico y la manipulación funcional de neuronas definidas genéticamente en la médula espinal dorsal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del dolor, como qué circuitos neuronales son necesarios para la percepción de diferentes modalidades de dolor. La principal ventaja de esta técnica es que las neuronas marcadas genéticamente pueden ser manipuladas de una manera especialmente restringida y controlada temporalmente.Localice el par de costillas más caudal palpando a lo largo de la columna vertebral del ratón anestesiado. A continuación, haz un corte longitudinal de 1,5 a 2,5 centímetros en la piel, empezando desde el rostral hasta el par de costillas más caudal. Levante la piel con pinzas y sepárela del músculo subyacente con unas tijeras.Durante toda la cirugía, mantenga húmedos los tejidos expuestos con cloruro de sodio estéril al 0,9%. Con pinzas finas y tijeras pequeñas, haga una incisión en la siguiente capa membranosa delgada, justo al lado de la línea media, y córtela lejos de las apófisis espinosas. Varios puntos de referencia anatómicos pueden ayudar a identificar las vértebras correctas a las que dirigirse.Aquí, describimos tres alternativas. Palpar a lo largo de la columna vertebral. El par de costillas más caudal se encuentra justo rostral a las vértebras T13 y el hueso pélvico a nivel de la cadera está a nivel de las vértebras L6.Alternativamente, tire de la piel hacia atrás hacia la cola para exponer la cresta ilíaca. Al mismo nivel, el par más caudal de ligamentos intertransversales visibles se une a la apófisis espinal L6. Cuente hacia atrás en dirección caudal a rostral para identificar las vértebras de interés.De lo contrario, ubique el lugar donde el tendón a lo largo del costado de la columna vertebral es más blanco y más medial. Las vértebras T13 se encuentran justo en el rostral. El segmento L4 de la médula espinal lumbar se encuentra dentro de esta vértebra.A continuación, coloque al animal sobre un cojín de pañuelos enrollados para elevarlo a las pinzas espinales del marco estereotáxico. Alinee las pinzas adyacentes a las vértebras objetivo. Fije una pinza en su posición, luego sostenga la columna vertebral con pinzas Adson mientras fija la segunda abrazadera.Confirme la sujeción adecuada presionando con cuidado las vértebras objetivo. Luego, retire el músculo paraespinoso por encima de las vértebras de interés. Primero, haga una incisión justo medial a los tendones paralelos a la columna vertebral.A continuación, realice incisiones perpendiculares rostral y caudal a las vértebras objetivo. A continuación, utilice rongeurs para desgarrar o cortar el músculo paraespinoso por encima de las vértebras de interés. Use fórceps según sea necesario para eliminar el tejido que queda en las vértebras o por encima de la duramadre en el espacio intravertebral.El vaso sanguíneo dorsal ahora debería ser visible, marcando la línea media de la médula espinal. En el caso de las inyecciones unilaterales, realice una laminectomía parcial utilizando un taladro dental fino equipado con un cortador esférico de 0,5 milímetros para perforar con mucho cuidado un agujero en el centro del lado objetivo de las vértebras. Retire los fragmentos óseos restantes con una aguja biselada de calibre 26 para exponer la médula espinal.Utilice la aguja para perforar la duramadre en los espacios intravertebrales rostral y caudal a las vértebras objetivo, aproximadamente 300 micras laterales al vaso sanguíneo dorsal. Luego, perfora la duramadre debajo del orificio perforado. En este punto, el líquido cefalorraquídeo debe escapar de los orificios y la médula espinal debe estar ligeramente abultada.Prepare la jeringa de inyección montando primero el capilar de vidrio en una jeringa de microlitros. Apriete la tuerca firmemente para garantizar un ajuste apretado y seguro. Llene la jeringa de microlitros con agua destilada estéril, luego presione el émbolo.Si el agua no se expulsa fácilmente de la punta, es probable que la micropipeta esté bloqueada y deba cambiarse. Monte la jeringa en un micromanipulador conectado a un microinyector controlado electrónicamente. A continuación, utilice el microinyector para extraer aproximadamente un microlitro de aire para separar el agua y el virus.A continuación, pipetee una gota de 2,5 microlitros de solución viral diluida en un trozo de película de parafina. Mueva con cuidado la punta de la micropipeta dentro de la gota con el marco esterotáxico y extráigala hacia arriba en la micropipeta. Luego, presione dispensar hasta que emerja una gota de solución viral en la punta.Retraiga la jeringa y utilice un bolígrafo para marcar la micropipeta con una escala para controlar el volumen dispensado. Utilice el brazo estereotáxico para mover la punta de la micropipeta sobre uno de los orificios de la duramadre y luego hacia abajo hasta que aparezca una ligera depresión en la superficie de la médula espinal expuesta. Para dirigir la inyección al asta dorsal espinal, mueva la punta hacia abajo a una profundidad de 500 micras en incrementos de 100 micras y luego hacia arriba 200 micras para permitir la estabilización mecánica del tejido.La profundidad final de la punta es de 300 micras. Después de programar la bomba para inyectar 300 nanolitros a una velocidad de inyección de 50 nanolitros por minuto, presione el botón de inicio para comenzar la infusión. Una vez completada la inyección, compruebe la escala de la micropipeta para ver si el nivel del virus ha disminuido.Deje la micropipeta en su lugar durante tres minutos más para permitir que la presión se equilibre. Después de tres minutos, retraiga lentamente la micropipeta y repita el procedimiento para los otros dos sitios de inyección. Después de la inyección final, retire las pinzas espinales y la almohadilla debajo del ratón.Cerrar las capas de incisión con puntos interrumpidos, suturando las capas de tejido superficial con suturas reabsorbibles y la piel con suturas no reabsorbibles. Aplicar desinfectante de yodo sobre la herida suturada. Termine la anestesia y deje al animal en la estera térmica hasta que se recupere antes de devolverlo a su jaula de origen.El tejido espinal en el lugar de la inyección se examinará al final del experimento. Esto es necesario para verificar el éxito de la inyección y la transducción y para excluir el daño tisular excesivo como resultado de la cirugía. Para ilustrar los niveles de expresión que se pueden obtener mediante la inyección intraespinal de AAV recombinante, se inyectó un virus que codifica la proteína fluorescente eGFP en la médula espinal lumbar de ratones de tipo salvaje.Tres inyecciones espaciadas aproximadamente un milímetro produjeron una infección casi continua de los segmentos espinales lumbares L3 a L5. La inyección de virus a una profundidad de 300 micras desde la superficie espinal conduce a una infección predominante de las células en el asta dorsal de la médula espinal. Sin embargo, también se pueden encontrar células infectadas en el asta ventral. Se inyectó un vector flex dependiente de cre que expresa eGFP en la médula espinal de ratones transgénicos GlyT2:Cre.Esto dio lugar a una expresión más restringida de eGFP que refleja la distribución de las neuronas GLYT2 positivas. Seguir este protocolo permitirá dirigirse a tres segmentos consecutivos de la columna vertebral. Encontramos que esto es suficiente para obtener resultados de comportamiento robustos.Esta técnica permitirá estudiar la función de poblaciones específicas de neuronas y células y las vías sensoriales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Smit, R. D., et al. Dirigirse al tracto corticoespinal en ratas neonatales con un vector viral doble mediante cirugía combinada de cerebro y columna vertebral. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra la administración dirigida de vectores virales a las neuronas corticoespinales en una rata neonatal. El protocolo permite una expresión génica precisa mediante inyecciones virales anterógradas y retrógradas, lo que facilita la investigación sobre la regeneración neural y la plasticidad...

Entrega viral dirigida a neuronas corticoespinales en una rata neonatal para estudiar la lesión de la médula espinal

Fuente: Tadokoro, T., et al. Administración del vector del virus adenoasociado subpial 9 (AAV9) en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra una técnica de inyección subpial para la administración de genes a la médula espinal en ratones. El procedimiento consiste en exponer la duramadre, perforar la piamadre e inyectar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que lleva un gen que expresa proteínas fluorescentes en el espacio subpial. Después de la inyección y la recuperación,...

Entrega de genes subpiales en la médula espinal del ratón para evaluar la expresión génica

Fuente:Pourshafie, N., et al. Administración sistémica de microARN utilizando virus adenoasociados recombinantes serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores. J. Vis. Exp. (2018).En este video, un ratón afectado por atrofia muscular espinal y bulbar o SBMA se somete a una inyección en la vena de la cola de vectores AAV (vectores adenoasociados) recombinantes que llevan un plásmido que codifica microARN terapéutico. El vector produce microARN que se une al AR-ARN mutante...

Inyección de vectores adenoasociados recombinantes en un modelo de ratón con atrofia muscular espinal y bulbar

Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Este protocolo presenta el uso de una inyección de ganglios de la raíz dorsal (DRG) con un vector viral y una lesión concurrente por aplastamiento de la raíz dorsal en una rata adulta como modelo para estudiar la regeneración sensorial de los axones. Este modelo es adecuado para investigar el uso de la terapia génica para promover la regeneración sensorial de los axones.

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

El objetivo del presente estudio fue desarrollar y validar la potencia y la seguridad de la entrega del gen mediado por el virus adeno-asociado al virus espinal 9 (AAV9) mediante el uso de una nueva técnica de administración génica subpial en ratones adultos.

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Este protocolo muestra la inyección de un vector viral retrogradely transportable en tejido de médula espinal de rata. El vector es tomado en la sinapsis y transportado al cuerpo celular de las neuronas de destino. Este modelo es adecuado para rastreo retrógrada de importantes vías espinales o dirigidos a las células para usos de la terapia génica.

Inyección directa de un Vector lentivirales destaca múltiples caminos del Motor en la médula espinal de rata

Este protocolo demuestra un método novedoso para aplicar terapias génicas a subpoblaciones de células en ratas neonatas a edades postnatales de 5 a 10 días mediante la inyección de un modificador quimiogenético anterógrado en la corteza somatomotora y una recombinasa Cre retrógradamente transportable en la médula espinal cervical.

Apuntando al tracto corticoespinal en ratas neonatas con un vector viral doble utilizando cirugía combinada de cerebro y columna vertebral

Se describe una nueva técnica para la administración generalizada de virus adenoasociados que utiliza la infusión de virus subaracnoideos. Este método no solo asegura la transducción generalizada de las neuronas neocorticales de ratón en las capas superficiales, sino que también da lugar a la expresión selectiva del transgén en las neuronas piramidales de la capa cinco, incluso cuando se utiliza un promotor no selectivo.

Transducción generalizada de neuronas neocorticales de ratón mediante inyección subaracnoidea de AAV2

Aprende a realizar inyecciones intraspinales de rAAV en la médula espinal lumbar de ratones para manipular neuronas definidas genéticamente. Esta técnica permite estudiar circuitos neuronales implicados en la percepción del dolor.

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

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