Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

El objetivo general de la administración intraespinal de virus adenoasociados recombinantes es permitir el marcaje histológico y la manipulación funcional de neuronas definidas genéticamente en la médula espinal dorsal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del dolor, como qué circuitos neuronales son necesarios para la percepción de diferentes modalidades de dolor. La principal ventaja de esta técnica es que las neuronas marcadas genéticamente pueden ser manipuladas de una manera especialmente restringida y controlada temporalmente.

Localice el par de costillas más caudal palpando a lo largo de la columna vertebral del ratón anestesiado. A continuación, haz un corte longitudinal de 1,5 a 2,5 centímetros en la piel, empezando desde el rostral hasta el par de costillas más caudal. Levante la piel con pinzas y sepárela del músculo subyacente con unas tijeras.

Durante toda la cirugía, mantenga húmedos los tejidos expuestos con cloruro de sodio estéril al 0,9%. Con pinzas finas y tijeras pequeñas, haga una incisión en la siguiente capa membranosa delgada, justo al lado de la línea media, y córtela lejos de las apófisis espinosas. Varios puntos de referencia anatómicos pueden ayudar a identificar las vértebras correctas a las que dirigirse.

Aquí, describimos tres alternativas. Palpar a lo largo de la columna vertebral. El par de costillas más caudal se encuentra justo rostral a las vértebras T13 y el hueso pélvico a nivel de la cadera está a nivel de las vértebras L6.

Alternativamente, tire de la piel hacia atrás hacia la cola para exponer la cresta ilíaca. Al mismo nivel, el par más caudal de ligamentos intertransversales visibles se une a la apófisis espinal L6. Cuente hacia atrás en dirección caudal a rostral para identificar las vértebras de interés.

De lo contrario, ubique el lugar donde el tendón a lo largo del costado de la columna vertebral es más blanco y más medial. Las vértebras T13 se encuentran justo en el rostral. El segmento L4 de la médula espinal lumbar se encuentra dentro de esta vértebra.

A continuación, coloque al animal sobre un cojín de pañuelos enrollados para elevarlo a las pinzas espinales del marco estereotáxico. Alinee las pinzas adyacentes a las vértebras objetivo. Fije una pinza en su posición, luego sostenga la columna vertebral con pinzas Adson mientras fija la segunda abrazadera.

Confirme la sujeción adecuada presionando con cuidado las vértebras objetivo. Luego, retire el músculo paraespinoso por encima de las vértebras de interés. Primero, haga una incisión justo medial a los tendones paralelos a la columna vertebral.

A continuación, realice incisiones perpendiculares rostral y caudal a las vértebras objetivo. A continuación, utilice rongeurs para desgarrar o cortar el músculo paraespinoso por encima de las vértebras de interés. Use fórceps según sea necesario para eliminar el tejido que queda en las vértebras o por encima de la duramadre en el espacio intravertebral.

El vaso sanguíneo dorsal ahora debería ser visible, marcando la línea media de la médula espinal. En el caso de las inyecciones unilaterales, realice una laminectomía parcial utilizando un taladro dental fino equipado con un cortador esférico de 0,5 milímetros para perforar con mucho cuidado un agujero en el centro del lado objetivo de las vértebras. Retire los fragmentos óseos restantes con una aguja biselada de calibre 26 para exponer la médula espinal.

Utilice la aguja para perforar la duramadre en los espacios intravertebrales rostral y caudal a las vértebras objetivo, aproximadamente 300 micras laterales al vaso sanguíneo dorsal. Luego, perfora la duramadre debajo del orificio perforado. En este punto, el líquido cefalorraquídeo debe escapar de los orificios y la médula espinal debe estar ligeramente abultada.

Prepare la jeringa de inyección montando primero el capilar de vidrio en una jeringa de microlitros. Apriete la tuerca firmemente para garantizar un ajuste apretado y seguro. Llene la jeringa de microlitros con agua destilada estéril, luego presione el émbolo.

Si el agua no se expulsa fácilmente de la punta, es probable que la micropipeta esté bloqueada y deba cambiarse. Monte la jeringa en un micromanipulador conectado a un microinyector controlado electrónicamente. A continuación, utilice el microinyector para extraer aproximadamente un microlitro de aire para separar el agua y el virus.

A continuación, pipetee una gota de 2,5 microlitros de solución viral diluida en un trozo de película de parafina. Mueva con cuidado la punta de la micropipeta dentro de la gota con el marco esterotáxico y extráigala hacia arriba en la micropipeta. Luego, presione dispensar hasta que emerja una gota de solución viral en la punta.

Retraiga la jeringa y utilice un bolígrafo para marcar la micropipeta con una escala para controlar el volumen dispensado. Utilice el brazo estereotáxico para mover la punta de la micropipeta sobre uno de los orificios de la duramadre y luego hacia abajo hasta que aparezca una ligera depresión en la superficie de la médula espinal expuesta. Para dirigir la inyección al asta dorsal espinal, mueva la punta hacia abajo a una profundidad de 500 micras en incrementos de 100 micras y luego hacia arriba 200 micras para permitir la estabilización mecánica del tejido.

La profundidad final de la punta es de 300 micras. Después de programar la bomba para inyectar 300 nanolitros a una velocidad de inyección de 50 nanolitros por minuto, presione el botón de inicio para comenzar la infusión. Una vez completada la inyección, compruebe la escala de la micropipeta para ver si el nivel del virus ha disminuido.

Deje la micropipeta en su lugar durante tres minutos más para permitir que la presión se equilibre. Después de tres minutos, retraiga lentamente la micropipeta y repita el procedimiento para los otros dos sitios de inyección. Después de la inyección final, retire las pinzas espinales y la almohadilla debajo del ratón.

Cerrar las capas de incisión con puntos interrumpidos, suturando las capas de tejido superficial con suturas reabsorbibles y la piel con suturas no reabsorbibles. Aplicar desinfectante de yodo sobre la herida suturada. Termine la anestesia y deje al animal en la estera térmica hasta que se recupere antes de devolverlo a su jaula de origen.

El tejido espinal en el lugar de la inyección se examinará al final del experimento. Esto es necesario para verificar el éxito de la inyección y la transducción y para excluir el daño tisular excesivo como resultado de la cirugía. Para ilustrar los niveles de expresión que se pueden obtener mediante la inyección intraespinal de AAV recombinante, se inyectó un virus que codifica la proteína fluorescente eGFP en la médula espinal lumbar de ratones de tipo salvaje.

Tres inyecciones espaciadas aproximadamente un milímetro produjeron una infección casi continua de los segmentos espinales lumbares L3 a L5. La inyección de virus a una profundidad de 300 micras desde la superficie espinal conduce a una infección predominante de las células en el asta dorsal de la médula espinal. Sin embargo, también se pueden encontrar células infectadas en el asta ventral. Se inyectó un vector flex dependiente de cre que expresa eGFP en la médula espinal de ratones transgénicos GlyT2:Cre.

Esto dio lugar a una expresión más restringida de eGFP que refleja la distribución de las neuronas GLYT2 positivas. Seguir este protocolo permitirá dirigirse a tres segmentos consecutivos de la columna vertebral. Encontramos que esto es suficiente para obtener resultados de comportamiento robustos.

Esta técnica permitirá estudiar la función de poblaciones específicas de neuronas y células y las vías sensoriales.