A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

El objetivo general de este procedimiento es utilizar imágenes de células vivas para evaluar las decisiones sobre el destino de las células después del tratamiento con el fármaco antimitótico paclitaxel. Este método nos permite visualizar cómo responden las células individuales a diferentes dosis del fármaco antimitótico paclitaxel. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una gran cantidad de información sobre células individuales o poblaciones enteras que no se puede obtener de imágenes de células fijas o ensayos basados en poblaciones.

Marc Vittoria, candidato a MD/PhD en el Laboratorio Ganem, demuestra este método. Para comenzar, limpie la parte inferior de vidrio de la placa de imágenes con un limpiador óptico para eliminar cualquier huella digital o polvo que pueda interferir con la imagen. Utilice suficiente limpiador óptico para humedecer toda la superficie del vidrio.

Coloque la antena con fondo de vidrio con células en la platina del microscopio en el adaptador de la antena para imágenes. Retire la tapa de plástico del plato y cubra el plato con una cámara con tapa de vidrio. Asegúrese de que la cámara tenga una válvula para permitir un flujo constante de aire que consta de un 5% de dióxido de carbono.

Para humidificar el 5% de dióxido de carbono, el gas fluye a través de tubos insertados en una carcasa de baño de agua estéril. Esto permite que el gas se equilibre al 95% de humedad. Inicie y calibre la etapa codificada utilizando el programa de software que controla el microscopio.

Esto garantizará coordenadas XY precisas y evitará la deriva focal. A continuación, realice la iluminación Kohler elevando el condensador y cerrando la apertura para que el campo quede oscuro. Baje el condensador hasta que se vea una forma hexagonal nítida de luz.

A continuación, utilice los tornillos de centrado para centrar el hexágono de luz en el campo de visión. Una vez que la forma hexagonal sea visible, abra la apertura hasta que se ilumine todo el campo de visión. Active el enfoque automático del microscopio para garantizar que todos los puntos se mantengan enfocados durante todo el experimento.

Utilice el software de adquisición para seleccionar varios campos de visión no superpuestos de cada pozo para la obtención de imágenes. Seleccione regiones de imagen en las que las células se hayan adherido bien al fondo de vidrio y estén entre un 50 y un 70% confluentes. Evite las áreas de células agrupadas, ya que esto dificultará el análisis posterior.

Para evaluar el destino de las células mitóticas, configure el software de imágenes para que recopile imágenes de cada campo de visión seleccionado cada 10 minutos durante un máximo de 96 horas. La mitosis no perturbada dura de 20 a 40 minutos y, por lo tanto, los intervalos de 10 minutos proporcionarán suficiente muestreo para identificar cuándo se dividen las células. Para identificar la ruptura nuclear, que es un evento transitorio, se adquieren imágenes cada cinco minutos.

Identificar las células que entran en mitosis mediante la observación del redondeo celular, utilizando óptica de contraste de fase, y/o condensación cromosómica, utilizando histona humana H2B fusionada con GFP. Tanto el redondeo celular como la condensación cromosómica se visualizan fácilmente a simple vista. Anote el momento en que la célula entra en mitosis.

Continúa rastreando la celda hasta que llegue a su destino. Las células de control deben alinear eficientemente sus cromosomas y entrar en anafase en una hora. Visualice la anafase mediante óptica de contraste de fase a medida que la célula comienza a dividirse en dos o mediante la visualización de cromosomas que se mueven hacia los polos marcados con H2B-GFP.

Anote el momento en que la célula se somete a anafase. Por el contrario, las células tratadas con paclitaxel permanecerán redondeadas con cromosomas condensados durante varias horas. Identificar las células mitóticamente detenidas que sufren muerte celular.

Las células que mueren durante la mitosis se visualizan mediante microscopía de contraste de fase, ya que las células se inflaman, se encogen y/o se rompen. Si se obtienen imágenes de H2B-GFP, los cromosomas también se fragmentarán durante la muerte celular. Identificar las células mitóticamente detenidas que sufren deslizamiento celular.

Las células que sufren un deslizamiento mitótico se observan mediante microscopía de contraste de fase, ya que se aplanan de nuevo en interfase y descondensan los cromosomas sin sufrir anafase. Estas células dan lugar a grandes células tetraploides que a menudo son multinucleadas. Continúe rastreando celdas desde el campo de visión original.

Una vez que se realiza el seguimiento de todo el campo de visión, muévase a un campo de visión separado adquirido del mismo pozo y continúe rastreando las celdas. Evaluar el destino de las células después del deslizamiento mitótico utilizando la línea celular epitelial pigmentada de retina no transformada y cromosómicamente estable que expresa el sistema FUCCI. Para confirmar que el sistema FUCCI funciona correctamente, valide que las células de control alternen la expresión de las proteínas fluorescentes rojas y verdes de manera adecuada a partir del análisis de los datos de imágenes de células vivas.

Las células de control deben pasar de exhibir una fluorescencia roja completamente nuclear a exhibir una fluorescencia verde completamente nuclear durante la interfase a medida que las células progresan de la fase G1 a la fase S. Las células deben continuar exhibiendo fluorescencia verde durante toda la mitosis. Inmediatamente después de la mitosis, las células deberían volver a exhibir fluorescencia completamente roja durante la interfase.

Identifique las células detenidas en la mitosis mediante microscopía de contraste de fase y realice un seguimiento de ellas hasta que sufran un deslizamiento mitótico. Las células que salen de la mitosis y vuelven a la interfase pasarán de exhibir fluorescencia verde durante la mitosis a fluorescencia roja durante la fase G1. Rastree estas células deslizadas utilizando contraste de fase e imágenes epifluorescentes a ojo para evaluar su destino celular.

Identificar las células que vuelven a entrar en el ciclo celular. Estas células se identifican por el cambio de rojo a verde en la expresión de fluorescencia utilizando el sistema FUCCI que indica la transición G1/S. Identificar las células que sufren la detención del ciclo celular G1.

Estas células se identifican por la expresión de fluorescencia roja que persiste durante más de 24 horas. Además, identifique las células que mueren en la interfase. Estas células se identifican por ruptura, formación de burbujas y encogimiento celular mediante imágenes de contraste de fase.

Visualice las celdas como antes. La señal de fluorescencia de la repetición del dímero en tándem de RFP fusionada con una señal de localización nuclear, o TDRFP-NLS, y H2B-GFP deben colocalizarse durante la interfase. La mitosis se visualiza mediante redondeo celular mediante óptica de fase y/o condensación cromosómica mediante H2B-GFP.

Tras la mitosis, la envoltura nuclear se romperá y la señal TDRFP-NLS se convertirá en citoplasmática. Después de la mitosis, la envoltura nuclear se reformará en las células hijas y la señal TDRFP-NLS se convertirá en nuclear. Realice un seguimiento de las células hijas a lo largo de la interfase posterior mediante imágenes de células vivas.

Identifique los eventos de ruptura nuclear mediante la observación de un estallido transitorio de TDRFP-NLS localizado nuclearmente en el citoplasma circundante. En cuestión de minutos, la envoltura nuclear será reparada y el TDRFP-NLS será relocalizado en el núcleo. Aquí se muestran imágenes representativas de una célula deslizada que se vuelve verde y entra en la fase S después de deslizarse del tratamiento con paclitaxel.

La mayoría de las células que se deslizaron del tratamiento con paclitaxel sufrieron un paro G1/G0 y permanecieron rojas durante más de 48 horas sin sufrir apoptosis. Las células que son rojas después del deslizamiento también sufrirán apoptosis, como se representa en esta imagen. La ruptura de la envoltura nuclear aumenta en las células tratadas con paclitaxel.

Las células TDRFP-NLS y H2B-GFP tratadas con paclitaxel de 10 nanomolares tienen una ruptura nuclear aumentada en la que la RFP se deslocalizará desde el núcleo hasta el citoplasma en las células en interfase. Después de ver este video, debe tener una comprensión sólida de cómo realizar imágenes de células vivas a largo plazo para evaluar el destino de las células en respuesta a diversos tratamientos farmacológicos.