Síntesis de nanotubos de carbono multipared modificados con nanopartículas de plata y la evaluación de sus actividades antibacterianas y propiedades citotóxicas

El objetivo general de este procedimiento es producir nanocomplejos antibacterianos que consisten en nanotubos de carbono con nanopartículas de plata sintetizadas en las superficies de los nanotubos. Este método se puede utilizar en el desarrollo de nuevos nanomateriales bacterianos que tengan una baja toxicidad para los seres humanos y, al mismo tiempo, fuertes propiedades sépticas para diversos tipos de bacterias y biopelículas. El protocolo describe la evaluación de nanocomplejos en la erradicación de bacterias manteniendo su biocomparabilidad con los humanos.

Para comenzar el procedimiento, coloque de 30 a 50 miligramos de MWCNT en un vial de 50 mililitros. Con una micropipeta provista de puntas de pipeta de un mililitro, añada lentamente ocho mililitros de una solución de tres a uno por volumen de ácido sulfúrico y ácido nítrico a los MWCNT. Espere 30 minutos a que finalice la reacción exotérmica, luego sonique la solución a 60 a 80 grados centígrados y 160 vatios hasta que los MWCNT se asienten en el fondo del vial. lo que suele tardar alrededor de una hora.

Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga. Use una micropipeta para agregar cuidadosamente 30 mililitros de agua destilada gota a gota a los MWCNT funcionalizados con ácido carboxílico, haciendo una pausa para permitir que la mezcla se enfríe según sea necesario. A continuación, centrifugar la mezcla a 12.000 g durante 15 minutos.

Retire el sobrenadante con una pipeta equipada con una punta de pipeta de un mililitro. Agregue cinco mililitros de etanol al sólido y enjuague las paredes del vial con etanol adicional. Vuelva a centrifugar la mezcla con los mismos ajustes y compruebe el pH del sobrenadante con papel de pH.

Continúe lavando los sólidos por centrifugación en etanol hasta que el pH del sobrenadante sea neutro, luego retire el sobrenadante y agregue un mililitro de agua destilada al precipitado. Disperse los MWCNT funcionalizados con ácido carboxílico en el agua y liofilice la dispersión a menos 60 grados centígrados al vacío. Coloque 10 miligramos de MWCNT funcionalizados con ácido carboxílico liofilizado en un tubo centrífugo cónico de 50 mililitros.

Agrega 30 mililitros de agua destilada al tubo. Combine seis mililitros de nitrato de plata normal 0.1 y 18 mililitros de agua destilada en otro tubo cónico de 50 mililitros. Sonicar ambas mezclas a 60 grados centígrados y 160 vatios durante una hora.

A continuación, mientras se sigue sonicando la dispersión del MWCNT a 60 grados centígrados y 160 vatios, se añade la solución de nitrato de plata gota a gota a la dispersión del MWCNT utilizando una pipeta equipada con una punta de pipeta de un mililitro. Una vez completada la adición, continúe sonicando la mezcla durante una hora, luego centrifugue la mezcla durante 15 minutos a 12.000 G a temperatura ambiente y retire el sobrenadante. Vuelva a dispersar los MWCNT de plata en 30 mililitros de agua destilada por sonicación a 24 grados centígrados durante 30 minutos.

Repetir la centrifugación en 30 mililitros de agua destilada y eliminar el sobrenadante dos veces. A continuación, disperse los MWCNT de plata lavada en un mililitro de agua destilada por sonicación durante cinco minutos. Agregue cinco mililitros de etanol a la dispersión y revuelva la mezcla a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, centrifugar la mezcla durante 15 minutos a 12.000 G a temperatura ambiente y comprobar el pH del sobrenadante. Retire el sobrenadante y vuelva a dispersar la mezcla en cinco mililitros de etanol por vórtice. Continúe lavando el precipitado en etanol por centrifugación hasta que el pH del sobrenadante sea neutro.

Finalmente, disperse los MWCNT de plata lavados en un mililitro de agua destilada. Liofiliza la dispersión a menos 70 grados centígrados al vacío durante 24 horas y almacena la dispersión en un recipiente sellado. Para comenzar a preparar la prueba, mezcle y autoclave 18,12 gramos de agar R2A y un litro de agua destilada.

Deje que el gel se enfríe a temperatura ambiente. Cuando el gel esté listo para verter, coloque 10 mililitros de gel en placas de Petri de 90 milímetros y deje que el agar se endurezca. En una campana extractora, use un asa y una aguja esterilizadas en llama de alcohol para rayar 100 microlitros de una mezcla de especies de metilobacterias en la superficie del medio de cultivo.

Incubar los platos a 30 grados centígrados durante 48 horas, luego mezclar 3,12 gramos de caldo R2A con un litro de agua destilada y esterilizar el medio en autoclave a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Use un asa y una aguja esterilizados para transferir las colonias al medio de crecimiento R2A. Incubar la muestra en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 180 RPM.

Mida la densidad óptica a 600 nanómetros por hora hasta que la densidad óptica sea superior a 0,7. A continuación, prepare otra placa de Petri que contenga 10 mililitros de agar R2A. A continuación, mezcle 3,12 gramos de caldo R2A y ocho gramos de agar con un litro de agua destilada.

Esterilizar la mezcla en autoclave a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Mezcle 100 microlitros del cultivo de metilobacteria en la mezcla de agar. Vierta 10 mililitros del gel que contiene metilobacterias sobre la capa inferior de agar R2A en la placa de Petri, luego prepare una dispersión de la concentración deseada de MWCNT de plata liofilizada en agua destilada.

Utilice una micropipeta para cargar 50 microlitros de esta dispersión en un disco de papel estéril de seis por un milímetro. Aplique agua destilada a otro disco de papel estéril como control. Seque y esterilice ambos discos en una cámara de vacío bajo luz ultravioleta durante 30 minutos.

A continuación, coloque la muestra de plata MWCNT y el control en el agar e incube la placa de agar a 30 grados centígrados durante 48 horas. Mida la zona de inhibición alrededor de la muestra de plata MWCNT cuando termine. Antes de la prueba, autoclave el agua destilada triple a 121 grados centígrados durante 15 minutos.

Prepare una dispersión de 1000 microgramos por mililitro de MWCNT funcionalizados con ácido carboxílico y dispersiones de 50 microgramos por mililitro, 40 microgramos por mililitro y 30 microgramos por mililitro de MWCNT de plata en esta agua estéril. Para comenzar el procedimiento de prueba antibacteriana, prepare un cultivo de metilobacteria como se describió anteriormente y controle su densidad óptica a 600 nanómetros. Cuando la densidad óptica esté al máximo, inocular 100 microlitros del cultivo de metilobacterias en tres mililitros de medio de cultivo R2A fresco.

Coloque 500 microlitros de esta solución en cada uno de los cinco tubos cónicos de 15 mililitros. Agregue 100 microlitros de metanol a uno de los tubos para preparar la muestra de referencia de metanol. Prepare una muestra para cada una de las cuatro dispersiones de la misma manera.

Incubar las muestras y el cultivo de control de metilobacterias restantes a 180 RPM y 30 grados centígrados hasta que la densidad óptica del control indique la actividad máxima. Utilice un esparcidor esterilizado para esparcir cada muestra en gel de agar R2A sólido en placas de Petri. Incubar los platos a 30 grados centígrados durante 48 horas.

Contar las colonias bacterianas resultantes y determinar la concentración mínima de bactericida. Los MWCNT de plata se sintetizaron con éxito utilizando el procedimiento descrito. El tamaño promedio de partícula de plata depositada fue de aproximadamente 3,83 nanómetros.

No se observó crecimiento de Methylobacterium cuando se cultivó con dispersiones de 50 microgramos por mililitro o 40 microgramos por mililitro de MWCNT de plata. La población bacteriana se redujo 100.000 veces en relación con la muestra de control cuando se cultivó con una dispersión de 30 microgramos por mililitro de MWCNT de plata. Se observó una zona de inhibición alrededor de una muestra preparada a partir de una dispersión de 10 microgramos por mililitro de MWCNT de plata.

No se observó ninguna zona de inhibición para una muestra preparada a partir de una dispersión de un microgramo por mililitro. Se observó cierta citotoxicidad cuando se añadió una dispersión de 40 microgramos por mililitro de MWCNT de plata. No se observó citotoxicidad significativa cuando se añadió una dispersión de 30 microgramos por mililitro.

Un ensayo de azul de tripano confirmó que había una citotoxicidad mínima cuando se añadió una dispersión de 30 microgramos por mililitro de MWCNT de plata. Este protocolo ayudaría a los investigadores en la preparación de nanocomplejos que tengan nanopartículas metálicas que actúen directamente sobre los nanomateriales de carbono. Siguiendo este protocolo, los investigadores también podrían evaluar las propiedades antibacterianas de los nanocomplejos preparados.