Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos

El objetivo general de este método experimental es probar el papel de los plásmidos multicopia en la evolución de la resistencia a los antibióticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como el papel de los plásmidos multicopia en la evolución de las innovaciones bacterianas. La principal ventaja de esta técnica es que solo requiere métodos básicos de biología molecular y un diseño experimental sencillo.

Es realmente genial. En primer lugar, construya la cepa de E. coli MG1655 que llevará el gen de resistencia de anticuerpos en el cromosoma del fago lambda en el lado de la ecuación ATTB. Para ello, la PCR amplifica las 500 regiones paralargas de base a ambos lados del sitio ATTB.

Luego, la PCR amplifica el gen de resistencia a los antibióticos. A continuación, utilice el ensamblaje isotérmico a 50 grados centígrados durante 30 minutos para fusionar las regiones de homología con el producto de PCR. Después del ensamblaje isotérmico, transfiera un microlitro del producto a 40 microlitros de celdas MG1655 electrocompetentes en una cubeta de dos milímetros.

A continuación, electropore las células a 4 grados centígrados y 2,5 kilovoltios. Después de la electroporación, transfiera las células en un mililitro de caldo LB con 0,2% de arabinosa. A continuación, pipetea el caldo LB que contiene células en un tubo de microfuga.

Agite el tubo intensamente durante dos horas a 30 grados centígrados. Después de dos horas, coloque 100 microlitros del cultivo en la placa de agar LB, suplementada con antibióticos. A continuación, gira hacia abajo las celdas restantes.

Y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de caldo LB fresco. Vuelva a colocar estas células en otra placa de agar LB. Luego incube las placas a 42 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, la PCR amplificó los clones para verificar la construcción utilizando los cebadores externos ybhC extern e ybhB extern. A continuación, confirme el tamaño del amplicón a través de la electroforesis de la cáscara de agarosa. Paralelamente, realice la secuenciación del ADN para verificar la secuencia del gen insertado.

Para construir la cepa que porte el gen de resistencia de anticuerpos en el plásmido multicopia, primero se amplifica en PCR el gen de resistencia a antibióticos blaTEM-1. Una vez completada la PCR, fosforilar el producto amplificado utilizando la polinucleótido quinasa T4. A continuación, utilice la polimerasa de alta fidelidad y los oligonucleótidos PBAD FINV y PBAD RINV para amplificar por PCR la columna vertebral del plásmido PBAD.

A continuación, ligar los dos fragmentos de PCR con ligasa T4. A continuación, electroporar 40 microlitros de pilas alfa DH5 con 1 microlitro del producto de ligadura. A continuación, seleccione el antibiótico adecuado para el gen de resistencia a los antibióticos y la columna vertebral del plásmido en las placas de agar.

A continuación, realice la extracción de plásmidos con un kit de extracción de ADN, siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, realice la secuenciación del gen de resistencia de interés para confirmar la ausencia de posibles mutaciones antes de los experimentos de evolución. Después de la verificación de la secuencia, electroporar el plásmido en la cepa de E. coli MG1655 para obtener finalmente el plásmido portador de la cepa MG1655.

Los pasos más críticos de este protocolo son la construcción de las cepas de los sistemas modelo y la reconstrucción de las mutaciones observadas durante la evolución experimental. En primer lugar, raye las cepas MG1655 de interés en las placas de agar LB. Luego agregue 200 microlitros de medio LB en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

A continuación, inocular 48 colonias aisladas de cada cepa en pocillos individuales de la placa. Después de la inoculación, incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados en un agitador a 200 revoluciones por minuto. Una vez más, inocule dos microlitros del cultivo de cada pocillo con la población fundadora en una nueva placa de 96 pocillos con 198 microlitros de medio LB en pocillos individuales.

Esto iniciará el experimento de rescate evolutivo. Incubar la placa a 37 grados centígrados en un agitador a 200 revoluciones por minuto durante 20 horas. Cada día, duplique la concentración del antibiótico con respecto al día anterior.

Al día siguiente, transfiera 2 microlitros del cultivo respectivo a una placa fresca de 96 pocillos y continúe esto todos los días. Registre la lectura de densidad óptica a 600 nanómetros de los pocillos individuales en un lector de placas. Un paso crítico del protocolo es la evolución experimental y el aumento de las concentraciones de antibióticos.

La tasa de cambio de las concentraciones de antibióticos es uno de los parámetros que se pueden modificar para promover la evolución de la resistencia a los antibióticos. Nuevamente, incube la placa a 37 grados centígrados en un agitador a 200 revoluciones por minuto durante 20 horas. A continuación, mida la lectura de densidad óptica a 600 nanómetros para cada población superviviente todos los días en el lector de placas.

Congele las poblaciones periódicamente, cada tres a cinco días. Extraer el ADN total de las poblaciones evolucionadas y de los clones de diferentes cepas y tratamientos. A continuación, mida las relaciones de absorbancia a 260:280 y 260:230 nanómetros en el espectrofotómetro para determinar la calidad del ADN.

A continuación, utilice un tinte fluorescente de unión al ADN y confirme la concentración del ADN midiendo la fluorescencia en el lector de placas. Además, someta el ADN a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que no hay degradación del ADN ni contaminación por ARN. A continuación, se realiza una secuenciación profunda del ADN con muestras obtenidas de poblaciones enteras y clones individuales para estudiar las bases genéticas de la resistencia a los antibióticos.

Este estudio es un ejemplo de los posibles resultados del sistema experimental utilizando tres cepas de E. coli. Estas cepas son la E. coli MG1655, MG1655 portadora del gen de resistencia en el cromosoma MG1655 resA y MG1655 portadora del gen de resistencia en el plásmido multicopia, MG1655 pRESA. Los antibióticos utilizados son ceftazidima y meropenem.

Este panel de la izquierda muestra las curvas de supervivencia bajo concentraciones crecientes de ceftazidima. A partir del gráfico, está claro que el subconjunto de la población de la cepa MG1655 pRESA puede crecer más allá de los 14 días, incluso después de duplicar la concentración de ceftazidima cada día. Por el contrario, las otras cepas no sobreviven más de 8 días cuando se exponen a concentraciones similares de ceftazidima.

Sin embargo, las mismas cepas no muestran diferencias significativas en el período de supervivencia cuando se exponen a una concentración similar de otro antibiótico, el meropenem. Las tres cepas sobreviven solo entre 6 y 8 días cuando se exponen al meropenem. Esto indica que la presencia del gen resA en el plásmido multicopia potencia la evolución de la resistencia frente a la ceftazidima pero no al meropenem.

Una vez dominado, el protocolo experimental completo se puede realizar en unas pocas semanas si se hace correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar el papel de los plásmidos multicopia en la evolución de las innovaciones en las bacterias.