Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis
March 14th, 2018
Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.
El objetivo general de este método es marcar y visualizar cromosomas vivos en células mitóticas utilizando la etiqueta Histone 2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopía confocal de disco giratorio. Este método se puede utilizar para visualizar cromosomas mitóticos en células cultivadas para estudiar los efectos de las modificaciones genéticas o los tratamientos farmacológicos en la segregación cromosómica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método fácil y conveniente para etiquetar y visualizar cromosomas vivos en células mitóticas.
El Dr. Kazuyo Takeda, quien mantiene el Centro de Microscopía e Imágenes en la División de Productos Virales del Centro de Evaluación e Investigación Biológica de la FDA, demostrará el procedimiento de imágenes en vivo. Los fibroblastos embrionarios de ratón, o MEF, utilizados en este experimento se cultivan en un cubreobjetos de dos cámaras a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante la noche, como se describe en el protocolo de texto. Al día siguiente, sincronice los MEFs en la fase G0/G1 incubándolos en un medio de crecimiento DMEM/F12 que contenga 0,1% de FBS.
El día del etiquetado, prepare una solución madre de 1,5 miligramos por mililitro de nocodazol en DMSO. Un paso crítico es calcular la cantidad correcta de partículas de CL-HB por célula para lograr un marcaje suficiente para la visualización de cromosomas sin toxicidad para las células. Hemos determinado previamente, mediante experimentos de valoración, que 30 PPC funcionan mejor.
Agregue a los MEF, 200 microlitros de medio de crecimiento con 10% de FCS, 200 nanogramos por mililitro de nocodazol y reactivo CL-HB a 30 partículas por celda. Incubar los MEFs a 37 grados centígrados y 5%CO2 durante 18 horas. La visualización de los MEFs se realiza utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio equipado con una cámara ambiental y una lente de objetivo de inmersión en aceite de 63X.
Un día antes de la toma de imágenes, encienda la cámara ambiental y caliente toda la cámara a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, encienda el soporte del microscopio, la cámara, la unidad de disco giratorio, el iluminador, el láser de argón, la computadora y la platina motorizada. Después de dejar que el sistema se caliente durante tres minutos, encienda el láser de argón encendiendo la llave de encendido.
Cambie el interruptor de palanca para el láser de argón de modo de espera a funcionamiento del láser. Inicie el software de adquisición y procesamiento de datos. Inicie el controlador de CO2 para la incubadora superior de la etapa y establezca la concentración de CO2 en 5%Retire la cubierta de vidrio con cámara de la incubadora, colóquela en la etapa del microscopio y seleccione la lente del objetivo de inmersión en aceite 63X.
Observe a través de las lentes oculares, enfoque la imagen e identifique una célula en la etapa de ruptura de la envoltura nuclear, o NEBD. Inicie el láser de argón de 488 nanómetros para visualizar Histone 2B-GFP. Abra la ventana de control de adquisición y establezca el tiempo de exposición para el canal GFP.
Identifique una celda que esté en NEBD. A continuación, determine manualmente el plano focal superior e inferior de la célula e introduzca la configuración de seccionamiento óptico XYZ. Observe la celda durante 20 minutos.
Es importante tener en cuenta que, dado que no todas las células pasarán por la mitosis, el progreso mitótico debe ser monitoreado activamente. Si la célula no continúa a través de la división celular después de 20 minutos, detenga la adquisición de imágenes y pase a la siguiente célula que esté en NEBD. Para obtener datos para una película, tome fotografías cada tres minutos.
Se necesita aproximadamente una hora por célula para obtener imágenes de los cromosomas rezagados durante la mitosis en las células PP2A-B56-gamma que escaparon del punto de control del ensamblaje del huso. Guarde las imágenes en formato de archivo ZVI para su posterior análisis. Se utilizaron imágenes de células vivas para visualizar el destino de las células individuales a medida que progresaban desde la NEBD hasta la mitosis.
Después del tratamiento con nocodizazol, las 21 células de tipo salvaje observadas se detuvieron en la metafase. Por el contrario, de las 21 células que carecían de PP2A-B56-gamma observadas, 16 pudieron pasar por mitosis después del tratamiento con nocodashol. Además, se detectó una segregación cromosómica anormal en 13 de esos MEF.
En este videoclip se muestra un ejemplo de una célula PP2A-B56-gamma sometida a una segregación cromosómica incorrecta. Una vez dominada, esta técnica tardará de tres a cuatro días, dependiendo del tratamiento celular previo al protocolo de etiquetado. Es importante recordar que se trata de una transfección transitoria y las señales solo se pueden detectar hasta cinco días.
Este protocolo se puede utilizar para responder preguntas adicionales relacionadas con la regulación del ciclo celular, la inestabilidad genómica y la calidad de los productos de terapia celular. Después de su desarrollo, esta técnica podría usarse para estudiar imágenes en vivo de cromosomas en una amplia variedad de líneas celulares, como líneas celulares primarias, células madre, neuronas y células T inmortalizadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y visualizar fácilmente los cromosomas vivos en las células mitóticas utilizando la etiqueta Histone 2B-GFP BacMam 2 y un sistema de microscopía confocal de disco giratorio.
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Visión general
Este protocolo describe un método para etiquetar y visualizar cromosomas vivos en células mitóticas utilizando Histone2B-GFP BacMam 2.0 y microscopía confocal de disco giratorio. Esta técnica permite a los investigadores estudiar la segregación cromosómica en células cultivadas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Microscopía
- Dinámica cromosómica
Antecedentes
- Las imágenes en vivo de los cromosomas son cruciales para entender la mitosis.
- Histone2B-GFP proporciona un marcador fluorescente para la visualización.
- La microscopía confocal de disco giratorio mejora la calidad de las imágenes.
- Este método puede aplicarse a varios estudios genéticos y farmacológicos.
Propósito del estudio
- Visualizar cromosomas vivos durante la mitosis.
- Evaluar el impacto de las modificaciones genéticas en el comportamiento cromosómico.
- Evaluar los efectos de los fármacos en la segregación cromosómica.
Métodos utilizados
- Etiquetado de cromosomas con Histone2B-GFP BacMam 2.0.
- Uso de microscopía confocal de disco giratorio para la obtención de imágenes.
- Sincronización de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) en la fase G0/G1.
- Incubación de MEFs en condiciones específicas de medio de crecimiento.
Resultados principales
- Etiquetado exitoso de cromosomas vivos en MEFs mitóticos.
- Visualización clara de la dinámica cromosómica durante la división celular.
- Demostración de la facilidad y conveniencia del método.
- Aplicaciones potenciales en estudios genéticos y de tratamiento con fármacos.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque confiable para la obtención de imágenes de cromosomas vivos.
- Facilita el estudio del comportamiento cromosómico en varias condiciones.
- La técnica es accesible para los investigadores en biología celular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Live chromosome imaging enables direct observation of mitotic fidelity, a critical determinant of genomic stability in cell-based therapies and disease models. By visualizing lagging chromosomes and segregation errors in real time, this method supports mechanistic de-risking of targets involved in cell cycle control, such as phosphatases and checkpoint regulators. The approach provides predictive confidence in assessing chromosomal integrity, informing go/no-go decisions in preclinical development and cell therapy manufacturing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking phosphatase activity to spindle assembly checkpoint function and chromosomal segregation fidelity.
- Operational Value: Enables functional validation of targets like PP2A-B56γ through direct phenotypic readout of mitotic progression and error rates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved data on chromosome lagging and mis-segregation as phenotypic endpoints for compound or genetic screening.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows with reproducible transfection, synchronization, and imaging parameters for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitotic defects to genomic instability, supporting translational biomarker relevance in cancer and cell therapy quality assessment.
- Operational Value: Enables continuity from target discovery through preclinical validation by monitoring chromosomal fidelity across genetic backgrounds and treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, where chromosomal segregation serves as a functional readout of pathway activity and cellular health.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase/phosphatase networks in mitotic control by visualizing downstream chromosomal consequences.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on mitotic progression and error frequency to compare genetic or drug-induced conditions.
- Analytics: Enables measurement of lagging chromosomes and mitotic duration as statistical readouts for comparing experimental groups.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical relevance by associating segregation errors with genomic instability in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across cell lines, genetic models, and treatment paradigms for sustained discovery value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanistic links between cell cycle regulators and chromosomal fidelity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging with defined transfection, synchronization, and microscopy parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying chromosomal error rates that correlate with genomic instability and transformation risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their impact on mitotic fidelity and downstream genomic integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, transfection, and mitotic cell synchronization.
- Dependent on spinning disc confocal microscopy with environmental control and appropriate objectives.
- Necessitates standardization of transfection efficiency, nocodazole dosing, and imaging duration across experiments.
- Adaptation to primary or stem cells may require optimization of BacMam toxicity and expression levels.
- Limited by transient expression window (up to five days), constraining longitudinal studies.
