Name: Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprende a visualizar cromosomas vivos durante la mitosis en fibroblastos embrionarios de ratón usando Histone2B-GFP y microscopía confocal de disco giratorio. Este método facilita el estudio de la segregación cromosómica en biología celular.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Guo-Chiuan Hung y Dr. Bharatkumar Joshi valiosos comentarios que mejoraron el manuscrito.

Todos los experimentos llevados a cabo en estos estudios fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de investigación de alimentos y drogas (FDA).
1. aislamiento y cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
<ol><li>Aislar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de una cepa de PP2A-B56γ-ratón y hermanos de camada de tipo salvaje por protocolo estándar 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs para 3 pasajes, congelar y almacenar hasta que se necesite para experimentos 8.</li>
</ol>2. cultivo de Mefs en pozo 2 cámaras del vidrio para vivir imágenes
<ol><li>Preparar 500 mL de medio de crecimiento de MEF con medio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM/F12) con 10% suero bovino Fetal (FBS), antibióticos de penicilina/estreptomicina X 1, L-glutamina (200 mM) y 1 X aminoácidos no esenciales (AANE) en una botella de 500 mL de media.</li>
	<li>Descongelar los frascos de MEFs congelados de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones en el paso 3 en el baño de agua precalentada a 37 ° C.</li>
	<li>Transferencia de MEFs descongeladas para tubos de 15 mL y añada lentamente gota a gota 20 mL de medio DMEM/F12 en los tubos de 15 mL con una pipeta de 10 mL.</li>
	<li>Transferencia de MEFs junto con 20 mL de DMEM/F12 medios de cultivo en matraces T75 y expandirlos hasta que las células son confluentes de 70%. Confluencia se estima usando un microscopio inverso a x 4 o 10 aumentos.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo utilizando un Potrero de vidrio pipeta conectada a un sistema de vacío en la campana, añadir 3 mL de 0.25% tripsina/EDTA e incubar a 37 ° C por 5 minutos agregar 3 mL de medio de cultivo DMEM/F12 para detener la reacción.</li>
	<li>Centrifugar las células a baja velocidad (300 x g) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de medio de cultivo DMEM/F12 calentado previamente a 37 ° C en un baño de agua.</li>
	<li>Enumerar las células mediante el método de exclusión azul de tripano u otro celular apropiado contar método 8.</li>
	<li>Aproximadamente 20.000 MEFs/pozo en un pozo de 2 cámara cristal de la semilla. Añadir 200 μL/pocillo de medio de cultivo DMEM/F12 y dejar las células a conectarles incubando toda la noche a 37 ° C y 5% CO2.</li>
</ol>3. sincronización
<ol><li>Sincronizar MEFs en fase G0/G1 por incubando las células en medios de cultivo DMEM/F12 que contiene 0.1% FBS durante 24 h, para obtener un número máximo de células en fase G0/G1. Nota: Aunque hambre de suero se utilizó como método de preferencia, varios otros métodos pueden utilizarse dependiendo de la etapa mitótica en la que las células se necesitan para ser arrestado 10.</li>
</ol>4. etiquetado
<ol><li>Prepare solución de nocodazole en DMSO con 1,5 mg/mL. Nocodazole detiene las células en fase G2/M mediante la inhibición de la formación de microtúbulos 10.</li>
	<li>Tres días post sincronización, añadir 200 μL de medio de cultivo (con 10% FCS) y 200 ng/mL nocodazole regente CL-HB (histona 2B-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Calcular al regente CL-HB partículas por célula (PPC) que se añade a las células como sigue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> Donde el número de células es el número total estimado de células en el momento del etiquetado, PPC es el número de partículas por célula, y 1 × 108 es el número de partículas por mL de reactivo. Por ejemplo, a las células de etiqueta 20.000 con un PPC de 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> Nota: Regente de CL-HB funciona con más tipos de células entre 10 y 50 de la PPC. Sin embargo, PPC 30 trabajado mejor para este estudio.</li>
	<li>Incubar MEFs durante 18 h a 37 ° C y 5% CO2. Nota: Para el experimento actual, visualización de los cromosomas en las células mitotic escapar el puesto de control de ensamblaje del huso produjo 18 h después de la detención del ciclo celular con nocodazole.</li>
</ol>5. visualización de los cromosomas del revestimiento
<ol><li>Visualizar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) utilizando un sistema de microscopio confocal spinning disco equipado con una cámara y una inmersión de aceite, 63 x objetivo.<ol>
<li>Uso de longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda 450 nm de emisión para la adquisición de imagen de canal GFP.</li>
		<li>Usar un sistema de microscopio confocal de disco giratorio con la capacidad de etapas exploración motorizadas, Z Piezo insertos, incubación de etapa superior y recuperación de fluorescencia directa tras foto blanqueo para esta técnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un día antes de la proyección de imagen, encienda la cámara y calentar toda la cámara a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Encienda el microscopio, cámara, unidad de disco de hilatura, iluminador, láser de argón, computadora y etapa motorizada.</li>
	<li>Deje que el sistema caliente durante 3 minutos; activar el láser de argón girando en llave de encendido. El interruptor de palanca para el laser de argón de "standby" a "funcionamiento del laser".</li>
	<li>Inicie el software de adquisición y procesamiento de datos.</li>
	<li>Iniciar el controlador de CO2 para la incubadora de etapa superior y establecer la concentración de CO2 al 5%. Esto debe hacerse antes del comienzo de la proyección de imagen.</li>
	<li>Quitar el vidrio de cubierta de cámara de la incubadora y el lugar en el escenario para la visualización. Visualizar las células por medio de un aceite inmersión 63 x objetivo (NA1.4).</li>
	<li>Ve a través de las lentes oculares, enfocar la imagen e identificar una célula en etapa de descomposición (NEBD) envoltura nuclear.</li>
	<li>Iniciar el láser apropiado (488 nm láser de argón para visualizar Histone2B-GFP).</li>
	<li>Abrir la ventana de control de adquisición y establecer el tiempo de exposición para el canal GFP. Identificar una célula que se encuentra en NEBD.<ol>
<li>Manualmente determinar la parte superior de la celda objetivo y plano focal inferior y entrar en el sección configuración óptico xyz.</li>
		<li>Observar durante 20 min; Si la célula no procede a través de la división celular, deje de adquisición de imágenes después de 20 minutos y pasar a la siguiente celda que se encuentra en NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aproximadamente 1 h por celda es necesario para los cromosomas de revestimiento de la imagen durante la mitosis en PP2A-B56γ-células que escaparon de la SAC. Para obtener datos de una película, tomar fotos cada 3 minutos. Nota: las células de tipo salvaje arrestaron y no avanzar más allá de NEBD cuando se tratan con nocodazole.</li>
	<li>Guardar imágenes en formato de archivo de zvi para su posterior análisis.</li>
</ol>6. procesamiento y análisis de imágenes
Nota: Ejecutar el procesamiento de imagen tridimensional y análisis utilizando cualquier software disponible como Axiovision versión 4.8.2 o Imaris versión 8.2. Para este estudio el ImageJ se utilizó el software.
<ol><li>Abra la secuencia de imágenes. Si las imágenes ya están en un formato apilado, proceder al siguiente paso. Si no, combinar todas las imágenes relevantes en un pila utilizando ' imagen &gt; pilas &gt; pila de imágenes ' en la barra de menús.</li>
	<li>Realizar cualquier ajuste necesario a brillo/contraste y niveles.</li>
	<li>Para agregar un sello de tiempo a la película:<ol>
<li>Vaya a ' imagen &gt; pilas &gt; etiqueta...' en la barra de menús.</li>
		<li>Seleccione el formato adecuado, el valor inicial de tiempo y el intervalo de tiempo entre cada imagen.</li>
		<li>Marque la casilla 'Vista previa' y ajustar la configuración de la ubicación y formato. Pulse 'Aceptar' para aplicar la marca de tiempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para agregar una barra de escala a la película:<ol>
<li>La imagen escala bajo ' Analyze &gt; Set escala ' en la barra de menús.</li>
		<li>En el campo de la 'Distancia en píxeles', introduzca un número de píxeles que se conoce la distancia y en el campo de la 'Distancia de la conocida' ingrese la distancia. Establece la unidad correcta de la longitud de la distancia, por ejemplo, en μm. Pulse 'Aceptar' para aplicar la escala a la pila.</li>
		<li>Ir a ' Analyze &gt; Herramientas &gt; escala bar... ' para agregar la barra de escala. El tamaño de la barra como 'En μm de ancho' y ajuste el resto de opciones según sea el caso de formato. Marque la casilla 'Todos los sectores de la etiqueta' para agregar la barra de escala a toda la pila.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Previsualizar la película haciendo clic en el botón play triangular en la parte inferior izquierda el borde de la ventana de imagen. Ajustar la tasa de marco con ' imagen &gt; pilas &gt; Animación &gt; animación opciones en la barra de menús.</li>
	<li>Exportar el archivo de película seleccionando ' archivo &gt; Guardar como &gt; AVI...' y seleccione la velocidad de fotogramas y la compresión.</li>
	<li>Pulse 'Aceptar' para seleccionar el guardar ubicación y nombre de archivo. Pulse 'Guardar' para guardar el archivo de película.</li>
</ol>

<ol><li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+CIN%3A+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li>
<li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+issues%3A+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li>
<li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+and+cancer%3A+cutting+through+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li>
<li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li>
<li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+phosphatase+2A+B56%CE%B3+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A-B56%CE%B3+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).</li>
<li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26904940">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li>
<li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+%28hPrm1%29+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li>
<li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine%3A+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Puestos de control del ciclo celular que garanticen la segregación cromosómica precisa evitar aneuploide y celular transformación 1,2,3. En el presente estudio, encontramos que la inactivación de PP2A-B56γ resultó en un puesto de control de montaje de husillo debilitado. Celular directo imágenes nos permitieron observar la segregación errores cromosómica durante la mitosis en la MEFs de PP2A-B56γ tratados con nocodazole <sup cla...

En el siguiente protocolo, describimos un método conveniente para visualizar la segregación cromosómica y la progresión mitótica durante el ciclo celular en fibroblastos embrionarios de ratón usando histona 2B-GFP, etiquetado BacMam 2.0 y proyección de imagen de células vivas.
Puestos de control de ciclo celular monitor segregación cromosómica y juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad genética de la célula 1,2,3. Acumulación de los cromosomas segregados mal puede llevar a aneuploidía, que es una característica de los tumores sólidos más 4. Por lo tanto, la detección de los cromosomas del revestimiento puede utilizarse como un método para el estudio de inestabilidad cromosómica.
Etiquetado fluorescente proteínas pueden ser utilizado para visualizar segregación cromosómica vivo y cromosomas rezagados pero la generación de etiquetas mCherry o proteína H2B-GFP etiquetado requiere conocimiento substancial del gene entrega y biología molecular 5. Aquí describimos el uso del reactivo de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, regente de CL-HB, por simplicidad en lo sucesivo. Este reactivo puede utilizarse inmediatamente y elimina así las preocupaciones sobre la integridad y calidad de vector. Además, este reactivo no requiere el uso de tratamientos potencialmente dañinos o lípidos y productos químicos del colorante de carga. A diferencia de las etiquetas fluorescentes convencionales, el regente de la CL-HB manchas independientemente de la función (es decir., potencial de membrana). El regente CL-HB puede ser simplemente añadido a las células y se incubó toda la noche para la expresión de la proteína. El regente de la CL-HB no se replica en células de mamíferos y puede ser utilizado en la configuración de nivel de bioseguridad (BSL) 1 laboratorio. También, se puede detectar esta transfección transitoria después de la incubación durante la noche durante 5 días, tiempo suficiente para llevar a cabo análisis celulares más dinámico.
Por otra parte, anomalías cromosómicas podrían ser estudiados por varias técnicas como la citometría de flujo, inmunohistoquímica o fluorescencia in situ hibridación (pescado) 6. Citometría de flujo puede utilizarse para el estudio de la aneuploidía, que puede ser medido basado en contenido de ADN y la fase de células en ciclo celular. Aunque citometría de flujo puede utilizarse para medir aneuploidía, no proporciona información sobre segregación de errores cromosómica. PESCADO con técnicas de inmunohistoquímica utilizan sondas fluorescentes para obligar a ADN o los cromosomas. Mientras que estas técnicas proporcionan una instantánea de la situación de una población de células, no permiten el vivo de la célula de tal modo que falta cualquier información obtenida a través de la visualización espaciotemporal de citocinesis en células específicas durante un período de tiempo.
Este protocolo fue utilizado para estudiar los cromosomas de revestimiento o segregación errónea cromosómica en fibroblastos embrionarios de nocodazole tratado ratón (MEFs) aislado de PP2A-B56γ-ratones. Además de la anterior aplicación, este protocolo proporciona una herramienta sencilla para marcar y visualizar la segregación cromosómica en diversos tipos celulares que pueden utilizarse para estudiar la regulación del ciclo celular o inestabilidad cromosómica en las células del tumor. Además, también puede utilizado para el estudio de inestabilidad cromosómica causada por varios tratamientos con fármacos o para estudiar los efectos del gen golpee hacia fuera dando por resultado la segregación cromosómica de mal.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato Solución salina tamponada</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Cajas de almacenamiento de viales criogénicos</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>Matraces T75</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 cubreobjetos de cámara</td><td>bien Cunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer Disco giratorio Sistema de microscopio confocal</td><td>Carl Zeiss Microscopía</td><td>Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Thermoscientific</td><td>280 series</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Sanyo soluciones comerciales</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Clase II Cabina de seguridad biológica</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Software Axiovision</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la mitosis

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Los cromosomas deben ser fiable y uniforme separados en células de la hija durante la división celular mitótica. Fidelidad de la segregación cromosómica es controlado por múltiples mecanismos que incluyen el eje montaje puesto de control (SAC). El saco es parte de un sistema complejo que es responsable para la prevención de un progreso de la célula por mitosis salvo los cinetocoros cromosómicos se han unido para huso de microtúbulos. Cromosomas anormales y retraso cromosómico segregación es un indicador de puntos de control de ciclo celular disfuncional y pueden utilizarse para medir la estabilidad genómica de dividir las células. Desregulación del saco puede resultar en la transformación de una célula normal en una célula maligna a través de la acumulación de errores en la segregación cromosómica. Implementación del saco y la formación de los cinetocoros complejo están estrictamente regulados por interacciones entre quinasas y fosfatasas como proteína fosfatasa 2A (PP2A). Este protocolo describe la proyección de imagen de células vivas de los cromosomas en fibroblastos embrionarios de ratón aislados de ratones que tenían un nocaut de la subunidad reguladora de la PP2A-B56γ del revestimiento. Este método supera las deficiencias de otros ciclo celular control técnicas de imagen como la citometría de flujo o inmunocitoquímica que sólo proporcionan una instantánea de un estado de citocinesis de la célula, en lugar de una visualización dinámica espaciotemporal de los cromosomas durante la mitosis.

MEFs de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones fueron sembradas en un vidrio de cubierta de la cámara 2-bien y permitidos para fijar. En el día 2, MEFs se sincronizaron con 0.1% FBS para 24 h. El día 3, MEFs en medios con 200 ng/mL nocodazole y 30 regentwere de PPC CL-HB se incubaron durante 18 h a 37° C y 5% CO2. El día 4, las células fueron fotografiadas utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio (figura 1). En vivo la ...

Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

El objetivo general de este método es marcar y visualizar cromosomas vivos en células mitóticas utilizando la etiqueta Histone 2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopía confocal de disco giratorio. Este método se puede utilizar para visualizar cromosomas mitóticos en células cultivadas para estudiar los efectos de las modificaciones genéticas o los tratamientos farmacológicos en la segregación cromosómica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método fácil y conveniente para etiquetar y visualizar cromosomas vivos en células mitóticas.El Dr. Kazuyo Takeda, quien mantiene el Centro de Microscopía e Imágenes en la División de Productos Virales del Centro de Evaluación e Investigación Biológica de la FDA, demostrará el procedimiento de imágenes en vivo. Los fibroblastos embrionarios de ratón, o MEF, utilizados en este experimento se cultivan en un cubreobjetos de dos cámaras a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante la noche, como se describe en el protocolo de texto. Al día siguiente, sincronice los MEFs en la fase G0/G1 incubándolos en un medio de crecimiento DMEM/F12 que contenga 0,1% de FBS.El día del etiquetado, prepare una solución madre de 1,5 miligra

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe un protocolo básico de la imagen y cuantificar el tiempo mitótico de las células de mamíferos viven de cultivo de tejidos después de la transfección de siRNA.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Fuente: Schumacher, D., y Sogaard-Andersen, L. Imagen de células vivas con fluorescencia del ciclo celular vegetativo completo de la bacteria social de crecimiento lento Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demuestra el uso de imágenes de células vivas para rastrear los orígenes cromosómicos marcados con fluorescencia durante la división celular bacteriana. Captura la dinámica de segregación cromosómica utilizando microscopía de contraste de fase en time-lapse y fluorescencia.

Imagen en lapso de tiempo de la segregación cromosómica en bacterias marcadas con fluorescencia

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Proyección de imagen de células vivas proporciona una riqueza de información en las células o poblaciones enteras que es inalcanzable por célula fija la proyección de imagen solamente. Aquí, se describen protocolos de células vivas para evaluar las decisiones de destino celular después del tratamiento con el fármaco anti-mitotic paclitaxel.

A largo plazo células vivas imágenes para evaluar el destino de la célula en respuesta a Paclitaxel

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Las divisiones celulares se pueden visualizar en tiempo real utilizando proteínas etiquetadas fluorescentes y microscopía de lapso de tiempo. Utilizando el protocolo presentado aquí, los usuarios pueden analizar la dinámica de temporización de la división celular, el ensamblaje del husillo mitético y el congreso y la segregación cromosómica. Los defectos en estos eventos después de la inserción de ARN (ARN) pueden ser evaluados y cuantificados.

Uso de células Drosophila S2 para imágenes en vivo de la división celular

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Aprende a visualizar cromosomas vivos durante la mitosis en fibroblastos embrionarios de ratón usando Histone2B-GFP y microscopía confocal de disco giratorio. Este método facilita el estudio de la segregación cromosómica en biología celular.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

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