Trombosis venosa profunda inducida por estasis en los ratones controlados por sonografía de alta frecuencia

El presente Protocolo describe los pasos para obtener mediante un modelo de estancamiento de la trombosis venosa. Además, estamos utilizando un método no invasivo para medir la formación de trombos y resolución con el tiempo.

Los objetivos generales de este procedimiento son inducir trombosis venosa profunda en ratones utilizando el modelo de estasis de la vena cava inferior, y monitorizar los trombos mediante ultrasonido de alta frecuencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la trombosis venosa sobre cómo un agente farmacológico, un gen o un tipo de célula de interés pueden influir en la formación o resolución del trombo. La principal ventaja de esta técnica es que tanto la formación como la resolución de trombos se pueden cuantificar de forma no invasiva en ratones.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando investigamos cómo desaminar y monitorizar de forma no invasiva la formación de trombos en la vena cava inferior de ratones. Para comenzar, use fórceps para levantar la piel abdominal inferior de un ratón C57 negro de ocho a 10 semanas de edad. Y use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión vertical paralela a cada lado de la línea alba desde la línea media.

Haz una incisión horizontal en la parte superior del abdomen. Seguido de incisiones repetidas a través de la capa muscular abdominal. Pliegue la piel y el músculo lejos de la incisión para exponer la cavidad abdominal.

Y coloque una gasa humedecida en ambos lados de la herida. Aplique una presión suave a ambos lados del abdomen para exteriorizar los intestinos a la gasa. Y colocar una segunda capa de gasa humedecida sobre el tejido externalizado.

Bajo un microscopio de disección, aparta la grasa peritoneal para exponer la vena cava interior, o IVC, entre las venas renal e ilíaca. Y localice las ramas laterales de la IVC. Con pinzas, diseccione suavemente sin romos alrededor de cada rama lateral para romper la fascia sin dañar los vasos circundantes.

A continuación, agarre con cuidado la grasa alrededor de una rama para levantar la vena. Y pase un trozo de sutura de seda de seis guiones cero debajo del recipiente. A continuación, utilice pinzas de sutura y una técnica estándar de atado de nudos quirúrgicos para hacer una ligadura quirúrgica con al menos tres lanzamientos alrededor de la rama lateral para ocluir completamente el vaso.

Alternativamente, use Hemoclips. Para separar la aorta de la VCI, se realiza una disección roma alrededor y entre ambos vasos inmediatamente distal de la vena renal izquierda sin dañar ninguno de los dos. Cuando se haya creado una ventana transparente entre los vasos, pase una sección de seis suturas de seda cero por debajo de la VCI y la aorta abdominal.

Y use fórceps para tirar de la sutura a través de la ventana. Con pinzas de sutura, ligar la VCI con tres lanzamientos inmediatamente distales a la vena renal izquierda para la oclusión completa del vaso. Confirmar que la aorta abdominal se ha dejado ininterrumpida.

Y que todas las ramas laterales han sido ligadas. La VCI aparecerá dilatada distal del sitio de ligadura. Y no se verá ningún flujo sanguíneo.

Devolver la grasa peritoneal y los intestinos a la cavidad abdominal. Y use pinzas de sutura y seis punzones de seda cero para cerrar por separado las capas de músculo y piel con puntos corridos. Luego coloque al animal en una incubadora a 34 grados centígrados durante al menos 30 minutos con monitoreo hasta la recuperación completa.

Coloque el frasco de gel de ultrasonido a través de las bobinas de un sistema de calentamiento de agua para calentar el gel a 37 grados centígrados. 24 horas después de la ligadura, coloque al animal en la plataforma de análisis. Y aplique gel de electrodos en los cuatro electrodos de la plataforma.

Con el animal en posición supina, fijar las patas a los electrodos. E inserte un termómetro lubricado en el recto. Coloque una gasa a un lado del animal para atrapar el exceso de gel de ultrasonido.

A continuación, aplique el gel sobre la piel expuesta. Y obtener imágenes de la VCI de acuerdo con los protocolos estándar de imágenes de ultrasonido. Utilizando un sistema de microimagen de alta frecuencia, la VCI se puede identificar en la vista longitudinal antes de la ligadura.

Y la velocidad del flujo se puede determinar mediante imágenes Doppler de onda pulsada. Inmediatamente después de la ligadura, se observa una disminución del flujo sanguíneo. 24 horas después de la ligadura, se pueden visualizar trombos densos dentro de la VCI mediante ecografía.

La ecografía también permite cuantificar la velocidad del flujo sanguíneo en los vasos. Usar Doppler coloreado antes, inmediatamente después y 24 horas después de la ligadura. Una vez dominado, el trombo puede ser inducido en 30 a 45 minutos dependiendo de la presencia y número de ramas laterales si la técnica se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo y ser preciso pero suave en sus movimientos, ya que es relativamente fácil romper los vasos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis inmunofluorescente, histológico o de citometría de flujo para responder preguntas adicionales sobre el contenido celular de los trombos o para cuantificar proteínas específicas de interés.