Optimizar el uso de un Robot de manipulación de líquidos para llevar a cabo un alto rendimiento adelante química genética pantalla de Arabidopsis thaliana

El objetivo general de este protocolo es realizar un cribado de genética química de alto rendimiento en plántulas de Arabidopsis. Con este método, podemos descubrir de manera eficiente y efectiva nuevas moléculas pequeñas que afectan la fisiología de las plantas. Estos descubrimientos proporcionarán la base para futuros estudios sobre procesos fisiológicos, como la síntesis de la pared celular.

La principal ventaja de esta técnica es que se pueden cribar decenas de miles de moléculas pequeñas en un corto período de tiempo. Aunque este protocolo está diseñado para la especie de planta modelo Arabidopsis, se puede adaptar fácilmente a otros organismos, como insectos, microorganismos o cultivos celulares. La primera vez que tuvimos la idea de este protocolo fue cuando nos enteramos de que el centro genómico de la universidad necesitaba encontrar un hogar para un robot de manejo de líquidos excedente.

Inmediatamente nos ofrecimos a quitárselo de las manos. Prepare la biblioteca de dilución y el posicionador automatizado de material de laboratorio o ALP de lavado de punta multicanal como se describe en el protocolo de texto. Cargue manualmente el Stacker 10s conectado al carrusel del apilador.

En los hoteles de la A a la D, cargue primero una caja de puntas de pipeta AP96 P20 en la sala uno. A continuación, cargue cuatro placas de fondo en V de 96 pocillos en las salas dos a cinco, con dos placas superiores que contengan concentraciones de existencias de la biblioteca solicitada y las otras dos placas inferiores vacías. Además, cargue una caja de puntas de pipeta AP96 P20 en la sala seis.

Cargue cuatro placas de fondo en V de 96 pocillos en las salas siete a nueve, con las dos placas superiores que contienen las concentraciones de existencias de la biblioteca ordenada y las dos placas inferiores vacías. Configure la plataforma con 300 mililitros de agua en el depósito en P3, un baño de etanol al 70% de 300 mililitros en P7, el cargador de punta ALP y el lavado de punta multicanal ALP. Utilizando el software de manejo del robot de manipulación de líquidos, presente las puntas de pipeta AP96 P20 del Stacker 10 y muévalas al Tip Loader ALP.

Presente la Sala Dos del Hotel A y separe las cuatro placas de fondo en V de 96 pozos en la cubierta, colocando las dos inferiores en P4 y P8 y las dos superiores en P5 y P9. Cargue las puntas de pipeta AP96 P20 con el cargador de puntas ALP en el cabezal de 96 canales y 200 microlitros. Aspire 90 microlitros del depósito de agua de 300 mililitros y dispense en la placa de dilución de fondo en V de 96 pocillos en P4. Repita el paso para la placa en P8. Mezcle la placa de biblioteca química en P5 aspirando y dispensando repetidamente 15 microlitros tres veces. Además, aspire 10 microlitros de la placa de la biblioteca química en P5 y dispense 10 microlitros en la placa de dilución en P4. Mezcle las soluciones de la placa en P4 aspirando y dispensando repetidamente 50 microlitros un total de tres veces.

Una vez mezcladas, limpie las puntas de pipeta AP96 P20 aspirando y dispensando 70 microlitros de etanol al 70 % de P7 y, a continuación, lávelas en el lavado de puntas multicanal ALP aspirando y dispensando cuatro veces el 110 % del volumen de agua. Repita estos pasos para el segundo par de placas en P8 y P9. Al crear la segunda placa de dilución de fondo en V de 96 pocillos, apile las placas P9, P5, P8 y P4 en ese orden de abajo hacia arriba. A continuación, coloque la pila en un ALP estático vacío.

Utilice P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13. Repita estos pasos hasta que la sala cinco del hotel A esté vacía y, a continuación, vuelva a iniciar el proceso al llegar a la sala seis, trasladando las nuevas puntas de pipeta AP96 P20 al ALP del cargador de puntas y colocando las puntas de pipeta AP96 P20 usadas en un ALP estático vacío. Repita el procedimiento hasta que la habitación 9 del Hotel A esté vacía.

Para proceder al Hotel B, las placas y las puntas de la cubierta deben volver a cargarse en el Hotel A. Aunque el robot puede funcionar sin supervisión, es necesario rellenar el depósito de agua después de cada ciclo de dilución. Si el ciclo se reinicia con agua insuficiente, el robot aspirará aire y los productos químicos no se diluirán. Rellene manualmente el depósito de agua de 300 mililitros.

El programa informático puede incorporar una pausa que detalle este mensaje, requiriendo que el usuario presione Continuar antes de realizar el siguiente paso. Repita los pasos de dilución para los tres hoteles restantes. Agregue manualmente las semillas al medio a una densidad de 0,1 gramos por 100 mililitros.

Esta densidad da como resultado un promedio de 3-10 semillas por pocillo de una placa de 96 pocillos. Coloque manualmente cuatro placas de fondo plano de 96 pocillos en las habitaciones uno y dos del Hotel A. Coloque una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en el cargador de puntas ALP, un depósito de 300 mililitros lleno de la mezcla de medios y semillas en P3 y un depósito de 300 mililitros lleno de etanol al 70% en P7. Utilizando el software operativo, presente las habitaciones uno y dos en el hotel A y separe las pilas de cuatro platos. Coloque una placa en cada uno de los ALP estáticos vacíos y, a continuación, cargue las puntas de pipeta AP96 P250 en el cabezal de 200 microlitros de 96 canales.

Aspire 90 microlitros del depósito de semillas de medios de 300 mililitros en P3 y dispense en la primera placa de fondo plano de 96 pocillos. Repita este proceso hasta que las ocho placas contengan la mezcla de medios y semillas. Limpie las puntas de pipeta AP96 P250 aspirando y dispensando 70 microlitros del depósito de 300 mililitros lleno de etanol al 70 % en P7. Lave las puntas en el Multichannel Tip Wash ALP aspirando y dispensando un 110% de volumen de agua cuatro veces, luego descargue las puntas en TL1.

Por último, recoge los platos a mano. Cargue manualmente una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en la sala uno del hotel A.Además, cargue dos placas de biblioteca de dilución de fondo en V de 96 pocillos en las habitaciones dos, cuatro, seis y ocho. Cargue dos placas de cribado de fondo plano de 96 pocillos en las salas tres, cinco, siete y nueve.

Usando el software operativo, configure la cubierta para que contenga un depósito de lavado de 300 mililitros de etanol al 70% en P7. El depósito de semillas de medios se puede dejar en la cubierta en P3. Además, encienda la unidad de consola a través de la conexión del controlador del dispositivo para hacer circular el agua a través del lavado de punta multicanal ALP. Esto se apagará automáticamente al final del protocolo. Presente la caja de puntas de pipeta AP96 P250 del Hotel A y muévala al cargador de puntas ALP.

A continuación, presente las placas de la biblioteca de dilución de fondo en V de 96 pocillos de la Sala Dos del Hotel A a la cubierta. Coloque una placa en ALP estático P4 y una placa en P8. Luego, presente las placas de cribado de fondo plano de 96 pocillos de la Sala Tres del Hotel A a la cubierta. Coloque una placa en ALP estático P5 y otra en P9. Cargue las puntas de pipeta AP96 P250 con el cargador de puntas ALP en el cabezal de 96 canales y 200 microlitros.

Mezcle la placa de dilución de fondo en V de 96 pocillos en P4 aspirando y dispensando 50 microlitros tres veces. A continuación, aspire 10 microlitros de esta placa y dispense en la placa de cribado de fondo plano de 96 pocillos en P5. Mezcle las soluciones en la placa en P5 aspirando y dispensando 50 microlitros tres veces. Limpie las puntas de pipeta AP96 P250 con etanol aspirando y dispensando 70 microlitros de etanol al 70% del depósito en P7. A continuación, lave las puntas en el Multichannel Tip Wash ALP aspirando y dispensando cuatro veces el 110% del volumen de agua.

Repita estos pasos para la segunda placa de biblioteca de dilución de fondo en V de 96 pocillos y la placa de cribado de fondo plano de 96 pocillos. Apile las dos placas de biblioteca de dilución de fondo en V de 96 pocillos juntas y las dos placas de cribado de fondo plano de 96 pocillos. Mueva las placas a los ALP estáticos.

Luego, repita el proceso tres veces, agregando productos químicos diluidos a las placas de cribado un total de ocho veces. Finalmente, verifique el número de semillas en cada pocillo de las placas de cribado a través de la confirmación visual. Complemente los pocillos con menos de tres semillas mediante la adición de semillas esterilizadas y vernalizadas.

Es fundamental asegurarse de que el medio en el que crecen las plántulas no se seque, ya que esto dará como resultado una mala germinación. Los platos que contienen plántulas deben mantenerse a alta humedad o almacenarse en recipientes resistentes a la desecación. Incubar las placas de cribado de fondo plano de 96 pocillos durante cuatro días en una cámara ambiental a 22 grados Celsius en un ciclo de luz/oscuridad de 16/8 en un recipiente a prueba de desecación.

Visualice las placas de cribado de fondo plano de 96 pocillos bajo un microscopio de disección y registre todos los fenotipos aberrantes para una investigación posterior. Ejemplos de fenotipos normales y aberrantes son la ausencia de anomalías morfológicas visibles, los pelos marrones de la raíz, la raíz atrofiada, la raíz severamente atrofiada, el mucílago blanqueado y verde, la germinación incompleta y la ausencia de germinación. Los fenotipos visibles por porcentaje se muestran en un gráfico circular.

Las plántulas mostraron anormalidades en la morfología de la raíz, la pigmentación, los pelos de la raíz y la germinación. También se incluye una variedad de otros, que incluyen la producción de mucílago verde. Una vez dominada, esta técnica puede aumentar en gran medida la eficiencia y la precisión de los grandes cribados genéticos químicos directos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar esterilizar y vernalizar la semilla, rellenar el depósito de agua durante los pasos de dilución, asegurarse de que las muestras se almacenen en recipientes resistentes a la desecación y que todas las imágenes se realicen en placas de fondo plano. Dependiendo del proceso fisiológico que le interese investigar, esta evaluación inicial puede ser seguida con ensayos adicionales para ayudar a determinar el modo de acción de cada producto químico. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar un robot de manejo de líquidos para mejorar la eficiencia y la precisión de un cribado genético químico.