Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

Este método puede ayudar a optimizar y seleccionar inmunoterapias clínicamente útiles para la infección por Clostridium difficile de una manera específica para cada paciente, y a dilucidar las respuestas inmunitarias humanas a Clostridium difficile. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación precisa y simultánea de las respuestas de anticuerpos multiisotipo y específicos de cepa a antígenos de C. difficile. Por lo general, las personas que son nuevas en este método tendrán dificultades porque se requiere experiencia para establecer y optimizar un panel de antígenos altamente purificados y configurar la plataforma tecnológica.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los tipos de listas metodológicas involucradas en la preparación de la placa de microondas, la impresión de matrices, un procedimiento seguro y el análisis de datos requieren atención a los detalles. Sam Greenwood, un técnico de mi laboratorio, hará una demostración de algunos de los procedimientos. Para empezar, diluya los antígenos de Clostridium difficile y el tampón de impresión hasta obtener una concentración óptima.

A continuación, transfiera 10 microlitros de solución de antígeno a una placa de 384 pocillos. Cubra la placa con un sello de placa y centrifugue a 300 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para la impresión de microarrays, utilice un quemador de gas de mano para calentar el PIN de silicio tres veces durante dos segundos cada una.

A continuación, enjuague el PIN de silicona con agua limpia tres veces durante tres segundos cada una. Coloque la placa de microarray en el cartucho de carga de un arrayer. Expulse la bandeja y luego coloque los portaobjetos de aminosilano en la bandeja deslizante y presione el botón OK para encender la aspiradora.

Asegúrese de que todas las diapositivas estén protegidas y, a continuación, haga clic en Aceptar. Regrese la bandeja al origen y cierre la tapa. A continuación, inicie el programa adecuado y vaya a Archivo, luego a Parámetros de microarraying y luego a Abrir. Seleccione el archivo Clostridium difficile para imprimir todos los antígenos en cuadruplicado.

En esta ventana, abra la pestaña Origen para indicar el almacenamiento de muestras y la pestaña Destino para introducir los detalles del microarray. A continuación, abra la pestaña Opciones para seleccionar la herramienta de lavado. En la pestaña General de Preferencias de ejecución, en la barra de herramientas del conjunto de aplicaciones TAS, seleccione Lavar al inicio de la ejecución y Lavar al final de la ejecución.

Abra la pestaña Clima y establezca el nivel de humedad entre 55 y 60%Ahora inicie la ejecución y verifique periódicamente el arreglo para asegurar su correcto funcionamiento. Después de imprimir, coloque con cuidado las diapositivas impresas en un soporte de portaobjetos con 16 cámaras de pocillos múltiples. A continuación, añada 100 microlitros de 5%BSAT a cada bloque.

Cubra los portaobjetos e incube durante una hora a temperatura ambiente agitando. Use 120 microlitros de PBST para lavar cada bloque cinco veces durante un minuto cada una con agitación. A continuación, descongele las muestras de suero obtenidas de pacientes infectados por C. difficile y controles sanos en hielo durante 20 minutos.

Agregue el diluyente de anticuerpos disponible comercialmente al bloque maestro y, a continuación, agregue muestras al bloque maestro y mezcle. Deseche el tampón de lavado y agregue 100 microlitros de cada muestra diluida a los bloques experimentales. Para el bloque de control negativo, agregue 100 microlitros de solo el diluyente de anticuerpos.

Luego, incube los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave. A continuación, use 120 microlitros de PBST para lavar cada bloque cinco veces durante tres minutos cada una con agitación. A continuación, añada a cada bloque 100 microlitros de anticuerpo anti-humano biotinilado de cabra diluido en diluyente de anticuerpos.

Cubra los portaobjetos e incube durante una hora a temperatura ambiente agitando suavemente. Use 120 microlitros de PBST para lavar cada bloque cinco veces durante tres minutos cada una con agitación. A continuación, agregue 100 microlitros de estreptavidina conjugada SY5 diluida en 5% BSAT, en una proporción de uno a dos mil por cada bloque.

Cubra los portaobjetos con papel de aluminio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente agitando suavemente. Lave los portaobjetos primero con 120 microlitros de PBST cinco veces durante un minuto cada uno, y luego lávelos dos veces más durante un minuto cada uno con PBS. Para secar los portaobjetos, gírelos durante cinco minutos a 300 veces la gravedad.

Encienda el escáner láser 30 minutos antes de escanear para permitir que se caliente. A continuación, coloque la diapositiva en el escáner con la superficie impresa hacia arriba hasta que la luz de la placa se vuelva verde fija. A continuación, presione el botón Configuración.

En la primera pestaña, asegúrese de que el desplazamiento automático y el código de barras estén desmarcados. Luego, establezca el Tamaño de píxel en 10, el Modo de escaneo en Medio, la Adquisición en solo 635, el Modo de adquisición en Manual, la ganancia en 20 y la potencia en baja. En la segunda pestaña, asegúrese de que el tipo de diapositiva no esté etiquetado.

En la tercera pestaña, establezca la configuración de enfoque en Enfoque automático. Presione el botón de cuadrícula de importación para seleccionar la lista de matrices apropiada asociada con la imagen escaneada. A continuación, pulsa el botón de búsqueda automática para alinear la cuadrícula con los puntos de la diapositiva.

Finalmente, presione el botón Proceso de cuantificación para medir la intensidad de fluorescencia de cada punto. A continuación, guarde los resultados en un formato adecuado para su posterior análisis. En este protocolo, se compara un microarray de proteínas con ELISA para evaluar la reproducibilidad entre estas dos técnicas.

El análisis del coeficiente de correlación de Spearman muestra una concordancia significativa entre el microarray y el ELISA para la detección de niveles de IgG, antitoxina A y antitoxina B en muestras de suero. Se calcula la reproducibilidad del microarray de proteínas utilizando las muestras de suero de siete pacientes. Las muestras analizadas en dos portaobjetos de matriz diferentes contra la toxina A, la toxina B, SLP001, SLP002, SLP027, la toxina B de la cepa CCUG productora de toxina B y los antígenos pCDTb revelan una buena reproducibilidad.

Se realiza un microarray de proteínas para detectar una respuesta de anticuerpos específica del isotipo contra las toxinas de Clostridium difficile. Las muestras de suero de pacientes e individuos sanos se utilizan para detectar los niveles de IgG e IgA contra las toxinas A, B, B de una cepa de Clostridium difficile que solo expresa la toxina B y la forma precursora de un fragmento B de la toxina binaria. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en siete horas.

El experimento de control de calidad, diferentes parámetros, como la selección de la química de superficie adecuada, los tampones de impresión, los tampones de bloqueo y las diluciones de muestras de suero y anticuerpos secundarios, deben evaluarse antes de ejecutar las muestras. La impresión de una matriz de alta calidad requiere una buena comprensión de la matriz o software para ajustar la impresión de parámetros de acuerdo con el protocolo experimental. Es crucial mantener un rendimiento óptimo del matriz, y un entorno libre de polvo durante todo el experimento.

Esta técnica allanará el camino para los investigadores en el campo de la inmunología y la biología molecular, en términos de caracterización de las respuestas inmunes humorales a la infección y el descubrimiento de antígenos serodiagnósticos. No olvide que trabajar con muestras de sangre infectadas y toxinas bacterianas puede ser peligroso. En general, en el laboratorio, siempre se deben tener en cuenta las precauciones estándar y de seguridad al realizar este procedimiento.