Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

El objetivo general de este protocolo de aislamiento celular es obtener células endoteliales puras y viables de pacientes que padecen carcinoma colorrectal, tanto del tumor como del colon normal correspondiente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología tumoral y la angiogénesis, como estimar y analizar el impacto del sistema de vasos sanguíneos en la tumorigénesis colorrectal. La principal ventaja de esta técnica es que se puede tener una tasa de éxito relativamente alta en la obtención de células endoteliales humanas puras y viables de pacientes con carcinoma colorrectal.

Para obtener la muestra de tejido de pacientes con carcinoma colorrectal, use un bisturí nuevo para obtener trozos de tejido que pesen alrededor de un gramo. A continuación, utilice pinzas estériles para transferir los trozos de tejido fresco en 40 mililitros de tampón HBSS helado con antibióticos en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Luego, use pinzas estériles separadas para transferir el carcinoma y el tejido normal secuencialmente de un tubo de centrífuga a otro para lavar 40 mililitros de tampón HBSS helado con antibióticos cuatro veces.

Para eliminar toda la grasa, el tejido no tumoral o las partes de tejido potencialmente necrótico, utilice pinzas estériles y transfiera las piezas de tejido a una placa de Petri de cultivo celular estéril. Luego, agregue de tres a cinco mililitros del tampón HBSS suplementado con antibióticos para dejar los trozos de tejido humedecidos. A continuación, utiliza un bisturí nuevo para recortar los trozos de tejido.

Luego, use un bisturí con una hoja curva para picar el tejido restante en trozos pequeños. Transfiera las piezas de tejido picado a un tubo de disociación de tejido lleno de medio de cultivo celular precalentado. Disocie los trozos de tejido picado con un disociador de tejidos, junto con un kit de disociación de tumores para tejido humano siguiendo las instrucciones del fabricante.

El primer paso crítico es procesar y microdiseccionar correctamente la muestra de cirugía para obtener piezas de tejido con el tamaño y el tipo de tejido correctos. Después de disociar las piezas de tejido, centrifugarlas a temperatura ambiente a 300 veces la gravedad durante un minuto. A continuación, utilice una pipeta serológica para añadir 10 mililitros de medio DMEM Low precalentado al tubo MACS.

A continuación, vierta la suspensión celular del tubo en un filtro celular con un tamaño de poro de 100 micrómetros colocado encima de un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Pipetee 10 mililitros adicionales de medio DMEM Low en el tubo MACS para enjuagar las celdas adicionales del tubo a través del filtro en el tubo de centrífuga. Una vez que se haya filtrado toda la suspensión celular, lave el filtro celular con 10 mililitros adicionales de DMEM Low medium.

Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente a 300 veces la gravedad durante siete minutos. Luego, deseche el sobrenadante una vez finalizada la centrifugación. A continuación, disuelva el gránulo de la célula en cinco mililitros de medio EBM-2-MV precalentado y suplementado con antibióticos en el mismo tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Retire la solución de recubrimiento del matraz de cultivo y transfiera la suspensión celular directamente a un matraz de cultivo T-25 mantenido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cuando la confluencia alcance aproximadamente el 80 al 90%, agregue un mililitro de Accutase para separar las células del matraz. A continuación, deje las células con la Accutase durante 10 minutos.

A continuación, agregue cuatro mililitros de medio EBM-2-MV mantenido a 37 grados a las celdas. Luego, use un dispositivo de conteo de células automatizado con un rango de 10 a 25 micrómetros para contar las células. El segundo paso más crítico son todos los pasos en los que las células deben dividirse.

La estimación del punto de tiempo correcto requiere experiencia. Si la división es demasiado temprana, las células morirán. Si la división es demasiado tarde, las células endoteliales alcanzarán la senescencia o el crecimiento excesivo de fibroblastos será un problema.

A continuación, centrifuga las células a temperatura ambiente a 250 veces la gravedad durante cuatro minutos y expulsa el sobrenadante al final de la ejecución. A continuación, disuelva el pellet de celda en un tampón FACS precalentado. A continuación, añada los anticuerpos de tinción FACS a las células.

Mezclar y posteriormente incubar a temperatura ambiente durante un total de 15 minutos. Después de la mitad de este período de incubación, mueva el tubo una vez. Utilice una pipeta serológica para añadir dos mililitros de tampón FACS a la suspensión celular marcada.

Luego, centrifugue la suspensión celular a temperatura ambiente a 250 veces la gravedad durante cuatro minutos y decante el sobrenadante una vez finalizada la centrifugación. Luego, agregue dos mililitros de tampón FACS para disolver el pellet de celda y centrifugue la suspensión celular a temperatura ambiente durante cuatro minutos a 250 veces la gravedad. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de medio EBM-2-MV suplementado con antibióticos.

A continuación, transfiera las celdas al instrumento de clasificación FACS. Identifique las células triplemente positivas y déjelas sembrar en la placa de cultivo de 24 pocillos llena de medio EBM-2-MV fresco y precalentado. Cultive las células durante las próximas 48 horas y luego renueve el medio.

Continúe cambiando el medio cada dos días hasta que la confluencia alcance del 90 al 100% en cinco a 10 días. Luego, expanda la población celular de acuerdo con la placa de cultivo deseada. Luego, se cosecha una vez alcanzada la confluencia, y se procede a la caracterización.

En primer lugar, el espécimen tumoral obtenido se disocia y se siembra en una placa de cultivo celular. Las células no adherentes se lavan y las células adherentes se cultivan hasta un 80 a 90% de confluencia antes de la clasificación FACS. A continuación, se realiza el análisis FACS para identificar la población del tumor viable inmunomarcado y las células endoteliales normales.

Para ello, se realiza un triple marcaje específico de anticuerpos acoplados a fluorocromos de las células endoteliales normales y tumorales para clasificarlas mediante FACS. Un promedio de 3,6 y 5,6% de toda la población celular clasificada son células tumorales y endoteliales normales, respectivamente. A continuación, para identificar la expresión de los marcadores de células endoteliales, las células endoteliales normales y tumorales obtenidas se someten a inmunocitoquímica.

Las imágenes muestran células endoteliales normales y tumorales CD31 positivas. A continuación, se aísla el ARN de la población de células endoteliales CD31 positivas y se somete a RT-qPCR para identificar los otros marcadores específicos de células endoteliales. A partir del gráfico, también se detecta la expresión de marcadores de células endoteliales, como CD105, VE-cadherina y el factor de von Willebrand, pero falta expresión de marcadores de poblaciones celulares potencialmente contaminantes, lo que indica la pureza de los cultivos de células endoteliales aisladas.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente tres semanas si se realiza correctamente. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque requiere experiencia con cultivos de células endoteliales primarias para estimar cuándo y en qué proporciones las células pueden dividirse o procesarse posteriormente para el análisis de clasificación FACS. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del carcinoma colorrectal, ya que los cultivos celulares se pueden utilizar para identificar los mecanismos de la tumorigénesis, la respuesta al tratamiento o la resistencia en el carcinoma colorrectal.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando leímos múltiples informes en la literatura que apuntaban a problemas con el establecimiento de células endoteliales realmente puras y viables a partir de tumores sólidos humanos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la microdisección o el procesamiento de tejidos para el análisis de clasificación FACS o la división adicional de las células endoteliales requieren experiencia para estimar el punto de tiempo correcto. Al intentar este procedimiento, es importante establecer primero una red cooperativa funcional con cirugía, patología y registro tumoral.

Además, debe estar entrenado en el ejercicio para trabajar con cultivos de células endoteliales primarias, ya que estas células son frágiles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células endoteliales del carcinoma colorrectal humano y el colon normal correspondiente.