Name: Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprende a visualizar la morfogénesis de ramificación de nervios periféricos y vasos sanguíneos en piel de oreja de ratón adulto mediante microscopía confocal de montaje completo. Este método permite analizar la distribución tridimensional de células inmunes.

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Agradecemos la gestión del laboratorio K. Gill y soporte técnico, J. Hawkins y el personal de institutos nacionales de salud (NIH) facilidad del edificio 50 animales para la ayuda del ratón, y R. Reed y F. Baldrey para asistencia administrativa. Gracias también a Motegi S. y M. Udey para compartir su oído piel disección Protocolo N. quemaduras ayuda editorial y los miembros del laboratorio de células madre y biología Neuro-Vascular para la ayuda técnica y discusión reflexiva. T. Yamazaki fue apoyada por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación intramuros de la National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11 para Y.M.)

Todos los experimentos en esta sección fueron realizados bajo aprobación de la nacional del corazón, pulmón, sangre Institute (NHLBI) Animal atención y Comité de uso.
1. adultos ratón oído piel colección
<ol><li>Eutanasia a ratones adultos por la exposición de dióxido de carbono (CO2) en una cámara cerrada y luego confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Nota: El experimento sigue la pauta de institutos nacionales de salud (NIH) para el método de eutanasia.</li>
	<li>Diseccionar el oído de la base y colóquelo en una de 35 x 10 mm2 caja de Petri que contiene 2 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS). Brevemente recortar el vello con unas tijeras.</li>
	<li>Pelar la piel posterior y anterior piel lejos cuidadosamente el cartílago intermedio. Nota: El cartílago se adhiere a la piel anterior.</li>
	<li>Transferencia de la parte posterior y anterior piel por separado para una 24 bien la placa que contiene 1 mL de helado fresco paraformaldehído al 4% (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) por pozo. Aplanar la piel anterior y posterior en el 4% del PDC.</li>
	<li>Fijar la piel anterior y posterior con cartílago a 4 ° C durante 1 hora.</li>
	<li>Lave la piel posterior y anterior 3 veces durante 5 minutos en 1 mL de PBS con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferencia de la piel anterior y posterior con cartílago en la parte inferior de 35 x 10 mm2 caja de Petri. Cortar la región de base, que se pliega y adiposo y los tejidos conectivos. Pele el cartílago de la anterior piel con unas pinzas curvas finas.</li>
	<li>Desde el interior de la piel posterior con unas pinzas curvas finas, retire con cuidado los pelos, tejidos adiposos y los tejidos conectivos. Mantener la piel húmeda con PBS.</li>
</ol>2. la coloración de Immunohistochemical de whole-mount de piel de oreja de ratón
Nota: Todos los experimentos en las secciones siguientes se realizaron según las pautas de seguridad del laboratorio de NIH.
<ol><li>Preparar la solución amortiguadora de bloqueo. Filtro inactivado por calor 10% de suero de cabra (HIGS) había diluido en PBS con Tritón 0.2% solución amortiguadora de bloqueo X-100 (TX-100), o 10% de suero de burro (DS) había diluido en PBS con 0.2% solución amortiguadora de bloqueo TX-100, con una unidad de filtro de 0.45 μm.</li>
	<li>Transferencia de la parte posterior y anterior piel 24 bien placa que contiene 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo de HIGS de 10% o 10% DS solución amortiguadora de bloqueo por pozo. Incubar la piel por 30 min con suave mezcla en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la solución de anticuerpo primario por dilución de los anticuerpos primarios (Tabla de materiales) en solución amortiguadora de bloqueo (ya sea 10% HIGS o 10% DS). Nota: Mout todo el análisis de immunohistochemical de la piel de oreja adulto con anticuerpos a la clase de neurona específica marcador neuronal pan III β-tubulina (Tuj1, conejo policlonales IgG o ratón monocloncal IgG2a, dilución 1: 500 en la concentración final de 2 μg/mL), molécula de adhesión de células endoteliales pan marcador plaquetas célula endotelial 1 (PECAM-1, hámster monoclonal IgG, 1:300 dilución en la concentración final de 3.3 μg/mL), proteína básica de mielina de marcador de vaina de mielina (MBP, conejo IgG policlonal, dilución 1: 200 en el concentración final de 5 μg/mL) y el marcador inflamatorio células mieloides CD11b (Rat IgG2b monoclonal, 1:50 dilución en la concentración final de 20 μg/mL) se muestra en la figura 1 y figura 2. La piel se incubó con el anticuerpo conjugado con Cy3 para músculo liso vascular células marcador α actinia del músculo liso (αSMA) junto con anticuerpos secundarios (2.6). Los anticuerpos primarios probados por nosotros mismos se enumeran en la Tabla de materiales. Varios anticuerpos primarios derivados de diferentes especies se pueden mezclar al mismo tiempo.</li>
	<li>Traslado la piel anterior y posterior al nuevo pozo que contiene 150 μL de la solución de anticuerpos primarios. Incubar la piel con la suave mezcla en un mezclador a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, la piel posterior y anterior de transferencia a nuevos pozos en la placa de la pozo 24 o aspire la solución amortiguadora de bloqueo con anticuerpos primarios. Añadir 1 mL de o 2% HIGS diluido en PBS con tampón de lavado de TX-100 0.2% o 2% DS diluido en PBS con tampón de lavado 0.2% TX-100. Lave la piel con 3 cambios de la solución de lavado cada 15 minutos con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la solución de anticuerpo secundario (Tabla de materiales). Diluir los anticuerpos secundarios en la solución amortiguadora de bloqueo (ya sea 10% HIGS o 10% DS) y el filtro de la solución amortiguadora de bloqueo que contiene anticuerpos secundarios a través de un 0.22 μm del polivinilideno (PVDF) de difluoruro jeringa filtro de membrana conectada a una jeringa de 1 mL. Nota: Alexa 488 o 633-conjugado de cabra anti-conejo IgG (H+L) o ratón IgG2a para Tuj1, hamster contra cabra 647 Alexa Conjugado IgG (H+L) de PECAM-1, conjugados con Alexa 488 cabra anti-conejo IgG (H+L) de MBP, y se utilizaron conjugados con Alexa 594 rat IgG (H+L) de CD11b con dilución 1: 250 en la concentración final de 8 μg/mL. La piel se incubó con el anticuerpo αSMA conjugado con Cy3 (dilución 1: 500 en la concentración final de 2-3 μg/mL) en combinación con estos anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Centrifugue la solución a 13.000 x g por 10 min eliminar las partículas agregadas de los anticuerpos secundarios de la solución amortiguadora de bloqueo. Nota: Diversos anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes derivados de diferentes especies se pueden mezclar al mismo tiempo.</li>
	<li>Traslado la piel posterior y anterior al bien que contiene 150 μL de la solución de anticuerpos secundarios. Envolver la placa 24 bien en papel aluminio para evitar la luz e incubar la piel durante 1 h con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera la piel anterior y posterior al nuevos pozos en la placa de la pozo 24 o aspirar la solución de anticuerpo secundario por pipeta completamente. Añadir 1 mL de tampón de lavado 2% HIGS o tampón de lavado 2% DS.</li>
	<li>Envolver la placa de la pozo 24 en papel de aluminio y lavar con 3 cambios de la solución de lavado cada 15 minutos con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. la piel de la oreja de montaje en portaobjetos
<ol><li>Colocar la piel en la parte inferior de 35 x 10 mm2 caja de Petri. Retire con cuidado los pelos, tejido adiposo, tejidos conectivos, polvos y fibras desde el interior de la piel utilizando fórceps curvado fino bajo Estereomicroscopio con iluminación baja para minimizar la foto amplia de blanqueo. Mantener la piel húmeda con PBS.</li>
	<li>Transferencia de la piel a un adhesivo portaobjetos usando pinzas. Coloca la piel anterior y posterior con la parte interior hacia arriba en la diapositiva. Aplanar la piel con unas pinzas.</li>
	<li>Montaje de la piel en un medio líquido montaje anti-fade para evitar fotoblanqueo y preservar las señales fluorescentes. Asegúrese de que no hay burbujas de aire en o alrededor de la piel.</li>
	<li>Cubrir con cubreobjetos sobre las muestras de piel con cuidado y guardar las diapositivas de muestra de piel montada en la oscura noche a temperatura ambiente para permitir que los medios de montaje conseguir la firmes. Sellar el cubreobjetos a la diapositiva con esmalte de uñas y almacenar a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>4. confocal microscopio
<ol><li>Configurar láser apropiada para fluoróforos. Un microscopio confocal con tres fuentes de láser (argón 488 nm, DPSS 561 nm y HeNe 633 nanómetro) se utiliza en este experimento.</li>
	<li>Utilice la herramienta de exploración secuencial, que excita al mismo tiempo muestras de triple tinción, para evitar y reducir cualquier superposición. Nota: Se tomarán imágenes de manera secuencial utilizando el modo de exploración secuencial.</li>
	<li>Imagen bajo un objetivo de X 10. Utilice la herramienta de exploración de azulejo para capturar la piel de la oreja entera. Conjunto Z-stack y asegúrese de que la posición de z abarca todo el espesor de la piel del oído.</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la imagen de conjunto-Monte immunonohistochemical de piel de oreja adulto para el análisis de estructuras neuro-vasculares y la distribución de células inmunitarias. Creemos que este método tiene numerosas ventajas experimentales para investigadores para el estudio de ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución tridimensional de los componentes de la piel incluyendo el pelo y las células inmunes folículos. Los resultados de...

Piel se compone de tres capas: la epidermis, la dermis y la hipodermis. Se ha utilizado como sistema modelo para estudiar el mantenimiento de la célula de vástago, la diferenciación y la morfogénesis en el desarrollo así como la regeneración, tumorogénesis e inflamación en adulto. Piel es ricamente vascularizada e inervada de tal manera que el desarrollo del sistema vascular y sistema nervioso periférico es bien coordinado.
Previamente hemos demostrado una técnica de imagen de piel embrionaria todo Monte con etiquetas múltiples para el estudio de los nervios periféricos intactos y los vasos sanguíneos incluyendo sus componentes celulares1,2,3, 4: axones sensoriales, axones simpáticos, las células en los nervios de Schwann, células endoteliales, pericitos y células musculares lisas vasculares (VSMCs) en los vasos sanguíneos. Durante la angiogénesis, una red capilar primaria experimenta intensivo remodelado vascular y se convierte en una red jerárquica de ramificación vascular. En la dermis/hipodermis en vías de desarrollo, las arterias ramifican junto a los nervios sensoriales periféricos y venas entonces forman adyacentes a las arterias. Después de la red vascular jerárquica está bien cubierta con VSMCs, los nervios simpáticos se extienden a lo largo e inervan los vasos sanguíneos de gran diámetro1,5,6. A pesar de la importancia de la estrecha asociación entre los sistemas nerviosos y vasculares en desarrollo, ha sido una cuestión importante abordar lo que ocurre con las redes neuro-vasculares en diferentes situaciones patológicas en adultos. Una proyección de imagen de alta resolución tridimensional es necesario apreciar la patogenesia, junto con morfogénesis ramificación anatómica reconocible y patrones.
Morfogénesis neuronal y vascular en piel de ratón adulto se analizan comúnmente por tejido sección coloración. Otros estudios han utilizado proyección de imagen de conjunto de montaje de la piel para visualizar los nervios periféricos y vasos sanguíneos, además de los folículos pilosos, glándulas sebáceas y del arrector pili músculos7,8,9. Sin embargo, el grueso de la piel adulta ha hecho difícil analizar la piel en toda su profundidad.
En el presente estudio, hemos desarrollado una novela alta resolución montaje en toda la proyección de imagen de piel de oreja adulto para superar estos desafíos. Piel del oído es fácilmente accesible para la disección y posterior montaje de toda la proyección de imagen de la piel en toda su profundidad. Por lo tanto, es un método simple y altamente reproducible que puede aplicarse para comparar la arquitectura tridimensional de los sistemas nerviosos y vasculares periféricos en la piel, con las medidas de cuantificación integral. Hemos demostrado que la alineación de los nervios periféricos sensoriales y simpáticas con los vasos sanguíneos de gran diámetro se conserva en la piel adulta. El objetivo de este protocolo es visualizar la ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución de células inmune a nivel celular en modelos de ratón adulto en varias condiciones tales como la inflamación y regeneración.

<table><tbody><tr><td>10 x Solución salina tamponada con fosfato</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, sin Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, con Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fijador, diluido en PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Normal suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Componente del tampón de bloqueo/lavado</td></tr><tr><td>Normal suero de burro</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Componente del tampón de bloqueo/lavado</td></tr><tr><td>Pinzas finas curvas</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro 0,45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>Para filtración</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>para filtración</td></tr><tr><td>Unidad de filtro de jeringa 0,22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>Para filtración</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td> Medio <td>de montaje antidecoloración</td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>de uñas Microscopía electrónica Sciences</td><td>72180</td><td>Para sellado</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Software de edición de gráficos</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Software de edición de gráficos</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Software de procesamiento</td></tr><tr><td>de imágenes Anticuerpo anti-PECAM-1 (CD31)</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, marcador de células endoteliales vasculares, 1:300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PECAM-1 (CD31)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rata IgG2a kappa, marcador de células endoteliales vasculares, 1:300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-&#945;SMA conjugado con cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>IgG2a de ratón, marcador vascular de células musculares lisas, 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-EphB1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Policlonal de cabra, marcador de células endoteliales venosas, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuronas específicas de clase III &#946;-tubulina (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, IgG policlonal de conejo, marcador panaxonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Tuj1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>IgG2a de ratón, marcador panaxonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MBP</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>IgG policlonal de conejo, marcador de mielinización, 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Marcador de neurona simpática policlonal de conejo, 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-periferina</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Policlonal de conejo, marcador de neuronas periféricas, 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD11b</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rata IgG2b, marcador de células inflamatorias (macrófagos), 1:50</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rata IgG2b kappa, marcador de células panhematopoyéticas, 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD3</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rata IgG1, marcador de células inmunitarias, 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rata IgG2a kappa, marcador de células inflamatorias, 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Conejo policlonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Pollo policlonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-&#946;-gal</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Conejo policlonal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Conejo policlonal, 1:300</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Anticuerpo secundario policlonal de conejo, 1:250</td></tr><tr><td>Cabra anti-hámster IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Anticuerpo secundario policlonal para hámster, 1:250</td></tr><tr><td>IgG anti-rata para cabras (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Anticuerpo secundario policlonal para ratas, 1:250</td></tr><tr><td>IgG2a anti-ratón para cabras Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Anticuerpo secundario IgG2a para ratones, 1:250</td></tr></tbody></table>

whole-mount microscopía confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Aquí, presentamos un protocolo de una piel de oreja adulto todo montaje de técnica para estudiar la completa morfogénesis tridimensional de ramificación neuro-vascular y patrones, así como distribución de célula inmune a nivel celular. El análisis de estructuras anatómicas del nervio y los vasos sanguíneos periféricos en tejidos adultos proporciona algunas perspectivas en la comprensión del cableado neuro-vasculares funcional y degeneración neuro-vascular en condiciones patológicas como la cicatrización de heridas. Como un sistema modelo muy informativo, nos hemos centrado nuestros estudios en piel de oreja adulto, que es fácilmente accesible para la disección. Nuestro protocolo simple y reproducible proporciona una descripción exacta de los componentes celulares de la piel entera, tales como los nervios periféricos (axones sensoriales, axones simpáticos y células de Schwann), los vasos sanguíneos (células endoteliales y células musculares lisas vasculares ) y células inflamatorias. Creemos que este protocolo allanará el camino para investigar anormalidades morfológicas en los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la inflamación en la piel de oreja adulto bajo diferentes condiciones patológicas.

Ratón adulto posterior oído piel (figura 1A) y anterior de la oreja (figura 1B) immunostained con anticuerpos αSMA (rojo), Tuj1 (verde) y PECAM-1 (azul). Piel posterior era immunostained para estudiar la distribución de neuro-inmune con anticuerpos CD11b (rojo) y MBP (verde), junto con Tuj1 (azul) (figura 2A). Distribución de CD11b+ las células inflamatorias, incluyendo macrófagos fue dete...

Aquí, describimos un método imagenológico de alta resolución Monte todo en la piel de oreja de ratón adulto entero, que nos permite visualizar la ramificación de la morfogénesis y el patrón de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como distribución de células inmunes.

Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la morfogénesis ramificada y el patrón de los nervios periféricos y los vasos sanguíneos, así como la distribución de las células inmunitarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la neurobiología, la biología vascular y la inmunología al iluminar las anomalías morfológicas en los nervios periféricos y los vasos sanguíneos, así como la inflamación. La principal fortaleza de esta técnica es que podemos visualizar los componentes celulares de los nervios periféricos, los vasos sanguíneos y las células inmunitarias de la piel en toda su profundidad y podemos comparar la arquitectura tridimensional de los sistemas nervioso y vascular.Este método puede proporcionar información sobre las estructuras de la neurovasculatura y la distribución de las células inmunitarias en ratones juveniles a adultos en condiciones normales y patológicas. Después de sacrificar ratones adultos de acuerdo con el protocolo de texto, diseccione el oído desde la base y colóquelo en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros que contenga dos mililitros de HBSS. Luego, usa unas tijeras para recortar brevemente los pelos.Retir

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Investigación

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Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Piel de los mamíferos contiene una amplia gama de estructuras - tales como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas - que exhiben patrones distintivos de organización espacial. El análisis de la piel como montura plana se aprovecha de la geometría de 2 dimensiones de este tejido para producir de espesor total de imágenes de alta resolución de las estructuras de la piel.

Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

Aquí describimos una preparación novedosa para obtener imágenes de terminales sensoriales lanceoladas vivas de terminaciones en empalizada que inervan los folículos pilosos de la piel del oído de ratón durante la tinción y decoloración con colorantes de estiril piridinio.

Seguimiento óptico del nervio terminal de estar etiquetado en folículo piloso lanceoladas Los finales de la<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Piel de la oreja de ratón

Este protocolo describe la inducción de un modelo de isquemia-reperfusión (IR) en la piel de oreja de ratón utilizando sujeción imán. El uso de un modelo de imágenes intravital hecha a la medida, se estudia en las respuestas inflamatorias in vivo después de la reperfusión. La razón fundamental detrás del desarrollo de esta técnica es extender la comprensión de cómo los leucocitos responden a la lesión IR piel.

La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

El modelo de oreja del ratón sin pelo SKH1-Hr hr permite microscopía de fluorescencia intravital de la microcirculación y la inducción de trombos fototóxico sin preparación quirúrgica previa en el lecho microvascular examinado. Por lo tanto, la oreja del ratón sin pelo es un excelente modelo in vivo para estudiar las interacciones complejas durante la formación de trombos microvasculares, la evolución de trombos, y la trombólisis.

Microscopia intravital y trombos de inducción en el lóbulo de la oreja de un ratón sin pelo

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.

Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido

Este protocolo, destinado a usuarios novatos de tejido del oído interno de ratón, detalla exhaustivamente los pasos para procesar los oídos internos de ratón en diferentes etapas de desarrollo para la inmunotinción de secciones.

Criosección e inmunotinción de tejido del oído interno de ratón: desde la etapa embrionaria hasta la adulta

Aprende a visualizar la morfogénesis de ramificación de nervios periféricos y vasos sanguíneos en piel de oreja de ratón adulto mediante microscopía confocal de montaje completo. Este método permite analizar la distribución tridimensional de células inmunes.

Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes (Video) | JoVE Journal

Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes

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