Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

El objetivo general de este procedimiento es crear roturas bicatenarias de ADN localizadas utilizando un microscopio confocal de barrido láser de 405 nanómetros ampliamente disponible, y proporcionar procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación del ADN en estas lesiones. Este método se puede utilizar para determinar si una proteína determinada se recluta para las roturas de ADN bicatenario y delinear las vías de señalización que regulan su acumulación en las lesiones de ADN. La técnica utiliza un sistema de microscopio confocal comúnmente disponible para inducir localmente el daño al ADN.

Esto permite que prácticamente cualquier laboratorio estudie la cinética de la respuesta al daño del ADN. Si se monitorea el reclutamiento vivo de una proteína marcada con fluorescencia, realice una transfección transitoria o una selección de líneas celulares estables que expresen la proteína de interés, fusionadas con un indicador fluorescente. 24 horas antes del experimento de microirradiación, sembró 40.000 células U2OS por pocillo en DMEM 1X que contenía un 10% de FBS, en portaobjetos de cultivo de ocho pocillos, con fondos de polímero de vidrio tipo cubreobjetos de 170 micras de espesor.