Una prueba Simple, rápida y cuantitativa a medida reparación de vínculos cruzados de proteínas DNA en plásmidos Transfected en las células de mamífero

El objetivo general de este ensayo de QPCR de extensión de cebador transpacífico es evaluar cuantitativamente la reparación de aductos, reticulados al ADN plasmídico, después de la transfección en células de mamíferos. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN. Por ejemplo, qué vías están involucradas en la reparación de los enlaces cruzados de las proteínas del ADN.

Esta técnica tiene el potencial de proporcionar una mejor comprensión de la respuesta al daño del ADN. Porque permite estudiar selectivamente la reparación de los enlaces cruzados de las proteínas del ADN y la ausencia de otros tipos de daño en el ADN. Aunque este método puede proporcionar información sobre la reparación de los enlaces cruzados de las proteínas del ADN, también se puede aplicar a otros tipos de daño en el ADN.

Tales como sitios abásicos y otros aductos bloqueadores de la polimerasa. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar la reparación de plásmidos que contienen aductos, en puntos de tiempo tan pronto como dos horas. Inicialmente, teníamos la intención de utilizar la reactivación de células domésticas para estudiar la reparación, sin embargo, esos ensayos no miden directamente la reparación o pueden sobrestimar la eficiencia de la reparación.

Especialmente si la ARN polimerasa puede leer a través de productos de reparación incompletos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de purificación y extensión de cebadores específicos de la hebra son difíciles de visualizar. Mezcle 20 microlitros de una solución que contenga 80 picomoles de un oligonucleótido que contenga ocho oxoguanina con cinco microlitros de tampón ligasa 10x.

Y añadir un microlitro de una solución que contenga 10 unidades de polinucleótido quinasa T4. Ajustar el volumen final a 50 microlitros e incubar el tubo en un baño de agua durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, constituimos la reacción de extensión del cebador en el hielo.

Configure el programa en el termociclador e inicie la ejecución. Después de la incubación, ajuste el volumen total a 375 microlitros agregando diferentes reactivos, enzimas y tampón. Luego incubar la reacción en un baño de agua a 37 grados centígrados durante la noche.

Para preparar una mezcla de fenil-cloroformo en una proporción de 50:50, agregue volúmenes iguales de fenol y cloroformo. A continuación, mezcle ambos componentes y centrifuga en una centrífuga de sobremesa a 21,130 g durante cinco minutos. Una vez finalizado el centrifugado, agregue 375 microlitros de la capa orgánica a la reacción de extensión del cebador. Mezclar.

Y de nuevo centrifugar a 21, 130 G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, pipetee con cuidado la capa superior. Y mezclar con acetato de amonio hasta una concentración final de 0,3 molar.

Y luego agregue dos volúmenes de etanol al 100%. Almacene la mezcla a menos 20 grados centígrados durante al menos 30 minutos o toda la noche. Una vez finalizado el período de incubación, centrifugar la muestra a 15.000 rpm a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, deseche el sobrenadante y lave el pellet con etanol al 70%. Vuelva a centrifugar la muestra en una centrífuga de mesa a 15.000 rpm durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en 100 microlitros de agua.

Combina 50 microlitros del ADN con 34 microlitros de agua y 16 microlitros de tinte 6x con carga de gel. Pase la muestra en un gel de agarosa de 10 centímetros al 0,8% de bajo punto de fusión que contenga 0,5 microgramos por mililitro de bromuro de etidio a dos voltios por centímetro durante seis horas en 1x tampón TAE. A continuación, utiliza una cuchilla de afeitar para extirpar el ADN superenrollado.

Y pesa la loncha de gel. A continuación, agregue un tampón de reacción de beta-agarasa de microlitros para digerir cada 10 miligramos de rodaja de gel. A continuación, incubar la rebanada a 65 grados centígrados durante 10 minutos, seguida de un enfriamiento a 42 grados centígrados en un termociclador.

Una vez que la rodaja de gel se haya disuelto y enfriado a 42 grados centígrados, agregue 10 unidades de beta-agarasa y déjela a 42 grados centígrados durante una hora en el termociclador. Después de una hora, mida el volumen de la rodaja de gel disuelta y agregue acetato de amonio hasta una concentración final de 0,3 molares e incube en hielo durante 15 minutos. Después de la incubación, centrifugar la mezcla a 15.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, recoja el sobrenadante y pipetee dos volúmenes de isopropanol y mezcle. Luego, almacene la mezcla a menos 20 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar el ADN superenrollado purificado en una centrífuga de mesa a 15.000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 40 microlitros de agua. A continuación, combine 15 microlitros de una solución que contenga 12 picomoles de ADN con un microlitro de una solución de 36 picomoles de oxoguanina glicosilasa en un tampón y ajuste el volumen final a 30 microlitros. Luego incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua.

Un día antes de la transfección, siembre las células en una placa de cultivo de seis pocillos. Al día siguiente, mezcle 1,5 microgramos del plásmido reticulado con 300 microlitros de medio de cultivo sin suero en un tubo, asegurándose de guardar un microlitro de ADN como punto de señal de hora cero. En otro tubo, mezcle 12 microlitros de reactivo de transfección con 300 microlitros de medio libre de suero.

A continuación, combine 300 microlitros de ADN reticulado con un volumen igual de reactivo de transfección diluido. E incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar. Después de la incubación, agregue 250 microlitros del complejo a cada uno de los dos pocillos e incube a 37 grados centígrados.

Después de un mínimo de una hora, retire el medio y agregue un mililitro de solución de dodecil sulfato de sodio al 0,6% con EDTA 0,1 molar e incube a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. A continuación, separe las celdas raspándolas con un policía de goma y transfiéralas a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros. A continuación, agregue 200 microlitros de solución de cloruro de sodio 5 molares a una concentración final de un molar e invierta el tubo cinco veces.

Luego incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar la muestra a 21,130 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante.

Y agregue acetato de amonio hasta una concentración final de 0.3 molar, mezcle y agregue dos volúmenes de etanol al 100% para precipitar el ADN. Almacene la mezcla a menos 20 grados centígrados durante un mínimo de 30 minutos. Después de la precipitación de etanol y la resuspensión de las muestras de ADN recuperadas en 50 microlitros de agua, diluir la muestra de hora cero en 500 microlitros de agua y constituir las reacciones de PCR utilizando las muestras no transfectadas y transfectadas.

A continuación, configure el programa en el termociclador e inicie la ejecución. Este paso de extensión del cebador transespecífico es crucial porque nos compra la amplificación de la hebra dañada. Si no se utiliza, los valores de delta CT serían inferiores a uno, lo que dificultaría la detección de niveles bajos de reparación de DPC.

Después de completar ocho ciclos, agregue 100 picomoles de la segunda imprimación. A continuación, mezcle un microlitro del ADN no amplificado de las muestras transfectadas y no transfectadas con 2x master mix, agua y 100 picomoles de ambos cebadores hasta obtener un volumen final de 60 microlitros. Cargue las muestras por triplicado en una placa de PCR de 96 pocillos.

Realice PCR cuantitativa durante 30 ciclos y promedie el umbral del ciclo para cada una de las muestras triplicadas. En este estudio, la QPCR se realiza con y sin extensión de cebador específica de la cadena para calcular el porcentaje de ADN plasmídico que se ha reparado. La diferencia en los valores del umbral del ciclo entre las muestras extendidas con cebador y las muestras no extendidas con cebador se denomina delta CT.As visto aquí, una muestra reparada sometida a SSPE-QPCR tiene un CT delta mayor que una muestra no reparada.

Los datos representativos del porcentaje de reparación calculado a partir de los valores de CT delta muestran que las muestras recuperadas después de tres horas de transfección están reparadas en un 66%, mientras que las muestras recuperadas después de ocho horas están reparadas en un 93%. Aquí se muestran los valores de fondo porcentuales calculados a partir de dos muestras de control con una eficiencia de reticulación de proteínas alta y baja, respectivamente. El bajo porcentaje de fondo presente en el control indica por qué solo se utilizan sustratos reticulados de manera eficiente para las transfecciones.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en dos o tres horas. Al intentar este procedimiento, es importante tomar muestras de tiempo cero para restar cualquier antecedente de este ensayo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de secuencia para responder a preguntas adicionales como: ¿es propenso a los errores de reparación de DPC?

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, transfectar y cuantificar la reparación de plásmidos que contienen aductos en células de mamíferos. No olvide que trabajar con fenol, cloroformo y bromuro de etidio puede ser peligroso. Y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y trabajar en una campana extractora.