Name: Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprende a evaluar la alcalinización lisosomal en el intestino de Caenorhabditis elegans usando el colorante cDCFDA. Este método simple y reproducible permite estudiar la autofagia y la función lisosomal en vivo.

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Nos gustaría agradecer a centro Caenorhabditis genética de las cepas, las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) y la Fundación de Canadá para la innovación (CFI) para la financiación. Nos gustaría agradecer a Dr. Lizhen Chen (Departamento de sistemas celular y anatomía, UT salud San Antonio) para permitir el uso irrestricto de sus instalaciones de laboratorio para todos los experimentos de C. elegans , así como el Dr. Exing Wang (Director asociado, centro de la proyección de imagen óptica UT salud San Antonio) para obtener ayuda con microscopía confocal. También nos gustaría agradecer a Dr. Myron Ignatius para proporcionar apoyo y aliento para facilitar la sesión de video.

1. Mancha y lisosomas intestinales de la imagen
<ol><li>Medios de cultivo nematodos de semilla (NGM) placas con OP50
	<ol>
<li>Preparar platos para NGM según el protocolo recomendado19 y permita que las placas cerradas secar por 2 días a temperatura ambiente.</li>
		<li>Inocular las bacterias OP50 en caldo estéril caldo de Luria (LB) y crecen en un baño incubador o agitación a 37 ° C durante 36 h o hasta que el OD es entre 0.2 y 0.4. Evitar el uso de un cultivo bacteriano con OD > 1 o OD < 0,2.</li>
		<li>Una vez seco planchas NGM, coloque una gota (30 μL) del inóculo OP50 en el centro de la placa y luego la gota en un parche más o menos que es de 2 cm x 2 cm de tamaño. Nota: Cualquier inóculo OP50 restantes puede almacenarse a 4 ° C por hasta un mes.</li>
		<li>Invertir las placas OP50 una vez que el inóculo ha secado (aproximadamente 10 o 15 min) y luego incubar las placas a 37 ° C durante 36 horas.</li>
		<li>Después de 36 h, quitar las placas de la incubadora y almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior. Nota: Las placas deben ser buenas para un máximo de 1 mes a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>CDCFDA que suple a OP50
	<ol>
<li>Para complementar cDCFDA sobre placas OP50, preparar una acción de trabajo de cDCFDA de 10 mM en dimetil sulfóxido (DMSO). Mantener la solución de cDCFDA protegida de la luz y almacenar a-20 ° C para su uso posterior.</li>
		<li>Suavemente coloque 100 μl de solución de cDCFDA de 10 mM sobre la superficie del parche OP50 2 cm x 2 cm, tal que la totalidad del parche está uniformemente cubierto con cDCFDA. Nota: Es muy importante que la totalidad del parche de OP50 está cubierto con cDCFDA. Si es necesario, utilizar hasta 150 μL de cDCFDA para cada placa. También es imprescindible que la solución de cDCFDA no se extiende más allá de las fronteras del parche OP50, puesto que cualquier cDCFDA que sale el parche OP50 no será incorporado a los alimentos y se traducirá en menor intensidad de la tinción.</li>
		<li>Coloque las placas OP50 en una caja oscura en la mesa hasta que todos los de la solución cDCFDA es absorbido en el parche bacteriano (generalmente alrededor de 25 a 30 minutos).</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción de gusanos usando cDCFDA
	<ol>
<li>Una vez que el cDCFDA ha permeado totalmente el parche OP50, colocar no más de 20 gusanos por placa e incubar las placas invertidas a 20 ° C durante un mínimo de 14 h. Nota: Se recomienda colocar las placas de cDCFDA en una caja opaca para minimizar la exposición a la luz.</li>
		<li>Controlar por las diferencias de consumo entre experimentos y normalizar las señales cDCFDA, (recomiendan) Mancha Co con () 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) Difluoro) boro (2,5 μl de una solución recién hecho de 1 mM), un colorante de acidotropic amina débil cuya fluorescencia es en gran parte no variante sobre el espectro de pH ácido (véase Tabla de materiales para los nombres comunes de reactivos). Nota: No mancha gusanos de menos de 14 h, ya que esto puede proporcionar la intensidad de la tinción inadecuada cDCFDA y dar una falsa interpretación del pH lisosomal.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de portaobjetos para microscopía
	<ol>
<li>Coloque dos tiras paralelas de etiquetado cinta unas 3 pulgadas aparte en una superficie plana lisa, como un espejo (figura 1).</li>
		<li>Capa de la superficie del espejo con spray repelente al agua y limpie el exceso de líquido.</li>
		<li>Derretir la agarosa al 2% (disuelto en agua destilada H2O) en el microondas hasta que totalmente licuado, luego coloque una gota 50 de μl de agarosa entre las dos tiras de cinta adhesiva y cubrir rápidamente la gota con un portaobjetos de microscopio, que es perpendicular a las tiras de la diapositiva cinta. Después de la agarosa ha solidificado, formando una almohadilla circular debajo de la diapositiva, voltee la diapositiva y agregar 10-15 μl de azida de sodio 5mM (NaN3) en la almohadilla de agarosa. Nota: NaN3 es un inhibidor del citocromo C que cuando se utiliza en bajas concentraciones, anestesia reversible gusanos para que no se mueva durante la proyección de imagen.</li>
		<li>Recoger gusanos de la placa OP50 complementado con cDCFDA y transferirlas a una placa limpia de NGM sin cualquier OP50. Que los gusanos a mover durante unos segundos permitir que la mayoría de los OP50 a eliminarse de la superficie de los gusanos y luego se transfieren los gusanos a la almohadilla de agarosa que contiene azida de sodio 5 mM.</li>
		<li>Cubra inmediatamente la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos. Asegúrese de colocar suavemente el cubreobjetos sin aplicar demasiada presión, ya que esto puede resultar en explosión de gusanos. Nota: Bacterias OP50 complementadas con cDCFDA fluorescencia cuando es visualizado por microscopía, por lo tanto es importante limpiar los gusanos lo mejor posible antes de colocar sobre la almohadilla de agarosa que contiene azida de sodio. Si preparando más de 6 cepas de C. elegans (incluyendo N2, control de tipo salvaje), es recomendable preparar las muestras en lotes de 6, con el fin de asegurar que los gusanos no seque sobre la almohadilla de agarosa. En algunas cepas, la vulva comienza a romperse después de largos períodos de tiempo debido a la presión de la hoja de cubierta, por lo que es importante planificar en consecuencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía confocal Nota: Algunos microscopios tienen una función incorporada que automáticamente aumenta la intensidad de fluorescencia para compensar niveles variables de fluorescencia. Estos microscopios pueden no funcionar bien para gusanos teñidas con cDCFDA, puesto que intrínsecamente aumentan la intensidad de fluorescencia de las muestras de la proyección de imagen.<ol>
<li>Realizar la proyección de imagen en un microscopio confocal estándar con longitudes de onda de excitación/emisión a 488/530 nm para cDCFDA. Solo plano imágenes (no Z-stacks) de lisosomas intestinales y utilizar sólo los lisosomas que se encuentran en foco (intensidad máxima) para la cuantificación de la intensidad. Nota: Tal vez debido a diferencias en la disponibilidad de tinte, lisosomas de las células intestinales directamente posteriores a la faringe mantienen cDCFDA tinción intensidad independientemente del genotipo o edad, por lo tanto debe tenerse cuidado para evitar imágenes de lisosomas de estas células.</li>
		<li>Imagen de la diapositiva que contiene 2 viejo tipo wild que N2 gusanos primero. Al hacerlo, ajustar los parámetros de proyección de imagen confocales como energía del laser, agujero de alfiler y apertura para garantizar que la cDCFDA intensidad de tinción no es sobresaturado. Nota: Una vez que estos ajustes se establecen, no cambiar para toda la duración de la proyección de imagen para ese día.</li>
		<li>Capturar imágenes de 1024 x 1024 píxeles de un solo plano del intestino (3 o 4 imágenes por gusano) usando un 60 X lente de aumento. Nota: El espectro de emisión de cDCFDA en gusanos producirá un solo pico prominente en 520 nm coincidiendo con su divulgado fluorescencia espectro20, proporcionando una lectura de la señal específica que es distinta de Autofluorescencia intestinal (figura 3).</li>
		<li>Exportar imagen confocal (ficheros .lsm) como archivos .tiff para cada canal.</li>
		<li>A continuación, abra ImageJ y haga clic en archivo | Abrir abrir el archivo de imagen para ser cuantificada. Una vez que se carga la imagen, utilice la herramienta de selección de forma ovalada en ImageJ para seleccionar una región de interés (ROI).</li>
		<li>Después de eso, haga clic en analizar | Medida para cuantificar la intensidad de la fluorescencia para ese retorno de la inversión. Seleccione 4 – 5 diferentes foco lisosomas por imagen y calcular la intensidad de fluorescencia relativa promedio de cada región de interés (ROI).</li>
		<li>Para cada imagen, medir la intensidad de la fluorescencia de fondo en una región del intestino entre lisosomas. Restar los valores de intensidad de fluorescencia de fondo de los valores de intensidad de fluorescencia lysosomal.</li>
		<li>En total, recogen alrededor de 30 a 50 valores normalizados individuales de intensidad cDCFDA (animales de 6 a 10) para cada cepa ensayada. Use estos valores para trazar un diagrama de caja y bigotes utilizando cualquier software estadístico apropiado. Nota: La coloración puede variar considerablemente dependiendo de factores como temperatura, tiempo de incubación y la salud general, edad de los animales que sólo son relevantes en proceso de muestras en el mismo experimento tinción comparaciones de intensidad de fluorescencia. Por lo tanto, es importante procesar controles en cada experimento de tinción. Calcular diferencias estadísticas (t-pruebas) utilizando cualquier software estadístico apropiado.</li>
		<li>Imagen todos las cepas del mismo experimento (teñido en el mismo día) en secuencia, teniendo cuidado de no para cambiar a cualquiera de los parámetros de la proyección de imagen.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Una variedad de eventos celulares y moleculares que contribuyen al envejecimiento, influenciado por características de historia de vida y factores genéticos. Nuestro reciente estudio22 sugiere que el ciclo reproductivo juega un papel importante en el control de la aptitud del soma a través de la regulación de la dinámica de pH lisosomal. Hemos mostrado que proteolisis lisosomal mediada es promovido mientras que animales se reproducen activamente upregulation de la transcripción de la v-ATPasa, que...

La aparición de agregados proteicos es ampliamente aceptada que un sello de envejecimiento en las células eucariotas1,2,3y la formación de los cuales se cree que entre los conductores de principio de senescencia celular4 , 5 , 6 , 7. Existe creciente evidencia que como células edad, catabolismo proteico se deteriora, provocando un aumento en la agregación de la proteína. El colapso de la proteólisis en el envejecimiento de las células conlleva una debilitación de la autofagia8 , así como de la degradación de proteínas mediada por proteasoma9. Finalmente, oxidación irreversible de la proteína aumenta en las células viejas, deteriorando aún más proteína catabolismo10.
Autofagia fue pensada inicialmente para ser un proceso no selectivo para la degradación de la mayor parte de proteínas dañadas, pero estudios recientes han indicado que la autofagia es altamente selectiva para el catabolismo de los agregados de proteínas y organelos disfuncionales que no son susceptibles a la degradación a través de otras proteínas separación mecanismos11. Durante el proceso de autofagia, proteínas dañadas y agregadas son secuestradas en una vesícula de membrana doble llamada el autophagosome. Este autophagosome entonces se funde con los ácidos organelos llamados lisosomas, que conduce a la degradación de la carga de autophagosome12. Lisosomas representan el punto final de la vía de la autofagia y participan en diversos procesos celulares tales como reparación de membrana, control transcripcional y detección de nutrientes; destacando su papel centralizado en la homeostasis celular (revisada en Ref. 13). Varios estudios han demostrado una asociación entre una disminución dependiente de la edad en la función lisosomal y de trastornos neurodegenerativos diversos13. Constantemente, restaurar la función lysosomal en células mayores puede retrasar la aparición de fenotipos relacionados con el envejecimiento14,15. Estudios de la composición del medio intralumen sugieren que el colapso de la función lysosomal en células mayores no es debido a una reducción en la producción de proteasas lisosomales16. Por otra parte, se ha propuesto que la pérdida de acidez produce, un requisito fundamental de su actividad enzimática, puede ser la base la disminución de la proteólisis mediada por el lisosoma17. Para poder explorar esta hipótesis, es esencial desarrollar los reactivos y protocolos para cambios dinámicos en pH lisosomal en células vivas de una manera coherente y replicable.
El intestino de C. elegans es el tejido metabólico importante en gusanos y es un regulador crítico de la homeostasis sistémica y la vida útil. Desarrollamos análisis para evaluar los cambios en la acidez del lumen intestinales lisosomas de gusanos para determinar cómo lisosoma-mediada de la proteólisis contribuye al envejecimiento. Aunque fluoróforos sensibles al pH han sido utilizados previamente en C. elegans para marcar lisosomas intestinales, sin embargo no ha habido un esfuerzo por establecer un protocolo exitoso que puede detectar pequeños incrementos en el pH lisosomal en vivo18. Presentamos un protocolo que puede utilizarse para detectar pérdida de acidez lisosomal de las células intestinales de C. elegans mediante un protocolo de alimentación sencillo y cómodo que incorpora un fluoróforo sensible al pH (cDCFDA) OP50 alimentos.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>Centro de Genética de Caenorhabditis</td><td>Haga su pedido en línea en https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td>diacetato de 5(6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Comúnmente conocido como cDCFDA</td></tr><tr><td>9-dietilamino-5H-benzo(a)fenoxazina-5-ona y (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipirrol-5-il-kappaN(1))metilideno]-2H-pirrol-5-il-kappaN}-N-[2-(dimetilamino)etil]propanamidato)(difluoro)boro</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Comúnmente conocido como Lysotracker</td></tr><tr><td>Microscopio confocal rojo (p. ej., Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Descargar gratis desde https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Caldo en polvo</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar Sigma</td><td></td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol en polvo</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 Sigma</td><td></td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espejo u otra superficie</td><td></td><td></td><td></td> plana lisa</tr></tbody></table>

evaluación de alcalinización lysosomal en el intestino de vivir caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un modelo que es ampliamente utilizado para el estudio de longevidad y las vías de desarrollo. Tales estudios son facilitados por la transparencia de los animales, la capacidad de marcha adelante y atrás ensayos genéticos, la relativa facilidad de generar proteínas fluorescencia de etiquetado y el uso de tintes fluorescentes que tampoco puede ser microinyectados en el temprano embrión o incorporado en su alimento (e. coli cepa OP50) etiquetar organelos celulares (e.g. 9-dietilamino-5 H-benzo (a) fenoxazina-5-one y (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aquí, presentamos el uso de un fluorescente tinte pH-sensible que tiñe lisosomas intestinales, proporcionando una lectura visual de los cambios dinámicas, fisiológicas en acidez lysosomal en gusanos vivos. Este protocolo no mide pH lisosomal, sino más bien tiene por objeto establecer un método confiable de evaluación fisiológicas variaciones relevantes en acidez lysosomal. cDCFDA es un compuesto celular florescente que es convertido a fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) al producirse la hidrólisis por esterasas intracelulares. Protonación dentro de lisosomas trampas cDCF en estos orgánulos, donde se acumula. Debido a su bajo pKa de 4.8, este colorante se ha utilizado como un sensor de pH en la levadura. Aquí describimos el uso de cDCFDA como suplemento del alimento para determinar la acidez de lisosomas intestinales en C. elegans. Esta técnica permite la detección de alcalinizantes lisosomas en animales vivos, y tiene una amplia gama de aplicaciones experimentales, incluyendo estudios sobre envejecimiento, autofagia y biogénesis lisosomal.

cDCFDA lisosomas tiñe de manera dependiente del pH y su pKa bajo y lista absorción en lisosomas es un sensor de pH ideal21. cDCFDA coloración de intensidad es inversamente proporcional al pH lisosomal (es decir, tinción intensidad los aumentos como disminuciones de pH)18,22. las señales cDCFDA son siempre débiles en los lisosomas de los animales tratados con 20 mM de la cloroquina, un inhibidor de ...

Una guía paso a paso para la pérdida de acidez lysosomal en el intestino de C. elegans con el colorante vital sensible a pH 6 - carboxi - 2', 7'-Diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)

Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar una pérdida relativa de acidez lisosomal en los lisosomas intestinales de C. elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la autofagia al proporcionar indirectamente información sobre la función lisosomal y la degradación de proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, económica, cómoda y reproducible.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos la técnica de tinción que se utilizaba para evaluar la alcalinización vacuolar en levaduras. La demostración visual de este método es importante porque ciertos pasos, como la adición de cDCFDA a los alimentos OP50 y el control de imágenes de gusanos de tipo salvaje de dos días de edad, son críticos. Después de preparar las placas NGM, deje que las placas se sequen a temperatura ambiente durante dos días con la tapa cerrada.A continuación, inocule la bacteria OP50 en el caldo estéril de Luria. Después de la inoculación, deje el inoculante en la incubadora hasta que la DO esté entre 0,2 y 0,4. Luego, coloque una gota del inoculante OP50 en el centro de la placa seca de NGM.A continuación, use un esparcidor para esparcir el inoculante en el parche aproximadamente dos por dos centímetros. Aproximadamente después de 15 minutos, invierta la placa OP50 después de que el inoculante se haya secado. Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante 36 horas.Una vez finalizada la incubación, transfiera la placa a cuatro grados centígrados hasta su uso. A continuación, prepare un material de trabajo de 10 milimolares cDCFDA en tampón M9. Almacene la solución de cDCFDA lejos de la luz a menos 20 grados Celsius.A continuación, pipetear 100 microlitros de 10 milimolares de cDCFDA para cubrir todo el parche OP50 de manera uniforme en la placa. Deje las placas cDCFDA en una caja oscura sobre la mesa de trabajo durante unos 30 minutos. Después de que el cDCFDA haya permeado completamente el parche OP50, transfiera 20 gusanos en la placa, luego deje la placa en condición invertida durante aproximadamente 14 horas a 20 grados Celsius.A continuación, tome dos tiras de cintas de etiquetado y colóquelas a 1,5 pulgadas de distancia sobre una superficie de espejo lisa y plana. Luego, cubre la superficie del espejo con un spray repelente al agua y elimina el exceso de líquido. A continuación, derrita el 2% de agarosa en agua destilada en el microondas.Después de que la agarosa se haya licuado, coloque una gota de agarosa entre las dos tiras de las cintas y cubra la gota con el portaobjetos del microscopio. Después de que la agarosa se haya solidificado en forma de una almohadilla circular debajo del portaobjetos, voltee el portaobjetos. Luego, agregue de 10 a 15 microlitros de azida de sodio de cinco milimolares en la almohadilla de agarosa.Ahora, transfiera los gusanos de la placa suplementada con cDCFDA a una placa NGM limpia sin ningún OP50. Deje que los gusanos se muevan durante unos segundos para que el OP50 se elimine de su superficie. Luego, transfiera el gusano a la almohadilla de agarosa que contiene cinco milimolares de azida de sodio.Cubra rápidamente la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos. A continuación, use una lente de aumento de 60X y capture imágenes en un solo plano del intestino de gusanos mutantes y de tipo salvaje de dos días de edad. A continuación, abra ImageJ y haga clic en el archivo.A continuación, haga clic en Abrir para abrir el archivo que se debe cuantificar. Una vez que la imagen se haya cargado, use la herramienta de selección de forma ovalada para seleccionar la región de interés. A continuación, haga clic en Analizar y, por último, en Medir para cuantificar la intensidad de fluorescencia de la región de interés.Para estudiar la actividad funcional lisosomal, se cuantifica la intensidad de la tinción de cDCFDA mediante imágenes confocal. En esta imagen, hay una robusta intensidad de señal de fluorescencia cDCFDA en los lisosomas intestinales de C.Elegans de tipo salvaje de segundo día. Esto indica un lisosoma ácido funcionalmente competente.Por el contrario, la intensidad de la fluorescencia se suprime considerablemente en los lisosomas intestinales de los gusanos de tipo salvaje de octavo día. Esto es en comparación con los lisosomas intestinales de los gusanos del segundo día. Los resultados indicaron la presencia de lisosoma alcalino funcionalmente incompetente en gusanos de octavo día.Curiosamente, la fluorescencia de cDCFDA en intensidad también se reduce notablemente en los gusanos de ARNi del segundo y octavo día en comparación con el gusano de tipo salvaje. Aquí, el gen vha, que codifica las subunidades vacuolares ATPasa en el revestimiento lisosomal, ha sido derribado en los gusanos del segundo y octavo día. Una vez dominado, todo este régimen de tinción y microscopía se puede completar en menos de 18 horas, si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar incubar los gusanos en el suplemento cDCFDA en el alimento OP50 durante al menos 14 horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la pérdida de acidez lisosomal en los lisosomas intestinales de C. elegans vivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Fuente: Le, T. A. N. , et al., Medición de los efectos de bacterias y químicos sobre la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra un ensayo basado en fluorescencia para cuantificar la permeabilidad intestinal en C. elegans expuesto a Pseudomonas aeruginosa. En comparación con los controles alimentados con Escherichia coli, los gusanos tratados con patógenos muestran una mayor fuga de fluoróforos hacia la cavidad corporal, lo que indica daño en...

Evaluación de la permeabilidad intestinal en C. elegans tras la exposición bacteriana

Este video describe un ensayo colorimétrico para la medición de lactato en lisados celulares mediante el uso de la enzima lactato deshidrogenasa. Esta enzima convierte el lactato en piruvato, junto con la conversión de NAD en NADH que reacciona con los colorantes de tetrazolio y da un producto coloreado que se puede medir espectrofotométricamente para cuantificar el lactato.

Ensayo colorimétrico para la cuantificación de lactato en muestras de ensayo

Se describen métodos para estudiar los aspectos de la amylopathies en el...

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

La transparente C. elegans intestino puede servir como una"en vivo cámara de tejido" para el estudio de apicobasal membrana y lumen biogénesis a nivel unicelular y subcelular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo describe cómo combinar etiquetas estándar, genética/pérdida de función RNAi y enfoques microscópicos para diseccionar estos procesos a nivel molecular.

El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

El canal excretor de C. elegans es un modelo único de celular solo para el análisis visual en vivo de la biogénesis de la membrana de nuevo polarizado. Este protocolo describe una combinación de genético estándar/ARNi y enfoques, adaptables para la identificación y caracterización de moléculas dirección tubulogenesis unicelulares y biogénesis de la membrana y lumen apical la proyección de imagen.

El Canal de Excretory C. elegans como modelo de morfogénesis Lumen intracelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada en una sola celda: etiquetado por fusiones de GFP, ARNi interacción pantalla e imagen

Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe cómo medir la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método es útil para la investigación biológica básica sobre la salud intestinal relacionada con la interacción entre las bacterias intestinales y su huésped y para la detección para identificar agentes probióticos y químicos para curar el síndrome del intestino con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales.

Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes

El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

La microscopia estimulada de la dispersión de Raman (SRS) permite la proyección de imagen selectiva, etiqueta-libre de mitades químicas específicas y se ha empleado con eficacia para las moléculas del lípido de la imagen in vivo. Aquí, proporcionamos una breve introducción al principio de la microscopía SRS y describimos métodos para su uso en el almacenamiento de lípidos por imágenes en Caenorhabditis elegans.

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

La enseñanza de las ciencias biológicas puede ser más estimulante para los estudiantes mediante el uso de la experimentación. Este manuscrito presenta dos protocolos diferentes pero complementarios que se pueden utilizar en el aula para alentar a los estudiantes a formular y probar hipótesis relacionadas con las dietas altas en calorías, la inanición y el envejecimiento.

Uso de tintes de bajo costo para visualizar la acumulación de glucógeno y la integridad intestinal en Caenorhabditis elegans

Aprende a evaluar la alcalinización lisosomal en el intestino de Caenorhabditis elegans usando el colorante cDCFDA. Este método simple y reproducible permite estudiar la autofagia y la función lisosomal en vivo.

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