Name: Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprende a analizar perfiles de mineralización en líneas celulares óseas humanas hFOB 1.19 y Saos-2 mediante microscopía electrónica de transmisión y microanálisis de rayos X. Este método permite estudiar la nucleación de apatita.

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MK y pedir realizar operaciones manuales y LB había preparado dibujos e hizo la película. PREGUNTA escribió el manuscrito, LB escribió el guión y MK había preparado la mesa. SM, RB y SP leen críticamente la tabla, el script y el manuscrito. Los autores desean agradecer a Hanna Chomontowska por su excelente asistencia ultramicrotomía como Szymon Suski y Henryk Bilski por su excelente ayuda con análisis de TEM-EDX. Los autores desean dar las gracias a Dr. Patrick para corrección de inglés profesional y Barbara Sobiak para las instrucciones de la grabación.
Este trabajo fue financiado por beca N N401 140639 del Ministerio polaco de ciencia y educación superior para pedir, por subvenciones del Centro Nacional de ciencia, Polonia 2016/23/N/NZ4/03313 LB y 2016/23/N/NZ1/02449 a MK, UE FP7 proyecto BIOIMAGINE : BIO-proyección de imagen en investigación, innovación y educación, GA Nº 264173 y por los fondos legales del Instituto de Biología Experimental Nencki, Polaco Academia de Ciencias.

1. la cultura y el tratamiento de la célula
<ol><li>Poner todos los materiales necesarios bajo la campana de flujo laminar y esterilización bajo luz UV. Los medios de cultivo son: una mezcla 1:1 del jamón de medios F12 y DMEM con 2,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL 0.3 mg/mL G418 y 10% suero bovino Fetal (FBS) (v/v) para antígeno de T grande de SV40 feto humano hFOB 1.19 transfectadas osteoblastos y medio de McCoy 5A 1,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL y 15% FBS (v/v) para las células de osteosarcoma humano Saos-2.</li>
	<li>La cultura hFOB 1.19 células a 34 ° C en una atmósfera de 5% CO2 y células Saos-2 a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2. Cultivos de células, o células de 1.19 o Saos-2 hFOB, la transferencia desde la incubadora a la campana de flujo laminar y cambiar el medio a 10 mL de medio de cultivo fresco con FBS.</li>
	<li>Incube las células sin estimuladores (las células de reclinación) o estimular con 50 μg/mL de ácido ascórbico (AA) seguido por 7.5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparado en agua ultrapura y filtrada a través de filtros de la jeringuilla de 0,22 μm. Añadir los estimuladores de los tubos de microcentrífuga de plástico sobre la superficie del medio de cultivo. Suavemente Remueva la placa de cultivo e incubar durante 7 días.</li>
</ol>2. detección de minerales de calcio
<ol><li>Lavar los cultivos celulares con tampón fosfato salino (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1 m m KH2PO4, pH 7.0).</li>
	<li>Añadir 5 mL de 2% (g:100 mL) AR-S en PBS, pH 5.0 e incubar las placas durante 30 min a los minerales de la mancha.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBS. Cuidadosamente añadir PBS a la pared del plato, tratar de no destruir los minerales.</li>
	<li>Observar minerales calcio bajo un microscopio de luz invertido y tomar imágenes.</li>
</ol>3. visualización de sondas bajo luz UV
<ol><li>Para lysates de la célula, tratamiento de cultivos celulares, ya sea descansando o estimulado por 7 días, según la colagenasa digestión protocolo24.</li>
	<li>Reunir el medio de cultivos celulares y lavan las células con PBS.</li>
	<li>Digerir las células con 3 mL de 500 colagenasa U/mL en una solución de 0.25 M sacarosa, 0.12 M de NaCl, 0.01 M KCl y 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 7,45, a 37 ° C durante 3 horas.</li>
	<li>Mecánicamente raspar las células transferirlas a tubos de microcentrífuga de plástico y pasar 10 veces a través de una jeringa de U 1 mL 40 0,5 × 16 aguja.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 500 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 500 μl de la linfa de cartílago sintético (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosa, sacarosa de 63 mM, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).</li>
	<li>Transferencia de la hidroxiapatita (HA), Fluorapatito (FA) y polvos chlorapatite (CA) de las botellas en el transiluminador de UV con una espátula y utilizar como controles.</li>
	<li>Transferir los lysates de la célula de los tubos de plástico con puntas de plástico y coloque cuidadosamente sobre el transiluminador de UV.</li>
	<li>Tomar imágenes en el visible y UV luz.</li>
</ol>4. preparación de sondas de TEM-EDX
<ol><li>Preparación de minerales para la tinción negativa<ol>
<li>Suspender 2,5 mg de sintéticamente producido HA, CA y FA minerales25 en 500 μl de agua desionizada e incubar a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 para 1 h.</li>
		<li>Toma rejillas de Formvar carbón 300 malla Ni de la caja con pinzas antiestáticas, coloque en un Platón de varios pocillos de porcelana y colocar 10 μl de las suspensiones HA, CA y FA en las rejillas.</li>
		<li>Secar las muestras durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la reclinación y estimula las células para empotrar 26<ol>
<li>Recoger medio de los cultivos celulares y lavan las células con el medio fisiológico desensibilización (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, glucosa 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7,4).</li>
		<li>Fijar las células con 5 mL de una mezcla de glutaraldehído de paraformaldehyde/1% (g:100 mL) (mL g:100) de 3% en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.2, por 1 h a temperatura ambiente bajo la campana.</li>
		<li>Lavar las células con 5 mL de tampón de fosfato de sodio 100 mM y retire suavemente el buffer después del lavado.</li>
		<li>En el cuarto oscuro, postfix las muestras con 2 mL de tetróxido de osmio 1% (g:100 mL) en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.2, por 20 min a temperatura ambiente bajo la campana.</li>
		<li>Retire el tetróxido de osmio y utilizarlo.</li>
		<li>Lavar las células con 5 mL de 100 mM de tampón fosfato de sodio.</li>
		<li>Entonces, deshidratan las muestras en alícuotas de 5 mL de una serie de solución de etanol gradual en la temperatura ambiente: 25% (vol.) por 5 min, 50% (por volumen) por 10 min, 75% (por volumen) durante 15 min., 90% (en volumen) por 20 min. Finalmente utilizar etanol absoluto dos veces e incubar durante 30 min y 12 h.</li>
		<li>Mecánicamente raspar las células de los platos de cultura de Petri plásticos, recoger en tubos de microcentrífuga de plástico y centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante y suspender las células en 1 mL de una mezcla de la resina LR White y etanol absoluto en una proporción de volumen de 1:2.</li>
		<li>Mezclar bien el contenido de los tubos de vidrio antes de su uso e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante y repetir el paso anterior con 1 mL de una mezcla 1:1 de resina LR White y etanol absoluto.</li>
		<li>Mezclar bien e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Finalmente, añadir 1 mL de resina pura LR White a las muestras dos veces e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en tubos de plástico.</li>
		<li>Coloque 500 μl de cada muestra en cápsulas de gelatina. Nota: Las muestras se etiquetan usando una pequeña hoja de papel y un lápiz para que la resina no destruya las etiquetas.</li>
		<li>Cierre de las cápsulas de gelatina, poner en los tubos de microcentrífuga de plástico y centrifugar a 130 x g durante 1 min en un rotor de salida.</li>
		<li>Retire las cápsulas de los tubos de plástico con una bomba de vacío.</li>
		<li>Mover las muestras en el horno y polimerizar a 56 ° C durante 48 h.</li>
		<li>Preparar los bloques de montaje en el soporte y ajuste a la pirámide.</li>
		<li>Poner el soporte en el ultramicrótomo, coloque el cuchillo del diamante Ultra 45° y llenar con agua desionizada; no olvide limpiar la lámina de burbujas incidentales.</li>
		<li>Luego cortar secciones (700 Å) usando el cuchillo del diamante en el baño de agua desionizada.</li>
		<li>Fijar los trozos utilizando pestañas bovina y el lugar en el lado brillante del carbón/Formvar 300 malla rejilla Ni y séquelos.</li>
		<li>Preparación de acetato de uranilo de 2.5% (por volumen) en etanol absoluto en la oscuridad bajo una campana de humos. Mantenga el acetato de uranilo en un recipiente de plomo y no olvide recoger el sedimento.</li>
		<li>En el cuarto oscuro, contratinción las rejillas de las apatitas sintéticas y muestras de células con acetato de uranilo de 2.5% (por volumen) de etanol por 20 min a temperatura ambiente bajo la campana.</li>
		<li>Lave las rejillas en etanol 50% (por volumen), luego en agua desionizada y secar a temperatura ambiente durante 24 h. Por último, poner las rejillas en la caja.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. TEM-EDX análisis
<ol><li>Proyección de imagen de TEM de un microscopio electrónico de transmisión (TEM) equipado con microanálisis de energía dispersiva de rayos x de gama completa (EDX) sistema y 11 megapíxeles cámara<ol>
<li>Preparar un soporte de berilio para la observación de células y minerales. Utilice herramientas antiestáticas.</li>
		<li>Quitar el par de tornillos y levante la placa de berilio y berilio arandela lejos del resto del retenedor.</li>
		<li>Monte el grid, el lado brillante hacia arriba, en el soporte.</li>
		<li>Con cuidado coloque la arandela de berilio y berilio placa y atornille firmemente los tornillos de fijación.</li>
		<li>Poner el soporte en la cámara de vacío y encienda la bomba de vacío.</li>
		<li>Una vez que se consigue un vacío, suavemente inserte el soporte en la cámara de proyección de imagen y gire en la viga.</li>
		<li>En la pantalla fluorescente, configure los parámetros de la abertura del microscopio. Realizar la corrección de astigmatismo la imagen; establecer el zoom, enfoque y marco; y tomar imágenes TEM en un aumento de 50, 000 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proyección de imagen de madre y microanálisis de rayos x para análisis espectral y composición<ol>
<li>Insertar el detector de energía dispersiva por rayos x (EDX) en la cámara imágenes de la microscopia electrónica (STEM) exploración de transmisión.</li>
		<li>Ajustar la nitidez de la imagen en el modo de enfoque.</li>
		<li>Tomar imágenes de la madre en un aumento de 15, 000 X.</li>
		<li>Seleccione un punto en la muestra para el microanálisis de rayos x y recoger los espectros.</li>
		<li>Obtener datos por la suma de los pesos atómicos de todos los elementos de la tabla periódica en la muestra (como 100%) y lo que significa el contenido de elementos seleccionados: Ca, Cl, F y P (% atómico). A continuación, calcular los ratios de Ca, F o Cl p para cada muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asignación de ion<ol>
<li>Seleccionar elementos como el calcio, flúor, cloro y fósforo para hacer mapeo de ion y realizar mapas de EDX de los elementos seleccionados en las muestras.</li>
		<li>Obtener datos indicando la localización de los elementos analizados: Ca, Cl, F y P (% atómico) y calcular la co-localización (en %) de Ca, F o Cl p para cada muestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

En el documento actual, describen los protocolos para AR-S coloración, identificación de luz UV de Fluorapatito y TEM-EDX en vitro la proyección de imagen de MVs por mineralización de las células y de los minerales producidos por MVs. Es posible tratar todos los métodos mencionados siguiendo algunos pasos de solución de problemas comunes. Para obtener resultados óptimos, deben realizarse varios pasos críticos cuidadosamente. En primer lugar, es mejor añadir AA (que es ácido) seguida por β-GP (que es alc...

El hueso es un tipo de tejido conectivo compuesto de dos partes: orgánica (células y fibras de colágeno) y minerales (compuestos de calcio y fosfato). Los principales componentes minerales en los huesos son apatitas1. Diferentes tipos de células competentes de mineralización en el hueso (osteoblastos), dientes (odontoblastos) y cartílago (condrocitos) regulan los pasos iniciales de mineralización produciendo proteínas de la matriz extracelular (ECM) y liberación de matriz vesículas (MVs) (figura 1). MVs son vesículas de 100 a 300 nm de diámetro que acumulan calcio y fosfato facilita la nucleación de apatita y posteriormente se unen al colágeno2,3. Entonces, MVs se desintegran para liberar apatitas al medio extracelular. Las apatitas continúan creciendo en contacto con las fibras de colágeno y forman la matriz ósea. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca2 + en el medio extracelular. Algunos datos publicados recientemente apoyan nuestro modelo4,5. Los tejidos blandos no mineralizarse bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la calcificación ectópica puede ocurrir en condiciones patológicas tales como calcificación vascular3. Las células vasculares que adquieren el fenotipo de osteoblastos pueden producir MVs que inducen la nucleación de apatitas e inician la mineralización en las capas íntimas y mediales de la pared de los vasos sanguíneos. Desde calcificación ectópica se asemejan a endocondral normal mineralización3, entender los mecanismos moleculares de la mineralización de las células óseas y condrocitos deben proporcionar algunas pistas sobre la calcificación ectópica de los tejidos blandos que son formado.
El desarrollo de tejidos esqueléticos está regulado por diversas enzimas, factores de crecimiento y promotores o inhibidores de la mineralización. La acción antagónica de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP) (figura 1) y ectonucleotide pirofosfatasa/fosfodiesterasa I (NPP1), junto con ankyrin (ANK), controla la concentración de pirofosfato inorgánico (PP) 6. PP, un potente inhibidor de la formación de HA, es hidrolizado por TNAP; NPP1 hidroliza trifosfatos de nucleótidos para formar PP mientras ANK las exportaciones de PP de la célula al ECM. La proporción Pi/PPi puede regular la formación de apatita7,8 con posibles consecuencias patológicas9.
La membrana de MV se enriquece en proteínas de transporte de iones que facilitan la precipitación inicial de calcio y fosfato en el MVs durante el proceso de nucleación (figura 1). El transportador de fosfato 1 (hoyo) ayuda a incorporar P genera en el espacio perivesicular en la MVs10,11. Anexinas pueden estar implicado en el atascamiento y el transporte de Ca2 + y en el proceso biofísico que inicia la mineralización en el MV lumen12,13. Privilegiamos la hipótesis, sugerida anteriormente, para la mineralización dentro de vesículas intracitoplasmáticas de nucleación interna de apatita dentro de la MV antes de su propagación en el ECM14,15. Modelado in vitro confirmaron la inducción de la Ca2 +/P complejos formación en proteoliposomes de PS y AnxA516. Esto puede indicar que la acumulación de Ca2 +, P, complejos AnxA5 y PS en las balsas lipídicas de las microvellosidades-como membranesrepresent el núcleo nucleación (NC) de apatita dentro de Mvs anexinas y TNAP también poseen colágeno vinculante capacidades que pueden ayudar en la colocación de MVs a lo largo de las fibras de colágeno y en estimular la propagación de la mineralización en el ECM. Fetuin A y17de la osteopontina (OPN), son conocidos como inhibidores de la formación de apatita que puede ralentizar la propagación de la mineralización en el andamio colagenosa. Nucleación y propagación son eventos distintos, el primero anterior a éste, y ambos pueden ser relevantes para el proceso de mineralización patológica.
Para descubrir cómo puede cambiar la química de complejos de fosfato de calcio calcificación ectópica y mineralización fisiológica, es necesario identificar los minerales producidos por las células. Apatitas son un grupo de calcio y fosfato que contiene minerales con el cristal general unidad celular fórmula Ca10(PO4)6X2, donde X = Cl, F, OH. Se clasifican de la siguiente manera18: Fluorapatito (FA) Ca10(PO4)6F2y chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 de hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.
La elección de las líneas celulares de osteoblastos para inducir la formación de minerales es crucial, puesto que cada línea celular exhibe un perfil distinto de mineralización. En este informe, en comparación con la nucleación de minerales por dos modelos de células humanas las de mineralización: células osteoblásticas hFOB 1.19 y células de osteosarcoma Saos-2. Las células derivadas de osteosarcoma se utilizan comúnmente como modelos osteoblásticos y células Saos-2 conservan la más madura de carácter osteoblástico19 mientras que las células indiferenciadas hFOB fetal humano son ampliamente utilizadas como modelo para osteoblástica normal diferenciación20. Sus perfiles de mineralización se analizaron mediante diferentes métodos: tinción rojo de alizarina-S (AR-S), ULTRAVIOLETA (UV) luz la visualización, la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión, cuantificación de microanálisis (EDX) de rayos x dispersivo energía y ion asignación. La ventaja de TEM-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas en estudios previos es que da resultados cuantitativos y cualitativos de la sustitución de iones en cristales de apatita4,5,21. El objetivo de utilizar las TEM-EDX era encontrar un método simple para la proyección de imagen y cuantificación de la distribución de los iones Ca, F y Cl en varios minerales de diferentes tipos de células en distintas etapas del proceso de mineralización. Este método ha sido utilizado con éxito, por ejemplo, para monitorear la interacción de las nanopartículas de zinc con productos químicos coexistentes y sus combinados efectos en organismos acuáticos22. En otro estudio, un fotocatalizador cobre en materiales de titanio en solución acuosa se caracterizó ampliamente por medio de espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), DRX, DRS de UV-vis, FT-IR, Raman Espectroscopia, TEM-EDX y fotoelectroquímicos medidas23. Nuestro objetivo fue comparar el origen y las propiedades de las vesículas y los minerales en dos líneas celulares para entender el mecanismo que controla la mineralización durante la diferenciación ósea.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Figura 1 . Esquema de los pasos iniciales de la mineralización en las células óseas que implican la síntesis de proteínas de matriz extracelular (ECM) y liberación de vesículas de la matriz (MVs) de la membrana. MVs acumulan calcio a través de la acción de proteínas calcio, anexinas y fosfato, a través de la acción de un transportador de fosfato inorgánico (PiT) seguido por la actividad de tejido no-fosfatasa alcalina específica (TNAP), que desfosforila PP a P, facilitando así el nucleation de la apatita. Entonces, MVs se desintegren y liberen apatitas al medio extracelular. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca2 + en el medio extracelular4,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jamón' s Mezcla de medios DMEM/F12</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, para feto humano hFOB 1.19 SV40 antígeno T grande transfectado osteoblastos (ATCC CRL-11372)</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A medio</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>para osteosarcoma humano Células Saos-2 (ATCC HTB-85)</td></tr><tr><td>Mezcla de antibióticos (penicilina/estreptomicina)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>100 U/mL cada uno</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% para hFOB 1,19 y 15% para Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7.5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP</td><td>Gel Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>para HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td><td>sintetizado por nosotros CA sintetizado por nosotros</td></tr><tr><td>CA</td><td></td><td></td><td>sintetizado por nosotros</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato de sodio Na2HPO4/NaH2PO4 mezcla</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.0, preparado por nosotros</td></tr><tr><td>AR-S en PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0.5 g/100 mL, pH 5.0</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> SCL <td>preparado por nosotros</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> desionizada <td>producida por nosotros</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>absoluto 99.8% y soluciones 25, 50, 75, 90%</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo en etanol al 50%</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0,25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD medio</td><td></td><td></td><td>pH 7,4, preparado por nosotros</td></tr><tr><td>Mezcla de fijación (paraformaldehído/glutaraldehído)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>Post-fijación OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR Resina blanca en etanol</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2, 1:1, 100%</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td></td></tr> <tr><td>viales > puros<fuertesHerramienta</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>criogénicos</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1,2 mL</td></tr><tr><td>Placas de plástico para cultivo de Petri</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Tubos de plástico</td><td>Falcon</td><td>352096 y 352070</td><td>15 y 50 mL</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>Falcon y VWR</td><td>357521 y 612-3700</td><td>1 y 10 mL</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de plástico</td><td>Sigma</td><td>Z688312 y Z628034</td><td>1,5 mL negro y 2 mL transparentes</td></tr><tr><td>Puntas de plástico</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 y 613-1050</td><td>0.1-10 y micro; L natural, 1-200 y micro; L amarillo y 200-1000 &micro; L azul</td></tr><tr><td>Bastidores de plástico Light Labs</td><td></td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>verde para tubos, naranja para microtubos y azul para sondas TEM</td></tr><tr><td>Laminar Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td>Filtro HEPA <td>KS12</td><td>(H14 según DIN EN 1822)</td></tr><tr><td>Incubadoras Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34 y grados; C para hFOB 1.19 y 37&deg; C para Saos-2</td></tr><tr><td>Campana extractora</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>para tinciones TEM</td></tr><tr><td>Frascos de vidrio</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 y 1632414501100</td><td>50 y 100 mL</td></tr><tr><td>Tubos de vidrio de cuarzo</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100 mm</td></tr><tr><td>Bomba</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE confort</td><td>para vacío</td></tr><tr><td>Horno</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&deg; C</td></tr><tr><td>Plato multipocillo de porcelana</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 pocillos Vasos de precipitados de</td></tr><tr><td>vidrio</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Frascos de vidrio</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Caja de plástico</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>para la oscuridad</td></tr><tr><td>Snap Fit Cápsulas de gelatina</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>tamaño 1</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 300 Malla Rejillas de Ni en caja</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>Película S162N3</td><td>en el lado brillante</td></tr><tr><td>Raspador de celdas de silicona</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>tamaño 1,8/25 cm</td></tr><tr><td>Jeringa con aguja</td><td>BogMark</td><td>007</td><td>jeringa 1 mL 40 U, aguja 0,5 x 16</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Chirana</td><td>CH005L</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Centrífuga</td><td>MPW Medical Instruments</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g y 500 x g</td></tr><tr><td>Transluminador UVP</td><td></td><td>M-20</td><td>para luz visible y UV</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>LKB NOVA</td><td></td><td>700&Aring; secciones</td></tr><tr><td>Soporte de bloque</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>forma redonda</td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>Talla 3</td></tr><tr><td>Portapestañas</td><td></td><td></td><td>bovino, preparado por nosotros</td></tr><tr><td>Pinza</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>antiestática para rejillas</td></tr><tr><td>Juego de espátulas</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>antiestático para polvos</td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscopio</td><td>Zeiss con Canon</td><td>AxioObserver Z1 equipado con PowerShot G9</td><td>Contraste de fase, luz transmitida, objetivo 20x, filtros RGB</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>TEM Jeol Co. con Oxford Instruments y SiS-Olympus</td><td>JEM-1400 TEM equipado con sistema de microanálisis de rayos X (EDX) de dispersión de energía INCA de rango completo y cámara MORADA G2 de 11 megapíxeles</td><td>Aumento de 50.000X para TEM y 15.000X para STEM y EDX</td></tr><tr><td>Cuerpo de la cámara y lentes</td><td>Nikon</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>para grabaciones de vídeo</td></tr><tr><td>Micrófono</td><td>MXL</td><td>Mics Tempo</td><td>para grabaciones de voz</td></tr></tbody></table>

análisis de minerales producidos por hfob 1.19 y saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Este video presenta el uso de microscopía electrónica de transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía (TEM-EDX) para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Estas líneas celulares, después del tratamiento con ácido ascórbico (AA) y β-glicerofosfato (β-GP), experimentar transdifferentiation osteogénico completado de proliferación a la mineralización y producen vesículas de matriz (MVs) que provocan la nucleación de apatita en la matriz extracelular (ECM).
Basado en la tinción de rojo de alizarina-S (AR-S) y análisis de la composición de minerales en los lysates de la célula con luz ultravioleta (UV) o en vesículas usando proyección de imagen de TEM seguido por EDX cuantificación y mapeo de ion, podemos inferir que el osteosarcoma Saos-2 y osteoblástica las células hFOB 1.19 revelan perfiles de mineralización distinta. Las células SAOS-2 mineralizar más eficientemente que las células hFOB 1.19 y producen depósitos minerales más grandes que no son visibles bajo luz UV, pero son similares a la hidroxiapatita (HA) en que tienen sustituciones más Ca y F.
Los resultados obtenidos con estas técnicas nos permiten concluir que el proceso de mineralización es diferente dependiendo del tipo de célula. Proponemos que, a nivel celular, el origen y las propiedades de las vesículas predeterminan el tipo de minerales.

TEM-EDX permite el en vitro la proyección de imagen de vesículas de la matriz (MVs) lanzadas por mineralización de las células y de los minerales producidos por Mfrente a los resultados obtenidos con esta técnica demuestran que el proceso de mineralización puede proceder de manera diferente en varios tipos de células. Las líneas dos celulares recibieron el mismo tratamiento de transdiferenciación osteoblástica, pero estimulada células Saos-2 más eficientemente que hFOB m...

Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).

Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Durante los pasos iniciales de la mineralización, las células producen proteínas de la matriz extracelular y liberan vesículas de la matriz que acumulan calcio y fosfato para facilitar la nucleación de la apatita. En este informe, comparamos la nucleación de minerales por dos modelos de células humanas seleccionadas, células osteoblásticas hFOB 1.19 y células osteosarcoma Saos-2. Sus perfiles de mineralización se analizaron por diferentes métodos.Coloque todos los materiales debajo de la laminar y esterilícelos bajo luz ultravioleta. Cambie el medio a 10 mililitros de medio de cultivo fresco con suero fetal bovino. Las células en reposo se incuban sin estimuladores, mientras que las células estimuladas se tratan con ácido ascórbico y beta-glicerofosfato.Primero, deje caer suavemente el ácido ascórbico hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro sobre la superficie del medio de cultivo para estimular las células. A continuación, agregue beta-glicerofosfato a la concentración final de 7,5 milimolares en el medio de cultivo para estimular las células. Revuelva suavemente la placa de cultivo y colóquela en la incubadora durante siete días.Después de siete días de incubación, lavar los cultivos celulares con solución salina tamponada con fosfato, PBS. Agregue cinco mililitros de rojo de alizarina al 2% e incube la placa durante 30 minutos para manchar los minerales. Lavar tres veces con PBS.Agregue con cuidado PBS a la pared del plato. Trata de no destruir los minerales. Observa los minerales bajo un microscopio de luz invertida.Recoja el medio de los cultivos celulares y lave las células con PBS. Digiera las células en reposo o estimuladas durante siete días con 500 unidades por mililitro de solución de colagenasa a 37 grados durante tres horas. Luego, raspe mecánicamente las celdas.Transfiéralos a tubos de microcentrífuga de plástico. Pásalos por una jeringa 10 veces. Centrifugar las muestras a 500 g durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet celular en 500 microlitros de linfa de cartílago sintético. Transfiera los polvos de hidroxiapatita, fluorapatita y clorapatito de las botellas en el transiluminador UV con una espátula y utilícelos como controles. Transfiera los lisados celulares de los tubos de plástico con puntas de plástico y colóquelos con cuidado en el transiluminador UV.Suspenda 2,5 miligramos de polvos de hidroxiapatita, fluorapatita y clorapatito en 500 microlitros de agua desionizada. Incubar a 37 grados durante una hora. Tome rejillas de Formvar/níquel de carbono de la caja con pinzas antiestáticas y colóquelas en una placa de porcelana de varios pocillos.Deje caer 10 microlitros de la suspensión de hidroxiapatita en las rejillas. Haga lo mismo con la clorapatito y la fluorapatita. Seque las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente.Prepare las células en reposo y estimuladas para la inclusión. Recoja el medio de los cultivos celulares. Lavar las células en un medio de desensibilización fisiológica.Fije las celdas con cinco mililitros de una mezcla de 3% de paraformaldehído y 1% de glutaraldehído en tampón de fosfato de sodio de 100 milimolares durante una hora a temperatura ambiente debajo de la campana extractora. Lave las células con cinco mililitros de tampón de fosfato de sodio de 100 milimolares. Retire suavemente el tampón después del lavado.En el cuarto oscuro, coloque el prefijo de las muestras con dos mililitros de tetróxido de osmio al 1% en tampón de fosfato de sodio de 100 milimolares. Incubar las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente bajo la campana extractora. Elimine el tetróxido de osmio y utilícelo.Lave las células con cinco mililitros de tampón de fosfato de sodio de 100 milimolares. Luego, deshidrate las muestras en alícuotas de cinco mililitros de una serie de soluciones de etanol graduadas a temperatura ambiente, 25, 50, 75 y 90% de etanol. Finalmente, use etanol absoluto dos veces e incube durante 30 minutos y 12 horas.Raspar mecánicamente las células de las placas de cultivo. Recoja las células en tubos de microcentrífuga de plástico. Centrifugar las muestras a 130 g durante un minuto.Retire los sobrenadantes. Suspenda las celdas en una mezcla de resina LR White y etanol absoluto en una proporción de volumen de uno a dos. Mezclar bien e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Centrifugar las muestras a 130 g durante un minuto. Retire los sobrenadantes. Repite el paso anterior utilizando una mezcla uno a uno de resina LR White y etanol absoluto.Mezclar bien e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar las muestras a 130 g durante un minuto. Retire los sobrenadantes.Añade resina LR White pura a las muestras e incuba durante una hora a temperatura ambiente en tubos de plástico. Centrifugar las muestras a 130 g durante un minuto. Retire los sobrenadantes.Añade de nuevo resina LR White pura. Coloque 500 microlitros de cada muestra en cápsulas de gelatina. Tenga en cuenta que las muestras se etiquetan con una pequeña hoja de papel y un lápiz para que la resina no destruya las etiquetas.Cierre las cápsulas de gelatina. Coloque las cápsulas en tubos de microcentrífuga de plástico. Centrifugar a 130 g durante un minuto en un rotor basculante.Retire las cápsulas de los tubos de plástico con una bomba de vacío. Traslade las muestras al horno y polimerice a 56 grados durante 48 horas. Prepare los bloques montándolos en el soporte.Coloque el soporte en el ultramicrótomo. Coloque el cuchillo de diamante. Llénalo con agua desionizada.Recuerde, limpie la cuchilla de las burbujas de aire incidentales. Luego, corte secciones con un cuchillo de diamante en el baño de agua desionizada. Fije los restos con pestañas bovinas.Luego, colóquelos en el lado brillante de la rejilla de Formvar / níquel de carbono y séquelos. En la habitación oscura, contratiña las rejillas de apatitas sintéticas y muestras de células con acetato de uranilo al 2,5% en etanol durante 20 minutos a temperatura ambiente bajo la campana extractora. Lave las rejillas con etanol al 50%, luego con agua desionizada y séquelas a temperatura ambiente durante 24 horas.Finalmente, coloque las cuadrículas en la caja. Prepare el soporte de berilio para la observación de minerales y células. Utilice herramientas antiestáticas.Retire el par de tornillos. Levante la placa de berilio y la arandela de berilio para separarla del resto del retenedor. Monte la rejilla, con el lado brillante hacia arriba, en el soporte.Coloque con cuidado la arandela de berilio y la placa de berilio. Atornille firmemente los tornillos de fijación. Coloque el soporte en la cámara de vacío y encienda la bomba de vacío.Una vez que se logre un vacío, inserte suavemente el soporte en la cámara de imágenes y encienda el haz. En el monitor fluorescente, ajuste los parámetros de apertura del microscopio. Realizar la corrección del astigmatismo de la imagen.Establezca el zoom, el enfoque, el encuadre y tome una imagen de microscopía electrónica de transmisión. Mueva el detector a la cámara de imágenes. Ajuste la nitidez de la imagen en el modo de enfoque.Seleccione un punto de la muestra para el microanálisis de rayos X y recopile espectros. Seleccione elementos como calcio, flúor, cloro y fósforo para realizar un mapeo de iones y realice mapas de los elementos seleccionados. Las células Saos estimuladas mineralizaron de manera más eficiente que los osteoblastos hFOB.Solo se pueden observar fluorapatitas bajo la excitación de la luz UV. Los lisados de células HFOB fueron más fluorescentes que los Saos, lo que sugiere que las fluorapatitas son más abundantes en estas células. Las células Saos estimuladas producen más vesículas que contienen minerales en comparación con las células hFOB y las células Saos en reposo.Las apatitas sintéticas tenían diferentes formas minerales. El procedimiento aplicado anteriormente mostró la presencia de vesículas en las células hFOB y Saos en condiciones de reposo y estimuladas. Los puntos rojos indican las distribuciones de calcio, fósforo verde y flúor azul.En condiciones estimuladas, hubo una fuerte superposición entre las distribuciones de calcio y fósforo en las vesículas producidas por las células Saos y entre el flúor y el fósforo en las vesículas producidas por las células hFOB. En conclusión, nuestros hallazgos indican que las vesículas son determinantes clave de la nucleación mineral, especialmente a nivel celular. La comparación de las vesículas liberadas por las células Saos-2, que se mineralizan de manera más eficiente, y las vesículas liberadas por las células hFOB 1.19 apoya la hipótesis de que las vesículas de la matriz son vesículas llenas de minerales.Esto deja abierta la cuestión de si la presencia de vesículas de la matriz es necesaria para inducir la nucleación de apatita y cómo esto puede alterar la mineralización fisiológica a patológica.

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Investigación

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Chemistry

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