Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

El objetivo general de este protocolo es aislar neuronas, macrófagos y microglía de cerebros de larvas de pez cebra y extraer ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica. Las larvas transgénicas de pez cebra son una poderosa herramienta para obtener imágenes en vivo y nos brindan la oportunidad de observar células individuales como la microglía en su entorno vivo a lo largo del tiempo. Sin embargo, para obtener una comprensión detallada de sus funciones, necesitamos comprender su perfil de expresión génica, y nuestro protocolo de aislamiento y clasificación está diseñado para este propósito.

La principal ventaja de esta técnica es que puede aislar diferentes tipos de células del sistema nervioso central con una modificación mínima en su perfil de expresión génica, de modo que se pueden caracterizar las funciones y propiedades de las células. La eficiencia de este protocolo se refleja en su eficacia. Con este protocolo, se pueden producir cantidades suficientes de ARN en cortos períodos de tiempo para diversas aplicaciones posteriores.

Después de criar embriones de pez cebra en un medio E3 que contenga PTU de acuerdo con el protocolo de texto, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para examinar las larvas a dos dpf para macrófagos GFP positivos y microglía en neuronas DsRED positivas. Para homogeneizar los embriones en un punto, cinco ml de Tricaína de 15 milimolares por 50 ml de medio a 50 larvas para preparar la anestesia. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de tres ml para transferir 10 larvas a la vez a una placa de Petri de 55 ml llena de medio E3 helado con tricaína para anestesiarlas terminalmente.

Bajo un estereomicroscopio, alinee 10 larvas en el centro de la placa de Petri, luego, con microtijeras quirúrgicas, seccione las cabezas de las larvas por encima del saco vitelino. Con una pipeta Pasteur de tres ml, tome todas las cabezas y, con la menor cantidad de líquido posible, transfiera a un homogeneizador de vidrio con hielo que contenga un ml de líquido Medio A.Reemplace cada placa de Petri pequeña que contenga E3 más Tricaína helada por una nueva cada 30 minutos para asegurarse de que la transección se realice en medio frío E3 más Tricaína. Reemplace el medio A helado en el homogeneizador de vidrio cuando el color comience a desvanecerse.

Una vez que se haya recogido todo el grupo de cabezas, retire todos los medios A del homogeneizador de vidrio y reemplácelos con un ml de medios A frescos y helados. Con el homogeneizador aún en hielo, use un mortero ajustado para romper el tejido cerebral realizando 40 rondas de trituración y vueltas para larvas de tres a cinco dpf y 50 rondas para larvas de siete y ocho dpf. A continuación, añada dos ml de Media A a la suspensión celular para diluir las células y reducir su aglomeración con mielina. Elimine la aglomeración celular haciendo pasar la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micras en un tubo de halcón frío de 50 ml sobre hielo.

Repita este paso tres veces. Transfiera un ml de alícuotas de suspensión celular a tubos fríos de un punto cinco ml y gírelos a 300 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Luego, usando una jeringa de 10 ml con una aguja de una pulgada de calibre 23, retire el sobrenadante.

Con un ml de medio de gradiente de densidad del 22 por ciento helado suavemente superpuesto por cero punto cinco ml de 1X dbps helados, vuelva a suspender suavemente el pellet de celda. Haga girar los tubos a 950 veces g sin interrupción en una aceleración lenta a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después del centrifugado, deseche el medio de gradiente de densidad dbps en mielina atrapado en su interfase.

A continuación, utilice cero coma cinco ml de Media A con un dos por ciento de NGS para lavar las células, y haga girar los tubos a 300 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante, luego junte los gránulos de células de la misma condición experimental en un ml de Media A con un dos por ciento de NGS. Si las células de interés expresan una proteína fluorescente, pase la suspensión celular a través de un tapón de filtro de células de 35 micras y transfiéralas a tubos fríos de FACS de 5 ml sobre hielo, protegidos de la luz.

Para inmunotindar la microglía, use cero coma tres ml de medio A más un dos por ciento de NGS para volver a suspender la pastilla celular, luego divida las células en tres tubos de un punto cinco ml, uno para células no teñidas para medir la autofluorescencia, otro para medir la unión inespecífica de un anticuerpo secundario a la microglía y un tercero como prueba. A todos los tubos, agregue un uno por ciento de endotoxinas bajas en endotoxinas libres de azidas o una hoja para bloquear las interacciones de CD16, CD32 con el dominio FC de las inmunoglobulinas. A continuación, incubar las células durante 10 minutos con una suave agitación cada cinco minutos.

A continuación, al tercer tubo se añade el anticuerpo 4C4 y se incuba durante 30 minutos con una suave agitación cada 10 minutos. A continuación, gire los tubos a 300 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, lave el pellet una vez con cero coma cinco ml de Media A más un dos por ciento de NGS antes de volver a girar los tubos.

Vuelva a suspender el pellet de celdas con cero coma cinco ml de Media A más un dos por ciento de NGS, luego agregue un uno por ciento de hoja e incube las celdas durante 10 minutos con una agitación suave cada cinco minutos. A los tubos dos y tres, agregue anticuerpos secundarios y coloque los tubos en la oscuridad. Después de girar los tubos y desechar el sobrenadante, use cero coma cinco ml de Medio A más dos por ciento de NGS para lavar las muestras dos veces, luego vuelva a suspender los gránulos de células con un ml de Medio A más dos por ciento de NGS.

Pase la suspensión celular a través de una tapa de filtro celular de 35 micras y transfiérala a tubos FACS fríos de cinco ml sobre hielo protegido de la luz. Por último, realice la clasificación FACS y la extracción de ARN según el protocolo de texto. En este estudio, se aislaron neuronas y macrófagos, además de microglía, de ocho larvas dpf mpeg1 EGFP positivas para NBT dsRED.

Se utilizó FACS para separar las celdas de los escombros en función de su tamaño y granularidad. A continuación, se separaron las células individuales de los dobletes o aglomerados celulares. A partir de la población de células individuales, se dibujó una puerta para eliminar las células muertas.

El diagrama de puntos correspondiente reveló que este protocolo experimental preserva la integridad de la membrana plasmática celular, ya que la tasa de células muertas es solo del 26,7 por ciento. Como se muestra aquí, las neuronas y los macrófagos, además de la microglía, se segregaron fácilmente de las puertas de la población de células vivas. Dentro del cerebro, la población de neuronas parecía ser más prominente que la población de macrófagos y microglía.

En un segundo estudio, se utilizó la clasificación FACS para aislar microglía viva de cerebros de larvas con 4C4, un anticuerpo que marca específicamente la microglía. Como se resume en esta tabla de datos de aislamiento de microglía y extracción de ARN, el número de microglía dentro de los cerebros de las larvas de pez cebra varía y es muy bajo, a tres dpf. Finalmente, los resultados de la extracción de ARN obtenidos con un experimento de microglía de cinco larvas de cerebro de pez cebra dpf se muestran en esta traza de electroforesis con una visualización clara del ARN ribosómico.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 12 horas, dependiendo de cuántas cabezas se necesiten por condición. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todo frío y las superficies limpias para evitar la degradación del ARN. Tras su desarrollo, esta técnica abre el camino para que los investigadores en el campo de las neurociencias que utilizan el pez cebra como modelo exploren los perfiles de expresión génica de diferentes células en condiciones fisiológicas y patológicas.

Después de ver el video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar neuronas, macrófagos y microglía de cerebros de larvas de pez cebra, y cómo extraer ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.