Name: Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende a establecer cultivos de monocapa gástrica primaria derivada de ratón y humanos para estudios de regeneración epitelial. Este método permite analizar la migración celular y la curación de heridas in vitro.

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Este trabajo fue financiado por el NIH (NIDDK) 5 DK083402-07 R01 grant (YZ).

Para evitar la contaminación, realizar el protocolo en su totalidad dentro de una campana de cultivo estériles para tejidos. Tejido humano fundic recogió de pacientes sometidos a gastrectomía en manga según el protocolo aprobado del CRI de la Universidad de Cincinnati (número de protocolo de la IRB: 2015-4869). Todos los estudios del ratón fueron aprobados por el cuidado Animal institucional de la Universidad de Cincinnati y el Comité uso (IACUC) que mantiene un centro de Asociación Americana de evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care (AAALAC).
1. establecer derivados de humanos 3D gástrica fúndica organitas
Nota: Este protocolo se basa en investigaciones publicadas previamente en este laboratorio8.
<ol><li>Preparar medios de organoide 3D que consiste en medios de comunicación R-spondin acondicionado acondicionado Wnt y 20% de 50%.<ol>
<li>Preparar medios de Wnt acondicionado, cultura L células en un medio de Wnt (Dulbecco de modificado Eagle Medium (DMEM), 10% suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina) durante 7 días, el medio de la cosecha y filtrar con un filtro de 0,22 μm.</li>
		<li>Preparar medios de R-spondin acondicionado. Crecer una línea modificada de HEK-293T R-spondin secretoras células en un medio de R-spondin (Dulbecco de modificado Eagle Medium (DMEM), 10% suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina). En archivo adjunto después de 2 h, cambiar el medio de estas células a crecimiento OPTIMEM mediano, 1% penicilina/estreptomicina. Las células de cultivo durante 7 días. Luego cosechar los medios R-spondin acondicionado y filtrar con un filtro de 0,22 μm. Nota: Este protocolo ha sido publicado previamente y un protocolo más detallado consulte a 6,7,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descongelar la matriz de la membrana basal reducida, sin rojo de fenol de factor de crecimiento para 16 h sobre el hielo a 4 º C. Recoger el tejido en el hielo frío Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD en un recipiente grande de plástico. Almacenar en el hielo hasta el paso del principio 1.4. Nota: El tejido se obtiene de pacientes sometidos a gastrectomía en manga.</li>
	<li>Con unas pinzas, lave el tejido con fuerza en un recipiente estéril que contiene 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre fosfato tampón salino (DPBS) de Dulbecco. Lavado por aproximadamente 30 s o hasta que los escombros y la sangre se ha eliminado. A continuación, usando gasas estériles, limpie la capa mucosa del epitelio.</li>
	<li>Firmemente con unas pinzas grandes, sujete la capa del músculo del tejido y con fuerza, raspe el epitelio mediante las pinzas hemostáticas curvas grandes. Recoger los fragmentos epiteliales de raspado en una placa Petri estéril, poliestireno.</li>
	<li>Pique el tejido epitelial en unos fragmentos de2 tamaño de 2.0 x 2.0 mm con Maquinillas de afeitar para optimizar la digestión de tejido. Lavar los fragmentos de tejido con Ca2 +/Mg2 + -gratis SPD suplementado con antibióticos (Ca2 +/Mg2 + -libre DPBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL de gentamicina, kanamicina de 50 mg/mL), hasta que el lavado está libre de la sangre. Realizar varios lavados si es necesario. Descarte de lavado cuidadosamente filtra el lavado a través de una gasa estéril en un vaso de residuos.</li>
	<li>Lavado recoge fragmentos en un vaso de 125 mL redondo matraz de fondo con una barra de agitación de 25 mm y media de incubación precalentado (basals medios suplementados con 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina 10 mM HEPES Buffer, 1 mg/mL de colagenasa tipo 1, cultivo de células de 2 mg/mL grado de albúmina de suero bovino). El matraz de fondo redondo con tabiques de goma del sello.</li>
	<li>Inserte una aguja espinal 20 G en los septos y conectar a un tanque de oxígeno con manguera de goma. Para filtrar los contaminantes, inserte papel en el tubo para crear un filtro. Activar la salida de oxígeno baja. Insertar las agujas de salida de 10-15 en los tabiques para evitar la ruptura de tabiques.</li>
	<li>Asegure el conjunto hasta a un soporte de anillo con pinzas y colocarlo en un baño María calibrado a 37 ° C con una placa de agitación durante 30-45 minutos. Después de que el tejido ha sido incubando durante 15 min, retirar 50 μl de los medios de incubación y Revise visualmente las glándulas disociadas. Si las glándulas no son densas, o no se han separado del tejido, dejar para un 5-10 minutos adicionales.</li>
	<li>Inmediatamente después de la incubación, añadir 50 mL precalentado DMEM/F12 al medio de incubación con una pipeta serológica estéril o vertiendo directamente en la mezcla de incubación.</li>
	<li>Filtrar la mezcla de la glándula a través de una gasa estéril en cuatro tubos cónicos de 50 mL. Guardar el filtrado en el hielo durante 15 min permitir glándulas extraídas para instalarse en la parte inferior del tubo cónico. Tenga cuidado de no perturbar las glándulas colocadas, retire y deseche la tapa 40 mL del sobrenadante con una pipeta serológica. Resuspender lo restantes 10 mL en 10 mL de DPBS suplementado con antibióticos.</li>
	<li>Distribuya la mezcla en tubos de ensayo 5 mL de la célula cultura. Centrifugar durante 5 min a 65 x g a 4 ° C y eliminar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta. Resuspender el precipitado de la glándula en matriz de descongelada la membrana del sótano con una pipeta o una punta ancha de la pipeta de 200 μl. Mezclar hasta homogénea. Nota: Es fundamental para realizar este paso en el hielo y para evitar la polimerización de la matriz de la membrana basal durante la mezcla. Además, es importante inspeccionar visualmente la densidad de la glándula por el muestreo de 50 μl. La densidad óptima es confluencia de ~ 70%.</li>
	<li>A continuación, la placa de las glándulas en 50 μl de la matriz de la membrana del sótano con una pipeta con punta ancha. Evitar la producción de burbujas mientras chapado.</li>
	<li>Para permitir que la matriz de la membrana del sótano polimerizar, incube durante 10-15 min a 37 ° C. Si chapado en una placa de cultivo de 12 bien, añadir 1 mL de hFGO media (medio de medio/F12 de avanzada Dulbecco modificado Eagle suplementado con 2mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL gentamicina, 50 mg/mL de kanamicina, 10 mM HEPES Buffer, n-Acteylcystine de 1 mM, 1 x 1 x B27, medio de Wnt-condicionada del 50%, 20% R-spondin-acondicionado suplementado con 100 ng/mL de N2, hueso inhibidor de la proteína morfogenética 1 gastrin nM, 50 ng/mL de Factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico de 200 ng/mL 10 10 mM nicotinamida e inhibidor de Y-27632 ROCK de 10 μm) por pozo. Si no usando una placa de cultivo de 12 pozos Añada suficiente medios para sumergir la burbuja de la matriz de la membrana del sótano.</li>
	<li>Cultura de las células a 37 ° C en un incubador de cultura 5% CO2 célula humidificado. Cambiar los medios de comunicación cada 4-5 días.</li>
</ol>2. establecer derivadas de ratón 3D gástrica fúndica organitas
Nota: Este protocolo ha sido previamente publicado 6. Matriz de la membrana del sótano en el hielo de descongelar y preparar todos los reactivos antes de comenzar.
<ol><li>Sacrificio de ratones utilizando un método aprobado por la institución de investigación donde se realiza la investigación. Quite el estómago de ratón y disecar según los protocolos previamente publicados 6. Lavado en 20 mL hielo frío Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD. Nota: Ratones C57BL/6, de 8 a 10 semanas, se utilizan para las culturas organoide gástrica fúndica. Ratones fueron sacrificados por la inhalación de dióxido de carbono seguido de la dislocación cervical manual antes del retiro de estómago.</li>
	<li>Tira de la capa muscular del estómago y cualquier visibles los vasos sanguíneos anteriormente publicado 6.</li>
	<li>Separar el fondo del antro y forestomach utilizando una hoja de afeitar estéril. Fondo cortado con tijeras quirúrgicas pequeñas en fragmentos de aproximadamente 2.0 x 2.0 mm. Usando pinzas, recoger los fragmentos en un tubo cónico de 15 mL con tampón de incubación del EDTA (Ca2 +/Mg2 +-libre DPBS, 5 mM EDTA) e incube a 4 ° C por 2 h con agitación suave.</li>
	<li>En una campana estéril, dejar el tubo cónico y fragmentos de hielo durante aproximadamente 5 minutos utilizan una pipeta para quitar tanta tampón de incubación posible tocar fragmentos. Añadir 5 mL agitación buffer (1 g D-Sorbitol, sacarosa 1,47 g en 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre DPBS) y agitar con la mano con una fuerza de 2 minutos deje que los fragmentos grandes y con prisa, con una pipeta de 1000 p, quitar los pequeños fragmentos que aún tienen que resolver en la capa superior.</li>
	<li>Giran los fragmentos eliminados por 5 min a 4 ° C a 65 x g.</li>
	<li>Evitando las burbujas de aire, eliminar el sobrenadante, resuspender en la matriz de la membrana del sótano y mezclar hasta que quede homogéneo.</li>
	<li>Utilice una pipeta de Punta ancha para la matriz de la membrana del sótano en 50 μL por pocillo de la placa y luego incubar a 37 ° C durante 20 minutos.</li>
	<li>Añadir suficiente medios de crecimiento mFGO (Advanced Dulbecco modificado Eagle medio/F12 suplementado con 2mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 10 mM HEPES Buffer, n-Acteylcystine de 1mM, 1 x N2, 1 x B27, medio Wnt-condicionada del 50%, 20% R-spondin-condicionada suplementado con inhibidor de la proteína morfogenética de la hueso de 100 ng/mL, gastrina nM 10, 50ng/mL Factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblasto 10 de 10 ng/mL e inhibidor de Y-27632 ROCK de 10 μm) para sumergir la burbuja.</li>
	<li>Las células a 37 ° C, 5% CO2 célula humidificado cultura la incubadora de la cultura. Cambiar el medio cada 4-5 días.</li>
</ol>3. colágeno capa de transferencia 2D
Nota: Realice todos los procedimientos en una campana de cultivo estériles para tejidos a menos que se especifique lo contrario. Comenzar el colágeno capa 24 h antes de transferir organitas 3D para la monocapa. Mantener el colágeno de la cola de rata en el hielo y protegidos de la luz. Placas de colágeno recubierta son buenas para hasta 2 semanas. Si no se usa inmediatamente las placas cubiertas, envolver la placa en parafilm y almacenar a 4 ° C hasta que se necesite.
<ol><li>Diluir el colágeno de la cola de rata a 50 μg/mL con 20 mM acético ácido.</li>
	<li>Suficiente cubrir la superficie del pozo con colágeno diluido. Para un pozo de una placa estándar de 12 bien, cubrir con aproximadamente 1 mL de colágeno. Dejar durante la noche a temperatura ambiente en una capucha estéril.</li>
	<li>Lave dos veces con 1 mL Ca2 +/Mg2 +-libre DPBS por pozo y deja al descubierto por 2 h a temperatura ambiente en una capucha estéril.</li>
</ol>4. membrana basal capa de matriz para la transferencia de 2D
Nota: Realice todos los procedimientos en una campana de cultivo estériles para tejidos a menos que se especifique lo contrario. Comenzar a matriz de la membrana basal capa 2 h antes de transferir organitas 3D para la monocapa. Mantener la matriz de la membrana del sótano en el hielo. Placas cubiertas deben utilizarse inmediatamente y no se puede almacenar por un período prolongado de tiempo.
<ol><li>Diluir la matriz de la membrana del sótano en un tubo cónico de 15 mL con agua grado cultivo celular en un 1:10 cociente. Diluir en el hielo.</li>
	<li>Con una pipeta agregar 100 μl de la matriz de la membrana del sótano diluido en cada pocillo de una placa de 12 pozos estándar. Con un raspador celular, distribuir bien la matriz diluido la membrana basal en el pozo de una capa uniforme.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C durante 1 h.</li>
	<li>Eliminar el agua residual con una pipeta y secar a temperatura ambiente durante 1 h antes de transferir 3D organitas.</li>
</ol>5. transferencia de m/hFGOs 3D a 2D monocapas de células epiteliales gástricas
<ol><li>Después de 3D ratón o humano-derivados de FGOs han sido cultivados durante 6-7 días, comienza la transferencia de organoides 3D a la 2D monocapa. Nota: Para cada pocillo de una monocapa requerida se recomienda utilizar 300 organitas intactos o células derivadas de 300 organitas. En una cultura sólida se espera obtener aproximadamente 150 organoide/bien dentro de una placa de cultivo bien 12.</li>
	<li>Asegúrese de que las placas están recubiertas antes de transferir. Nota: Las placas de matriz recubierta de membrana del sótano tienen una capa de gel transparente, sin embargo, las placas de colágeno recubierta no tendrá ninguna indicación evidente de la capa.</li>
	<li>Desplazar la burbuja de matriz 3D la membrana del sótano de la placa mediante Pipeteo directamente 1 mL estéril Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD en el centro de la burbuja.</li>
	<li>Usando una pipeta, recoger la mezcla de matriz y organoides de la membrana del sótano en tubos de ensayo de la cultura de célula. Recoger en una proporción de 2 burbujas de matriz de la membrana del sótano por el tubo. Centrifugar durante 5 min a 40 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Utilizando un sistema de vacío, eliminar el sobrenadante y como mucho matriz de la membrana del sótano como sea posible. Resuspender en 4 mL de Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD, eliminar el sobrenadante y repetir 2 - 3 veces. Para el protocolo de transferencia de todo organoide, proceda al paso 5.10. Continúe con el paso de 5.7 para el protocolo de suspensión unicelular.</li>
	<li>Precalentar la solución de la separación de células a 37 ° C y añadir 1 mL a cada tubo de ensayo. Mezcle suavemente invirtiendo los tubos o arriba y abajo el pipeteo con una pipeta. Incubar 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 2 mL de Ca2 +/Mg2 +-gratis SPD directamente a cada tubo de ensayo.</li>
	<li>Utilice una aguja de 26 G y jeringa de la mezcla de 2 - 3 veces. Verificar visualmente las células. La jeringuilla de 1-2 veces más si todavía hay organoides o racimos de células.</li>
	<li>Centrifugar a 40 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en medios FGO 2D (medio ratón 2D FGO: medio de medio/F12 de avanzada Dulbecco modificado Eagle suplementado con 2mM L-glutamina, 10 mM penicilina/estreptomicina, 10% Suero Fetal del becerro, 10 mM HEPES Buffer, 1 x N2, 1 x B27, complementado con gastrina nM 10, 50 ng/mL de Factor de crecimiento epidérmico, inhibidor de TGF-β de 1 μm y 10 inhibidor de roca de Y-27632 μm. Medio de crecimiento de FGO humano 2D: Medio de medio/F12 avanzada de Dulbecco modificado Eagle suplementado con 2mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 10 mM HEPES Buffer, 10% Suero Fetal del becerro, 10 mM nicotinamida, 1 x N2, 1 x B27, suplementado con 50 mg/mL de kanamicina, 50 ng/mL crecimiento epidérmico Factor y el inhibidor de Y-27632 ROCK de 10 μm 1 μm TGF-β inhibidor).</li>
	<li>Placa de la resuspensión en placas cubiertas. Incube las placas a 37 ° C. Sustituir los medios de comunicación cada 4 días o antes si los medios de comunicación se vuelve amarillo. Monocapa requiere aproximadamente 4 días a la forma.</li>
</ol>6. Análisis de la herida con monocapas de células epiteliales gástricas 2D del rasguño
<ol><li>Usando una cuchilla de afeitar, raspar la monocapa cuando el cultivo haya alcanzado 100% de confluencia.</li>
	<li>Fijar capas monomoleculares con 3,7% de formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Permeabilizar con 0.5% de detergente no iónico/PBS por 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Siguiente bloque de monocapas con suero de burro 2% durante 1 h a temperatura ambiente e incubar con dilución 1: 1000 de H+, K+-anticuerpo primario ATPasa durante la noche a 4 º C, lavar con 0,1% detergente no-iónico/PBS e incubar con dilución 1: 100 de burro anticuerpo secundario de anti-ratón 488 y 10μg/mL de núcleos de célula del Hoechst manchan por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para identificar las células de la superficie mucosa hoyo en cultivos monocapa gástrico derivados humanos 2D, se tiñen las células con 20 μg/ml de conjugado FITC de Ulex europaeus (UEAI). Monocapas de imagen en un microscopio confocal.</li>
	<li>Tomar imágenes de la herida cada pocas h. cero será volver a epithelialize entre 24-48 h dependiendo de la calidad de la monocapa y la variación entre pacientes.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El actual protocolo de detalles de la creación de derivados de humanos y de ratón gástricas epiteliales monocapas que se puede utilizar para los ensayos de cero-herida. El protocolo depende el concepto de células madre residentes tejidos de aislamiento de humanos primarios (o ratón) y es un protocolo modificado publicado por primera vez por Schlaermann et al7. En particular, hemos optimizado el protocolo aquí para establecer un confluente y polarizado monocapa epitelial gástrica que expre...

El uso de scratch-herida ensayos es un método popular para el estudio de regeneración y reparación1,2,3,4,5,6. La metodología propuesta puede ser utilizada para estudiar específicamente gástrica regeneración y colonización de Helicobacter pylori . En el pasado, líneas celulares de cáncer gástrico se han utilizado como un medio para el estudio de la infección de Helicobacter pylori (H. pylori)1,2 y hasta cáncer gástrico recientemente líneas celulares como las células AGS eran favorecidos1 ,2,3,4. Una limitación de las culturas de célula de cáncer gástrico es su fracaso para recapitular la diversidad celular del epitelio gástrico. Para intentar abordar esta limitación, demostrado que aquí es la creación y transferencia de primario derivado del humano y del ratón 3-dimensional fúndica gástrica organoides (FGOs) a una monocapa epitelial gástrica para los ensayos de curación herida basado en un método modificado de primero descrito por Schlaermann et al. 7 demostrar que monocapas epiteliales gástricas derivadas de esquilan 3D FGOs gástricos o FGO-derivó las células mantienen una composición celular polarizada que representa cerca del epitelio gástrico en vivo. Dado que las líneas celulares de cáncer gástrico no demostró la composición de la célula que muestra esta técnica, el protocolo actual tiene la ventaja sobre métodos alternativos de scratch-herida. Esta metodología ha sido optimizada por el monocapas pueden ser establecido de organoides todo o de una suspensión unicelular de organoides disociado y plateado usando una matriz de la membrana basal o capa de colágeno. El objetivo general del presente Protocolo es establecer que un organoide derivados cultivos monocapa epitelial gástrico para un ensayo de novela herida curativa.

<table><tbody><tr><td>Medio Eagle modificado/F12 avanzado de Dulbecco (medio basal)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutamina)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B/Gentamicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcistina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de BMP (Noggin)</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibidor de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; Inhibidor</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+ -free DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22&micro; Filtro M</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Baño</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>agua colagenasa tipo 1</td><td>Worthington &nbsp;</td><td></td><td></td>LS004214</tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (papel de seda)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr>Matraz <td></td><td></td><td></td>de<td>fondo redondo de 125 ml</td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td><td></td>agitadora de 1 pulgada (25 mm)</tr><tr><td>Septa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>gomaPlaca</td><td></td><td></td><td></td>de agitación</tr><tr><td>Soporte de anillo Abrazaderas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de soporte de</td><td></td><td></td><td></td>anillo</tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td><td></td>de Petri estéril</tr><tr><td>Agujas de 18 G de 1,5 g de longitud</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 g de 3,5 pulgadas de longitud</td><td>Thermo Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>placa tratada con cultivo celular de 12 pocillos</td><td>Midwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento reducido, sin fenol Rojo MatrigelTM (Matriz de membrana basal)</td><td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar estériles Pinzas</td> de punta ancha Pinzas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>hemostáticas curvas</td></tr><tr><td>200 &micro; Puntas de pipeta anchas L</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubos de ensayo para cultivos celulares</td><td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de oxígeno con manguera</td><td></td><td></td><td></td>de goma</tr><tr><td>1 g de D-sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>disección Bandeja de</td> <td>disección</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mecedora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cola de Rata Colágeno Tipo 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial de grado de cultivo celular</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de cámara de 2 pocillos</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>de 12 pocillos Transwell (insertos de membrana de poliéster)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (solución de desprendimiento de células)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>263/8 Jeringa G</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de</td><td></td><td></td><td></td>afeitar</tr><tr><td>L Cells</td><td>Las células L, una línea celular productora de Wnt3a, fueron recibidas como regalo por el Dr. Hans Clevers (Instituto Hubrecht de Biología del Desarrollo e Investigación de Células Madre, Países Bajos). &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T Células secretoras de rspondina</td><td>Se obtuvo una línea celular secretora de R-espondina HEK-293T modificada del Dr. Jeff Whitsett (Sección de Neonatología, Biología Perinatal y Pulmonar, Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati y Facultad de Medicina de la Universidad de Cincinnati, Cincinnati, EE. UU.). &nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPasa Anticuerpo primario</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 anticuerpo secundario (Donkey anti-mouse 488 anticuerpo secundario)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Estudios in vitro de reparación de herida gástrica implica típicamente el uso de líneas celulares de cáncer gástrico en un ensayo de scratch-herida de proliferación celular y migración. Una limitación crítica de tales ensayos, sin embargo, es su surtido homogéneo de tipos celulares. La reparación es un proceso complejo que exige la interacción de varios tipos celulares. Por lo tanto estudiar una cultura desprovista de subtipos celulares, es una preocupación que debe superarse si queremos entender el proceso de reparación. El modelo de organoide gástrico puede aliviar este problema por el que la colección heterogénea de tipos de la célula refleja cerca del epitelio gástrico u otros tejidos nativos en vivo. Demostrado aquí es una novela en vitro arañazo herida ensayo derivado de humanos o ratón organitas 3-dimensional que luego pueden ser transferidos a una monocapa epitelial gástrica sea organitas intacta o como una suspensión unicelular de disociaron organoides. El objetivo del protocolo es establecer organoides derivados gástricas epiteliales monocapas que pueden utilizarse en un sistema de análisis de nuevo heridas de rasguño para el estudio de regeneración gástrica.

Organoides se derivaron del corpus/cuerpo del ser humano o del fondo de los tejidos del estómago del ratón (figura 1A). Después de colagenasa o digestión de EDTA de tejido del estómago derivados humanos o ratón respectivamente, las glándulas son embebidas en matriz de la membrana del sótano y cultivadas durante 6-7 días (figura 1A). Figura 1B se muestra la formación de derivados humanos gástrico orga...

Aquí se describe un protocolo para el establecimiento y cultivo derivado de humano y ratón 3 dimensiones (3D) gástrico organoides y el método para la transferencia de organoides 3D a una monocapa de 2 dimensiones. También se describe el uso de la monocapa epitelial gástrica como un análisis nuevo de cero-herida para estudios de regeneración.

Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

El objetivo general de este sistema de cultivo es generar una monocapa gástrica primaria de ratón o humana para el estudio de la regeneración en un ensayo de cicatrización de heridas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo gástrico, como el mecanismo de regeneración de las células epiteliales gástricas en respuesta a una lesión. La principal ventaja de esta técnica es, en primer lugar, el estudio de la migración y regeneración celular en un ensayo de cicatrización de heridas, generado a partir de células gástricas primarias de ratón o derivadas de humanos, y la segunda generación de organoides gástricos derivados de humanos para experimentos a gran escala.Aunque este método puede proporcionar información sobre la regeneración del epitelio gástrico, también se puede aplicar a otros sistemas, como la infección por helicobacter pylori y los cocultivos de células inmunitarias epiteliales. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Emma Teal, una estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar, recoja el pañuelo preparado en un recipiente de plástico grande lleno de DPBS sin calcio y magnesio.Deje el recipiente de plástico en hielo hasta su uso. A continuación, con la ayuda de unas pinzas, lavar enérgicamente el tejido en un vaso de precipitados estéril que contenga 100 mililitros de DPBS libre de calcio y magnesio durante unos 30 segundos. Luego, use una gasa estéril para limpiar la capa de moco del epitelio.A continuación, use pinzas grandes para sujetar firmemente la capa muscular del tejido, luego use pinzas hemostáticas curvas grandes y raspe el epitelio con fuerza. Guarde el epitelio raspado en una placa de Petri de poliestireno estéril. Para optimizar la digestión del tejido, pica el tejido epitelial en fragmentos.A continuación, lavar el tejido con DPBS libre de calcio y magnesio complementado con antibióticos. Lávese varias veces para eliminar la sangre. Deseche el lavado en un vaso de precipitados.A continuación, recoja los fragmentos epiteliales lavados en un matraz de vidrio de fondo redondo de 125 mililitros con una barra agitadora de 25 milímetros y un medio de incubación precalentado. Después de recolectar los fragmentos de tejido, selle el matraz de fondo redondo con un tabique. Y luego use abrazaderas para asegurar la configuración a un soporte de anillo.A continuación, inserte una aguja espinal de calibre 20 en los tabiques. Conecte los tabiques a un tanque de oxígeno con manguera de goma. Inserte de 10 a 15 agujas de salida en los tabiques para evitar su ruptura, el interruptor en el flujo de salida de oxígeno en bajo.Después de esto, calibre el baño de agua a 37 grados centígrados en una placa de agitación durante 30 a 45 minutos. Una vez calibrado, coloque la configuración en el baño de agua. Después de 15 minutos de incubación, verifique si hay glándulas disociadas.Después del tiempo de incubación deseado, agregue 15 mililitros de DMEMF12 precalentado al medio de incubación usando una pipeta serológica. A continuación, filtre la mezcla de glándulas obtenida a través de una gasa estéril en cuatro tubos cónicos de 15 mililitros. A continuación, incubar el filtrado en hielo durante 15 minutos.Esto permitirá que la glándula se asiente en el fondo del tubo cónico. Use una pipeta serológica para desechar 40 mililitros del sobrenadante de la parte superior de la suspensión de la glándula. Vuelva a suspender los 10 mililitros restantes de la mezcla glad en 10 mililitros de DPBS suplementado con antibióticos.A continuación, distribuya toda la mezcla en tubos de ensayo de cultivo celular de cinco mililitros. Centrifugar los tubos a 65 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante.Disuelva el pellet glandular obtenido con una matriz de membrana basal pensada utilizando una punta de pipeta ancha de 200 microlitros. Mezclar la suspensión hasta que quede homogénea. A continuación, coloque las glándulas en 15 microlitros de la matriz de la membrana basal con la ayuda de una pipeta de punta ancha.Para que la matriz de la membrana basal polimerice, incube a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. A continuación, añada un mililitro de medio hFGO en cada pocillo si se cultiva en una placa de cultivo de 12 pocillos. A continuación, cultive las células a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificada.Cambie el medio cada 45 días. Después de seis a siete días de cultivo FGO derivado de ratones 3D o humanos, comience a transferir los organoides 3D a la monocapa 2D. Para ello, añade un mililitro de DPBS libre de calcio y magnesio en el centro de la burbuja para desalojar la burbuja de la membrana basal 3D de la placa.A continuación, recoja la matriz de la membrana basal y la mezcla de organoides en el tubo de cultivo celular. A continuación, centrifugar a 40 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, use un sistema de vacío para eliminar el sobrenadante y la mayor cantidad posible de matriz de membrana basal.A continuación, disuelva el pellet en cuatro mililitros de DPBS libre de calcio y magnesio. Asegúrese de eliminar la mayor cantidad posible de la matriz del basamento después de cosechar los organoides en preparación para la monocapa. A continuación, añada un mililitro de solución de desprendimiento de células precalentada a 37 grados centígrados en cada tubo de ensayo.A continuación, mezcle el contenido del tubo invirtiéndolo varias veces. Finalmente, incuba el tubo a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Para obtener una suspensión unicelular, agregue los dos mililitros de DPBS libre de calcio y magnesio directamente a cada uno de los tubos de ensayo.Luego use una aguja de calibre 26 para mezclar la suspensión dos o tres veces. Después de mezclar, centrifugue la suspensión celular, luego disuelva el pellet de celda en medio FGO 2D. Para obtener el organoide completo, coloque la suspensión celular en placas recubiertas.A continuación, incubar las placas a 37 grados centígrados durante unos cuatro días. Cambie el medio si el color se vuelve amarillo. Tan pronto como el cultivo alcance el 100 por ciento de confluencia, rasque la monocapa con una cuchilla de afeitar.A continuación, fije las monocapas con paraformaldehído al 3,7 por ciento a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, permeable las monocapas con Triton X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la permeabilidad, bloquee las monocapas con suero de burro al dos por ciento durante una hora.Después de una hora de bloqueo, incube la monocapa con solución de anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados durante la noche. Envuelva la monocapa en parafilm para evitar la evaporación y el secado del cultivo durante la noche. Al día siguiente, lávese con 0.1 por ciento de detergente no iónico en PBS.A continuación, incubar con anticuerpo secundario y tintura de 10 microgramos por mililitro de núcleos de células huésped durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, tiñe las células. A continuación, identifique las células de la fosa mucosa superficial en el cultivo 2D de monocapa gástrica de origen humano bajo el microscopio confocal.Por último, captura imágenes de la herida cada pocas horas. Estas imágenes del análisis de lapso de tiempo muestran la formación de FGOs humanos. Estos organoides se transfieren a una monocapa epitelial gástrica en portaobjetos de cámara codificada en matriz de membrana basal.La monocapa epitelial gástrica se analiza cada ocho horas durante un día. La imagen muestra que el área de la herida sigue disminuyendo y desaparece por completo en el cultivo en un solo día. Esta tinción inmunofluorescente muestra la presencia de una monocapa E-cadherina positiva que consiste en las células mucosas superficiales.Esto indica la regeneración de la monocapa epitelial gástrica. Los núcleos presentes están teñidos con hoechst. A continuación, se realiza un análisis RTPCR utilizando ARN extraído de la monocapa epitelial gástrica humana para confirmar la expresión de las células mucosas de la superficie parietal, del jefe y del cuello mucoso.La presencia de ATPa y PgC, muestra la presencia de células parietales y principales respectivamente. La presencia de MUC5AC y MUC6 muestra la presencia de células mucosas superficiales y mucosas del cuello, respectivamente. En esta imagen de inmunología florescencia, las células proliferantes en el cultivo de monocapa epitelial gástrica humana se muestran por la pronta absorción de EdU.Estas imágenes de inmunoflorescencia muestran la regeneración del epitelio gástrico y la expresión de las células mucosas y parietales superficiales a las cero, ocho, 16 y 24 horas después de la herida por rasguño. Una vez masterizado, la transferencia de 3D a 2D se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lavar la mayor parte de la matriz de la membrana basal de los organoides cosechados antes de la transferencia 2D.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la infección por helicobacter pylori en monocapas y los cocultivos de células inmunitarias monocapa, con el fin de responder a preguntas adicionales, como las interacciones entre el huésped y el patógeno. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la gastroenterología exploraran las enfermedades y la regeneración en el estómago. No olvide que trabajar con tejido humano puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la técnica estéril y las medidas de protección personal al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

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