Análisis automatizado de la diapositiva y segmentación en tejidos marcada con fluorescencia utilizando un sistema de análisis de la Widefield High-contenido
3 de mayo de 2018
Aquí describimos un protocolo para la segmentación automática de tejidos fluorescencia etiquetadas en diapositivas, utilizando un sistema de análisis de alto contenido de campo amplio (WHCAS). Este protocolo tiene amplias aplicaciones en cualquier campo que consiste en la cuantificación de marcadores fluorescentes en tejidos biológicos, como las ciencias biológicas, ingeniería médica y Ciencias de la salud.
El objetivo general de este método de imagen y análisis es generar un flujo de trabajo fácil de configurar para la segmentación automática de cualquier muestra de tejido montada en portaobjetos marcada con fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las ciencias biológicas sobre la cantidad de una proteína dada que se encuentra dentro de un área específica de una muestra de tejido de interés. Las principales ventajas de esta técnica son que se puede ahorrar tiempo en los protocolos de optimización para la segmentación automatizada, lo que permite aplicar este método a muestras posteriores de tejido montadas en portaobjetos marcadas con fluorescencia.
Tuvimos la idea de este método cuando necesitábamos cuantificar nuevas células en el tejido cerebral con un gran aumento. Después de importar los diarios, abra el cuadro de diálogo Configuración de adquisición de placas y abra la pestaña Objetivo y cámara. Establezca la ampliación en cuatro veces, la agrupación de la cámara en una y la ganancia en dos.
Abra la pestaña Escaneo de portaobjetos de placa e introduzca los ajustes experimentales adecuados. En la pestaña Sitios a visitar, llene los pozos de manera uniforme con los sitios y abra la pestaña Editar configuración del fondo de la placa para ingresar los valores experimentales apropiados. Después de guardar estos ajustes como Configuración A, abra la pestaña Objetivo y Cámara y establezca la Ampliación en 40 veces, la agrupación de la cámara en uno y la Ganancia en dos.
Confirme que todos los ajustes de las pestañas Escaneo de diapositivas de placas y Editar ajustes de fondo de placa son los mismos que se introdujeron para el ajuste A. Y abra la pestaña Bucle de adquisición. Introduzca el número de longitudes de onda presentes en la muestra y marque las opciones Habilitar enfoque basado en láser y Habilitar enfoque basado en imagen. A continuación, guarde estos ajustes como Configuración B.A continuación, coloque hasta tres portaobjetos, cubra el deslizamiento hacia abajo con la etiqueta en el lado de la muesca en el adaptador de portaobjetos.
Y presione F4 para abrir el menú principal. Seleccione Escaneo de diapositivas y haga clic en Abrir puerta de expulsión de diapositiva para insertar el adaptador de diapositiva en el sistema de análisis de alto contenido de campo amplio. A continuación, haga clic en Cerrar corredera de carga de puerta.
Para comenzar, asegúrese de seleccionar la longitud de onda adecuada. Desplácese a diferentes sitios dentro de la imagen de características en vivo hasta que se encuentre la región de interés. Enfócate en la región.
Si no está enfocado, use el botón Enfoque automático o ajuste el tamaño del paso hasta que lo esté. Utilice Ajustar para capturar la imagen, si ajusta manualmente el enfoque cambiando el tamaño del paso. Para configurar un escaneo anterior, primero cargue la Configuración A y seleccione Vista previa de diapositivas.
Indique el número de diapositivas y seleccione Aceptar. Elija cuatro veces como aumento. A continuación, seleccione Coverslip hacia abajo y continúe seleccionando la configuración base para el escaneo anterior. Asegúrese de que tanto la configuración de adquisición como las calibraciones estén marcadas antes de seleccionar Cancelar y presione Continuar.
En la pestaña W1:DAPI, haga clic en En vivo y, a continuación, en Exposición automática, seguido de Ajustar. Después de esto, presione Cerrar. Seleccione el directorio e introduzca un nombre de análisis anterior.
Aparecerá automáticamente el cuadro de diálogo Dibujar región. Utilice la herramienta de región rectangular para seleccionar toda la región de escaneo anterior y haga clic en Continuar. Al final del análisis anterior, cargue la configuración B y abra la pestaña Sitios para visitar.
Para comenzar, asegúrese de seleccionar la longitud de onda adecuada. Desplácese a diferentes sitios dentro de la imagen de características en vivo hasta que se encuentre la región de interés. Enfócate en la región.
Si no está enfocado, use el botón Enfoque automático o ajuste el tamaño del paso hasta que lo esté. Utilice Ajustar para capturar la imagen, si ajusta manualmente el enfoque cambiando el tamaño del paso. A continuación, en la pestaña W1 DAPI, haga clic en Exposición automática y confirme que la imagen DAPI de ajuste de adquisiciones de placas sea nítida.
En el menú principal, haga clic en Diario y seleccione Ejecutar diario en el menú desplegable. Haga doble clic en el Diario de configuración de adquisición de región de diapositiva para iniciar y haga clic en Continuar cuando aparezca el cuadro de diálogo Configuración de adquisición de región de diapositiva. Cuando se le indique, seleccione DAPI Scan para seleccionar la imagen de diapositiva de bajo aumento y haga clic en Aceptar. Cuando se le solicite el Snap de Adquisición de Placas, resalte el Snap de Adquisición de Placas-DAPI y haga clic en OK. Cuando aparezca el cuadro Crear o Cargar regiones, utilice la herramienta Región rectangular para seleccionar las regiones de interés en el análisis DAPI y haga clic en Continuar.
Con la herramienta de localización, resalte la región de interés y haga clic en Continuar, en el cuadro de diálogo Seleccionar región. Cuando aparezca el cuadro Confirmar regiones, haga clic en Continuar y decida si es necesario guardar la región cuando aparezca el cuadro de diálogo Guardar regiones. Aparecerán tres cuadros de diálogo.
Haga clic en Continuar para descartar el cuadro Configuración completa. Para eliminar cualquier conjetura de búsqueda de sitios de muestra, asegúrese de que la opción Mostrar imágenes durante la adquisición en la pestaña Configuración de visualización esté activada y abra la pestaña Resumen para hacer clic en Adquirir placa para colocar la etapa de la región de interés preseleccionada. Cuando la cámara se desplaza sobre un sitio que contiene las celdas de interés, haga clic en Cancelar para detener la adquisición de la imagen.
No se alarme si la imagen está desenfocada. Este paso es únicamente para posicionar la etapa del primer sitio en la región de interés seleccionada. Confirme que la etapa se encuentra sobre la muestra y que ha introducido correctamente el número de sitios.
Optimice la configuración de la longitud de onda para garantizar que se obtengan imágenes enfocadas en un rango dinámico alto. A continuación, vuelva a abrir la pestaña Resumen y haga clic en Adquirir placa. Al final del análisis, seleccione la pestaña Visualización.
En el menú desplegable Superposición de imagen, seleccione Mostrar información de pozo para mostrar los números de sitio en la esquina superior izquierda. Desplácese por los sitios y excluya los sitios que estén desenfocados y/o que contengan pliegues de tejido o burbujas y desgarros en el tejido. En esta imagen representativa, se muestran miniaturas de gran aumento de todos los sitios dentro de la región de interés definida.
Cada sitio debe ser revisado para identificar los sitios que deben ser excluidos del análisis. Por ejemplo, en este experimento, el sitio 149 estaba fuera de foco, el sitio 219 tenía burbujas y el sitio 54 contenía un pliegue. Los tres sitios fueron excluidos del análisis.
Aquí, las superposiciones correspondientes generadas por el módulo de puntuación de celdas de longitud de onda múltiple demuestran los resultados de la segmentación automatizada realizada en el sitio 59 personalizados de acuerdo con las especificaciones experimentales. Después de la segmentación, se pueden obtener los datos cuantitativos de la proporción de células que tiñen positivas para cada marcador, ambos marcadores, ningún marcador, el área media teñida y la intensidad media de fluorescencia. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar su sistema de análisis de alto contenido de campo amplio para crear un flujo de trabajo automatizado para la obtención de imágenes y la segmentación de una muestra de tejido montada en portaobjetos.
Resumen
Este artículo presenta un protocolo para la segmentación automatizada de tejidos marcados con fluorescencia mediante un sistema automatizado de análisis de alto contenido en campo amplio (WHCAS). Este método agiliza la cuantificación de marcadores fluorescentes en tejidos biológicos, beneficiando a diversas áreas, incluidas las ciencias biológicas y la ingeniería médica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ciencias Biológicas
- Ingeniería Médica
- Ciencias de la Salud
Antecedentes
- La segmentación automatizada mejora el análisis de tejidos marcados con fluorescencia.
- Los sistemas de análisis de alto contenido facilitan la obtención de imágenes detalladas de muestras biológicas.
- La cuantificación de proteínas en muestras de tejido es fundamental para comprender los procesos biológicos.
- Este método fue desarrollado para abordar los desafíos en la cuantificación de nuevas células en tejido cerebral.
Objetivo del estudio
- Crear un flujo de trabajo eficiente para la segmentación automática de muestras de tejidos.
- Mejorar la precisión y velocidad en la cuantificación de marcadores fluorescentes.
- Proporcionar un protocolo estandarizado aplicable a diversos tipos de tejidos.
Métodos Utilizados
- Configuración de un sistema de análisis de alto contenido en campo amplio para la adquisición de imágenes.
- Configuración de los parámetros experimentales para una adquisición de imágenes óptima.
- Uso de herramientas de software para la adquisición y el análisis de imágenes.
- Implementación de técnicas de enfoque automático y basadas en imágenes.
Resultados principales
- Se logró una segmentación exitosa de los tejidos marcados con fluorescencia.
- La imagen de alta magnificación proporcionó vistas detalladas de las muestras de tejido.
- Las regiones de interés fueron identificadas y analizadas con precisión.
- Se establecieron criterios de exclusión para imágenes desenfocadas o dañadas.
Conclusiones
- El protocolo de segmentación automatizada reduce significativamente el tiempo de análisis.
- Este método puede aplicarse a una amplia gama de tejidos biológicos.
- Aplicaciones futuras podrían mejorar la investigación en diversos campos científicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El escaneo y la segmentación automatizados de portaobjetos mediante un sistema de análisis de alto contenido de campo amplio (WHCAS) aborda el cuello de botella en la cuantificación de marcadores fluorescentes en grandes secciones de tejido, permitiendo un análisis reproducible y de alto rendimiento para la validación de objetivos y el desarrollo de ensayos. Al estandarizar los flujos de trabajo de adquisición de imágenes y segmentación, este método reduce la variabilidad y acelera la evaluación preclínica de biomarcadores basados en tejidos, apoyando decisiones basadas en datos de avance o no avance en las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de patrones de expresión proteica en tejidos relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Reduce el tiempo dedicado a optimizar protocolos para experimentos individuales, permitiendo una aplicación rápida a múltiples dianas marcadas con fluorescencia.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante lecturas cuantitativas consistentes de la localización y niveles de expresión de marcadores.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores mediante la generación de imágenes de tejidos estandarizadas y segmentadas, adecuadas para ensayos de alto contenido.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad de los ensayos mediante la selección automatizada de regiones y la exclusión de sitios dañados (por ejemplo, tejidos fuera de foco, plegados o con burbujas).
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en diversos marcadores y tipos de tejido mediante módulos de software predefinidos para localización proteica, proliferación, viabilidad, apoptosis y angiogénesis.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la consistencia desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar datos cuantitativos sobre las proporciones de células positivas para marcadores, el área media teñida y la intensidad de fluorescencia.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya la toma de decisiones preclínicas al entregar conjuntos de datos confiables, filtrados por exclusión, que reflejan la señal biológica real.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Demuestra aplicabilidad en el análisis de tejido de tumores cerebrales, con posibilidad de extensión a cualquier marcador nuclear o citoplasmático marcado con fluorescencia en tejidos montados sobre portaobjetos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento desde el Descubrimiento Temprano hasta la Identificación de Compuestos Promisorios y la Investigación Preclínica, permitiendo un análisis estandarizado de tejidos en cada etapa.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar la expresión de marcadores en regiones específicas de interés en tejidos.
- Tamizaje: Proporciona listo para el ensayo mediante segmentación automatizada y resultados cuantitativos que permiten una evaluación fiable de compuestos en diferentes ubicaciones.
- Análisis: Genera lecturas cuantificables, incluyendo la proporción de células positivas, el área media teñida y la intensidad media de fluorescencia, lo que permite comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar datos cuantitativos de tejidos alineados con biomarcadores, adecuados para estudios de validación.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable en diversos proyectos, aprovechando módulos de software preexistentes y configuraciones guardadas (Configuración A y B) para escaneo de portaobjetos y segmentación consistentes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en los ensayos basados en tejidos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de imagen y análisis de tejidos.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital mediante la reducción del tiempo de optimización de protocolos y menor riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos cuantitativos de tejidos validados por exclusión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la operación de sistemas de análisis de alto contenido en campo amplio y en la navegación del software asociado.
- Depende de instrumentación capaz de escanear portaobjetos, adquirir en múltiples longitudes de onda y enfocar mediante láser e imágenes.
- Necesita la estandarización entre equipos de los parámetros de adquisición (por ejemplo, aumento, binning, ganancia) y de los protocolos para definir las regiones de interés.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes tipos de tejidos, expresiones de marcadores o espesores de portaobjetos.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de excluir manualmente sitios con artefactos (por ejemplo, imágenes fuera de foco, pliegues en el tejido, burbujas), a pesar de la adquisición automatizada.
