Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

El objetivo general de este nuevo ensayo de hibridación in situ de ARN es visualizar moléculas individuales de ARN en un área específica del cerebro que son críticas para aclarar la disfunción dopaminérgica durante la enfermedad del sistema nervioso central. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como las anomalías dopaminérgicas, la mediación de las respuestas conductuales y la modulación de la función de la memoria de trabajo. La principal ventaja de este método es que proporciona una novedosa técnica de hibridación in situ para investigar la disfunción del sistema dopaminérgico durante la progresión de las enfermedades del sistema nervioso central.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los niveles generales de expresión de un ARNm objetivo en una región cerebral determinada, también se puede aplicar para determinar cómo se distribuyen las transcripciones de ARNm en las células de una región determinada. Para comenzar este procedimiento, dentro de los cinco minutos posteriores a la recolección del cerebro de una rata adulta, sumérjalo en nitrógeno líquido durante 15 segundos. A continuación, equilibra el cerebro a menos 20 grados centígrados en un criostato durante una hora.

Después de una hora, corte secciones de 30 micras que contengan núcleo accumbens de 2,76 milímetros a 2,28 milímetros anteriores al bregma y móntelas en los portaobjetos. A continuación, seca las secciones a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, sumerja los portaobjetos en paraformaldehído al 4% preenfriado durante una hora a cuatro grados centígrados.

A continuación, coloque los portaobjetos en un gradiente de etanol creciente a temperatura ambiente y luego transfiera los portaobjetos a etanol fresco al 100% durante otros cinco minutos. Después, coloca los portaobjetos sobre el papel absorbente para dejar que se sequen al aire. Dibuja una barrera alrededor de cada sección con un rotulador barrera.

Deje que la barrera se seque completamente durante un minuto. Para pretratar las secciones del cerebro, encienda el horno y ajuste la temperatura a 40 grados centígrados. Agregue tres gotas de reactivo de pretratamiento en cada sección del cerebro.

A continuación, incubar las secciones durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, sumerja los portaobjetos en 1X PBS durante un minuto a temperatura ambiente y transfiera los portaobjetos a 1X PBS nuevo durante otro minuto. Las diapositivas no deben permanecer en 1X PBS durante más de 15 minutos.

Para ejecutar el ensayo multiplex, caliente la sonda objetivo durante 10 minutos a 40 grados centígrados en un baño de agua y luego enfríe a temperatura ambiente. Coloque el reactivo de ARN a temperatura ambiente. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos.

A continuación, añada tres gotas de Drd1alpha como sonda en cada corte de muestra e incube las muestras durante dos horas a 40 grados centígrados. Después, lave los portaobjetos en un tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. A continuación, retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos.

No permita que las secciones del cerebro se sequen entre las etapas de incubación. Agregue tres gotas de AMP 1FL en cada corte de muestra e incube las muestras durante 30 minutos a 40 grados centígrados. Después, lave los portaobjetos dos veces en tampón de lavado 1X durante dos minutos cada vez a temperatura ambiente.

A continuación, retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos. Posteriormente, agregue tres gotas de AMP 2FL en cada porción de muestra. Incubar las muestras durante 15 minutos a 40 grados centígrados.

A continuación, sumerja los portaobjetos en el tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos. Agregue tres gotas de AMP 3FL en cada corte de muestra e incube las muestras durante 30 minutos a 40 grados centígrados.

A continuación, lave los portaobjetos en un tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos. A continuación, añada tres gotas de AMP 4FL ALT A en cada rebanada de muestra e incube las muestras durante 15 minutos a 40 grados centígrados.

Lave el portaobjetos en un tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos e inmediatamente coloque dos gotas de reactivo de montaje en cada sección. A continuación, coloque un cubreobjetos de 22 milímetros por 22 milímetros sobre cada sección del cerebro.

Luego, guarde los portaobjetos en la oscuridad a una temperatura de dos a ocho grados centígrados hasta que se sequen. Para la obtención de imágenes, encienda el microscopio confocal y cambie a un objetivo de 60X. Obtenga imágenes de la pila Z y adquiera imágenes de células marcadas con Drd1alpha en la región del núcleo accumbens.

Para las imágenes del núcleo accumbens que mostraban el patrón de tinción de puntos discretos, el rango dinámico de expresión se evaluó mediante un análisis semicuantitativo. Cada celda se puntuó de cero a nueve en función del número de puntos por celda. Por lo tanto, este método de puntuación de señal hibridada puede evaluar el alcance y la variabilidad de la expresión de Drd1alpha en células individuales.

Aquí están las imágenes confocales representativas de la expresión de Drd1alpha en ratas macho y hembra que tienen el patrón de tinción de puntos discretos. Para tener en cuenta la estructura de datos anidada, se calcularon los valores de recuento promedio para cada categoría y se utilizaron para el análisis estadístico. Se realizó una prueba U de Mann-Whitney para evaluar las diferencias en el recuento medio de células en ratas macho y hembra.

La frecuencia de las celdas de cada categoría se analiza utilizando la frecuencia relativa y la frecuencia acumulativa. Las hembras mostraron un cambio significativo en la distribución, con la mayor frecuencia de células en categorías de orden inferior en relación con los machos. En general, los resultados sugieren claras diferencias sexuales en la expresión de Drd1alpha en el núcleo accumbens.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en siete horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar rápidamente, ya que los cambios de temperatura o la desecación del tejido pueden dañar el ARNm y dificultar nuestra capacidad para obtener una señal confiable. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la técnica de hibridación in situ en tejidos corticales, obtener imágenes fluorescentes de transcripciones de ARNm de señales dentro de las regiones cerebrales elegidas y caracterizar la distribución de transcripciones de ARNm para el análisis estadístico.