Name: Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende una técnica innovadora de hibridación in situ de ARN para visualizar moléculas individuales de Drd1alpha en el núcleo accumbens de ratas. Este método revela diferencias sexuales en la expresión del receptor de dopamina D1-alfa.

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Los presentes trabajos fueron apoyados por los institutos nacionales de subvenciones de salud (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624. Fondo parcial fue proveído por una beca de formación de NIH T32 en ciencia biomédica y de conducta.

El protocolo experimental fue aprobado por el cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: A3049-01).
1. preparación de secciones del cerebro congelado fresco
<ol><li>Utilizar la cepa de ratas de F344/N: tres ratas de cada sexo, 13 meses de edad, aproximadamente 320 g del peso del cuerpo.</li>
	<li>Ajustar la concentración de sevoflurano al 5% (sobredosis de sevoflurano). Continúa exposición de sevoflurano después detiene por un minuto adicional.</li>
	<li>Decapitar a la rata y quitar el cerebro.</li>
	<li>Sumergir el cerebro de la rata en nitrógeno líquido durante 15 s a 5 min de la cosecha de tejido.</li>
	<li>Equilibrar el cerebro a-20 ° C en un criostato para 1 h.</li>
	<li>Cortar 30 μm secciones y transferir a diapositivas (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Elegir las secciones de la región de accumbens del núcleo, aproximadamente 2,76 mm a 2,28 mm anterior Bregma14.</li>
	<li>Cortar continuamente el cerebro de la rata del bulbo olfatorio a través de la región de accumbens del núcleo según la estructura de estereotáctica cerebral de la rata.</li>
	<li>Montaje de muestras en las diapositivas. Mantener las secciones a-20 ° C por 10 min secar.</li>
	<li>Inmediatamente sumerja los portaobjetos en el pre enfriado paraformaldehído al 4% durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en un gradiente creciente de etanol a temperatura ambiente (RT): 50% EtOH por 5 min; 70% EtOH por 5 min; y 100% EtOH durante 5 minutos.</li>
	<li>Repita con fresco 100% EtOH.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en un papel absorbente y secar al aire.</li>
	<li>Dibujar una barrera alrededor de cada sección con un lápiz de la barrera (véase Tabla de materiales). Deje que se seque completamente durante 1 min la barrera.</li>
</ol>2. pretratamiento de las secciones de la cerebral
<ol><li>Encender el horno y la temperatura a 40 ° C.</li>
	<li>Añadir 3 gotas (90 μl) del reactivo 4 pretratamiento (véase Tabla de materiales) en cada sección del cerebro (una parte por diapositiva).</li>
	<li>Incubar las secciones por 30 min a TA.</li>
	<li>Sumerja los portaobjetos de 1 x PBS durante 1 min a RT. repetir con frescos de 1 x PBS. Nota: Los portaobjetos no deben permanecer en PBS 1 x durante más de 15 minutos.</li>
</ol>3. ARN In Situ hibridación fluorescente Multiplex ensayo
<ol><li>Caliente la punta de prueba del objetivo por 10 min a 40 ° C en un baño de agua y luego enfriar a RT.</li>
	<li>Colocar el reactivo RNA (por ejemplo, Amp FL 1-4) a TA.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido de portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir 3 gotas (90 μl) de sonda Drd1α (C1) en el segmento de muestra. Incubar por 2 h a 40 ° C.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 1-FL en el segmento de muestra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos en el tampón de 1 lavado por 2 min en RT. repetir con el almacenador intermediario fresco 1wash.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 2-FL en el segmento de muestra. Incubar por 15 min a 40 ° C.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir 3 gotas (90 μl) de 3 Amp-FL en el segmento de muestra. Incubar durante 30 min a 40 ° C.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 min a RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y coloque nuevamente sobre la parrilla corrediza (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir 3 gotas (90 μl) de Amp 4-FL-Alt A en el segmento de muestra. Incubar por 15 min a 40 ° C.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos en el 1 x de tampón de lavado durante 2 minutos en RT. repetir con fresco 1 x de tampón de lavado.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido de diapositivas e inmediatamente Coloque 2 gotas de reactivo de montaje (véase Tabla de materiales) en cada sección.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos de 22 mm 22 mm (véase Tabla de materiales) en cada sección del cerebro.</li>
	<li>Almacenar diapositivas en la oscuridad a 2-8 ° C hasta que se seque.</li>
	<li>Encienda el microscopio confocal y cambiar a un objetivo X 60.</li>
	<li>Obtener imágenes Z-stack con un microscopio confocal. Ver el video suplementario para un procedimiento de detalle de la proyección de imagen confocal.</li>
	<li>Adquisición de imágenes de Drd1α etiquetado de células en la región de accumbens del núcleo (excitación: 488 nm; Emisión: 515/30 nm). Nota: No deje que el cerebro las secciones secan entre pasos de incubación.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Semi-cuantitativamente analizar el patrón de tinción: "puntos discretos".<ol>
<li>Para identificar la celda individual de la imagen, realizar tinción DAPI como marcador nuclear. Sin embargo, es todavía difícil de analizar ciertas partes del tejido cerebral ya que cuenta con varios tipos de células con forma irregular de los núcleos o células. Aquí, dos investigadores experimentados asignan por separado cada célula de imágenes para definir la región de la célula.</li>
		<li>Marcar visualmente cada célula dentro de las imágenes confocales representativas basadas en el número de puntos por celular usando los criterios específicos (figura 1B).</li>
		<li>Determinar el número total de células en cada categoría y dividir por el número total de la célula x100 para crear gráficos de frecuencia relativa que muestra la frecuencia porcentual de células dentro de cada categoría para todas las secciones de tejido (figura 2A) y para machos y hembras por separado (Figura 2E).</li>
		<li>Dividir la suma de las células en todas las categorías anteriores por el número total de la célula x100 para determinar la frecuencia acumulativa de las células para todas las secciones de tejido (figura 2B) y para machos y hembras por separado (figura 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar estadísticamente los "puntos discretos" (opcional) del patrón de coloración.<ol>
<li>Examinar el número de puntos por la célula para proporcionar una variable categórica que es ordinal en naturaleza (es decir, el número de células que caen en cada categoría de fila de menor expresión de células (1) a la más alta expresión de la célula (9)) para más análisis estadísticos.</li>
		<li>Tras un examen de estadística descriptiva, usar tres enfoques principales: una estadística de Mantel-Haenszel, una prueba U de Mann-Whitney y una prueba de Kruskal-Wallis. Aunque el enfoque estadístico exacto dependerá la pregunta de investigación y diseño experimental de interés, un árbol de decisión estadística (figura 4) puede ayudar en la toma de decisiones con respecto a su enfoque analítico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificar la intensidad de la señal en la región de interés (ROI) para el patrón de tinción: "clusters".<ol>
<li>Calcular la intensidad de la señal de cada imagen utilizando la siguiente ecuación: Intensidad de la señal = intensidad Total de ROI imagen - (fondo media intensidad × imagen Total área)</li>
		<li>Contar el número total de células dentro de la imagen ROI para calcular la expresión aproximada de la señal por la célula. Grupo diferencias en intensidad de señal e imágenes así como el número de células, imagen pueden ser de interés considerar mecanismos que pueden contribuir a las diferencias de grupo en señal expresión celular (figura 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar estadísticamente los "clusters" (opcional) del patrón de coloración.<ol>
<li>Examinar la expresión/célula de la señal para proporcionar una variable continua para su posterior análisis estadístico. Uso dos enfoques, incluyendo una prueba t de muestras independientes y análisis de varianza (ANOVA), basado en el número de factores entre sujetos incluidos en el diseño. Un árbol de decisión estadística (figura 4) puede ayudar en la toma de decisiones sobre el enfoque estadístico más adecuado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

Hay no hay conflictos de intereses.

En este protocolo, describimos una nueva técnica de hibridación en situ para rebanadas de cerebro congelado evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la expresión de tirosina hidroxilasa (TH) en la región de nigra del substantia (SNR). También ofrecemos métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: "punto discreto" o "clusters".
Los pasos críticos para un ensayo de fluorescencia multiplex éxito RNA en situ hibridación están inc...

Disfunción del sistema de dopamina estriatal está implicada en la progresión de los síntomas clínicos observados en múltiples enfermedades neurocognitivas. Los receptores D1 de dopamina están presentes en la corteza prefrontal (PFC) y regiones estriadas del cerebro y fuertemente influyen en procesos cognitivos1, incluyendo memoria, el procesamiento temporal y comportamiento locomotor2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. estudios anteriores aclaran que los cambios de los receptores de dopamina D1 se asocian con la progresión de atención e hiperactividad déficit trastorno (TDAH)8, los síntomas neurocognitivos en la esquizofrenia9, 10 y estrés sensibilidad11. Específicamente, en la esquizofrenia, estudios de tomografía por emisión de positrones (PET) indican que la capacidad de unión de los receptores D1 de dopamina en las cortezas prefrontales muy fue relacionado con déficit cognoscitivo y la presencia de síntomas negativos11. El crecimiento dendrítico de las neuronas excitatorias de la corteza prefrontal, regulado por el receptor de dopamina D1 alivia la susceptibilidad al estrés biológico. Además, la caída del receptor D1 en las neuronas corticales prefrontal medial (mPFC) podría mejorar la derrota social evitación social inducida por estrés12.
Aquí, presentamos una nueva técnica de RNA en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en una célula con las muestras de tejido fresco congelado. La presente técnica tiene varias ventajas sobre los métodos que existen en la literatura actual. En primer lugar, el procedimiento actual conserva el contexto espacial y morfológico de los tejidos y se realizó en muestras de tejido fresco congelado para que otros procedimientos que requieren la fresca, los tejidos no incrustados pueden combinarse con los métodos actuales. Procedimientos similares en los tejidos fijados con formol y embebido en parafina han ilustrado que resolución de transcripción solo se puede conseguir usando una RNA en situ hibridación técnica13. Detección de RNA en el nivel de transcripción solo ofrece una sensibilidad superior a baja copia número expresión así como la oportunidad de comparar la expresión génica a nivel de células individuales que no pueden lograrse por otros métodos de detección de ácidos nucleicos, como técnicas de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Además, el método actual mantiene imágenes con un alto cociente signal-to-noise a través de sondas muy específicas de RNA que son hibridadas de las transcripciones del RNA solo objetivo y secuencialmente vinculadas con una cascada de moléculas de amplificación de señal en la detección sistema. Finalmente, la tecnología actual ofrece la oportunidad de evaluar varios sistemas biológicos con sus sondas propietarias específico del destino, en lugar de limitar nuestra investigación a sólo una clase de marcadores relacionados con el sistema tales como la detección de proteínas por métodos de inmunohistoquímica.
En nuestro estudio, utilizamos esta novela RNA en situ hibridación para evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la tirosina hidroxilasa (TH) expresión en el nigra del substantia (SNR) de ratas de F344/N machos y hembras. La innovadora RNA en situ hibridación nos permitió investigar los mecanismos que influyen en la absorción DA y DA liberación simultáneamente, mejorando nuestra comprensión de la complejidad del sistema estriado DA. Aquí, describimos el procedimiento para el cerebro congelado rodajas y proporcionar métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: "punto discreto" o "clusters".

<table><tbody><tr><td>Sistema de horno HybEZ</td><td>Diagnóstico celular avanzado&nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de ARNscope - Rn-DRD1A</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado&nbsp;</td><td>317031</td><td>Canal de color 1,</td></tr><tr><td>sonda de ARNscope verde - Rn-Th-C2</td><td>Diagnóstico celular avanzado&nbsp;</td><td>314651-C2 Canal de</td><td>color 2,</td></tr><tr><td>kit de reactivos multiplex fluorescente de ARNscope</td><td>naranja para diagnóstico celular avanzado&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pluma de barrera hidrofóbica</td><td>Laboratorio de vectores</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Diapositivas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek vertical 24 portaobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>plato de tinción Tissue-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Baños de uso general de precisión</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Pretratamiento 4</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado&nbsp;</td><td>320850</td><td>partes de los kits</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>partes de los kits</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>partes de kits</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>partes de kits</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>partes de kits</td></tr><tr><td>Paquete de software EZ-C1</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>versión 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td> <td>versión 9.4</td></tr></tbody></table>

identificación del receptor de dopamina d1-alfa en roedores núcleo accumbens por una innovador arn in situ la tecnología de detección

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

En el sistema nervioso central, el receptor del subtipo de D1-alfa (Drd1α) es el receptor más abundante de dopamina (DA), que desempeña un papel vital en la regulación del desarrollo y el crecimiento neuronal. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a las anormalidades del receptor Drd1α mediar las respuestas del comportamiento y la modulación de la función de memoria de trabajo aún no están claros. Usando un análisis nuevo RNA en situ el hibridación, el estudio actual identificado dopamina Drd1α del receptor y la tirosina hidroxilasa (TH) RNA expresión de circuitos relacionados con la DA en el Núcleo accumbens (NAc) área y región de nigra del substantia (SNR), respectivamente. Expresión de Drd1α en el NAc muestra un "punto discreto" patrón de tinción. Se observaron diferencias de sexo claro en la expresión de Drd1α. Por el contrario, TH muestra un patrón de coloración "cluster". En cuanto a la expresión de TH, ratas hembra muestran una mayor expresión de la señal por la célula en relación con los animales masculinos. Los métodos presentados aquí ofrecen una técnica novedosa en situ hibridación para investigar cambios en la disfunción del sistema dopamina durante la progresión de enfermedades del sistema nervioso central.

El presente estudio observó un "puntos discretos" patrón para la expresión de RNA en los receptores de la dopamina D1-alfa (Drd1α) de coloración del NAc en ratas de F344/N (figura 1A). Las señales de fluorescencia individual fueron identificadas fácilmente y pueden ser vistas como solo "puntos," cada uno de los cuales representa una sola transcripción RNA dentro de la célula. Imágenes del NAc que muestran los "puntos discretos" patrón de tinción, determinamos...

Identificación del receptor de dopamina D1-alfa en el Núcleo accumbens es fundamental para clarificar la disfunción del receptor D1 durante una enfermedad del sistema nervioso central. Se realizó un análisis para un RNA nuevo en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en un área específica del cerebro.

Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

El objetivo general de este nuevo ensayo de hibridación in situ de ARN es visualizar moléculas individuales de ARN en un área específica del cerebro que son críticas para aclarar la disfunción dopaminérgica durante la enfermedad del sistema nervioso central. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como las anomalías dopaminérgicas, la mediación de las respuestas conductuales y la modulación de la función de la memoria de trabajo. La principal ventaja de este método es que proporciona una novedosa técnica de hibridación in situ para investigar la disfunción del sistema dopaminérgico durante la progresión de las enfermedades del sistema nervioso central.Aunque este método puede proporcionar información sobre los niveles generales de expresión de un ARNm objetivo en una región cerebral determinada, también se puede aplicar para determinar cómo se distribuyen las transcripciones de ARNm en las células de una región determinada. Para comenzar este procedimiento, dentro de los cinco minutos posteriores a la recolección del cerebro de una rata adulta, sumérjalo en nitrógeno líquido durante 15 segundos. A continuación, equilibra el cerebro a menos 20 grados centígrados en un criostato durante una hora.Después de una hora, corte secciones de 30 micras que contengan núcleo accumbens de 2,76 milímetros a 2,28 milímetros anteriores al bregma y móntelas en los portaobjetos. A continuación, seca las secciones a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, sumerja los portaobjetos en paraformaldehído al 4% preenfriado durante una hora a cuatro grados centígrados.A continuación, coloque los portaobjetos en un gradiente de etanol creciente a temperatura ambiente y luego transfiera los portaobjetos a etanol fresco al 100% durante otros cinco minutos. Después, coloca los portaobjetos sobre el papel absorbente para dejar que se sequen al aire. Dibuja una barrera alrededor de cada sección con un rotulador barrera.Deje que la barrera se seque completamente durante un minuto. Para pretratar las secciones del cerebro, encienda el horno y ajuste la temperatura a 40 grados centígrados. Agregue tres gotas de reactivo de pretratamiento en cada sección del cerebro.A continuación, incubar las secciones durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, sumerja los portaobjetos en 1X PBS durante un minuto a temperatura ambiente y transfiera los portaobjetos a 1X PBS nuevo durante otro minuto. Las diapositivas no deben permanecer en 1X PBS durante más de 15 minutos.Para ejecutar el ensayo multiplex, caliente la sonda objetivo durante 10 minutos a 40 grados centígrados en un baño de agua y luego enfríe a temperatura ambiente. Coloque el reactivo de ARN a temperatura ambiente. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos.A continuación, añada tres gotas de Drd1alpha como sonda en cada corte de muestra e incube las muestras durante dos horas a 40 grados centígrados. Después, lave los portaobjetos en un tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. A continuación, retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos.No permita que las secciones del cerebro se sequen entre las etapas de incubación. Agregue tres gotas de AMP 1FL en cada corte de muestra e incube las muestras durante 30 minutos a 40 grados centígrados. Después, lave los portaobjetos dos veces en tampón de lavado 1X durante dos minutos cada vez a temperatura ambiente.A continuación, retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos. Posteriormente, agregue tres gotas de AMP 2FL en cada porción de muestra. Incubar las muestras durante 15 minutos a 40 grados centígrados.A continuación, sumerja los portaobjetos en el tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos. Agregue tres gotas de AMP 3FL en cada corte de muestra e incube las muestras durante 30 minutos a 40 grados centígrados.A continuación, lave los portaobjetos en un tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos con papel absorbente y vuelva a colocarlos en la rejilla de portaobjetos. A continuación, añada tres gotas de AMP 4FL ALT A en cada rebanada de muestra e incube las muestras durante 15 minutos a 40 grados centígrados.Lave el portaobjetos en un tampón de lavado 1X durante dos minutos a temperatura ambiente dos veces. Retire el exceso de líquido de los portaobjetos e inmediatamente coloque dos gotas de reactivo de montaje en cada sección. A continuación, coloque un cubreobjetos de 22 milímetros por 22 milímetros sobre cada sección del cerebro.Luego, guarde los portaobjetos en la oscuridad a una temperatura de dos a ocho grados centígrados hasta que se sequen. Para la obtención de imágenes, encienda el microscopio confocal y cambie a un objetivo de 60X. Obtenga imágenes de la pila Z y adquiera imágenes de células marcadas con Drd1alpha en la región del núcleo accumbens.Para las imágenes del núcleo accumbens que mostraban el patrón de tinción de puntos discretos, el rango dinámico de expresión se evaluó mediante un análisis semicuantitativo. Cada celda se puntuó de cero a nueve en función del número de puntos por celda. Por lo tanto, este método de puntuación de señal hibridada puede evaluar el alcance y la variabilidad de la expresión de Drd1alpha en células individuales.Aquí están las imágenes confocales representativas de la expresión de Drd1alpha en ratas macho y hembra que tienen el patrón de tinción de puntos discretos. Para tener en cuenta la estructura de datos anidada, se calcularon los valores de recuento promedio para cada categoría y se utilizaron para el análisis estadístico. Se realizó una prueba U de Mann-Whitney para evaluar las diferencias en el recuento medio de células en ratas macho y hembra.La frecuencia de las celdas de cada categoría se analiza utilizando la frecuencia relativa y la frecuencia acumulativa. Las hembras mostraron un cambio significativo en la distribución, con la mayor frecuencia de células en categorías de orden inferior en relación con los machos. En general, los resultados sugieren claras diferencias sexuales en la expresión de Drd1alpha en el núcleo accumbens.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en siete horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar rápidamente, ya que los cambios de temperatura o la desecación del tejido pueden dañar el ARNm y dificultar nuestra capacidad para obtener una señal confiable. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la técnica de hibridación in situ en tejidos corticales, obtener imágenes fluorescentes de transcripciones de ARNm de señales dentro de las regiones cerebrales elegidas y caracterizar la distribución de transcripciones de ARNm para el análisis estadístico.

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Este video muestra la implantación de electrodos y cánulas en una rata anestesiada para medir la liberación de dopamina en el núcleo accumbens utilizando un potenciostato y la infusión de fármacos para modular la actividad dopaminérgica en el área tegmental ventral.

Monitorización de la liberación de dopamina en un modelo de rata con manipulación del receptor de neuronas dopaminérgicas VTA

Este video demuestra la detección de la síntesis de ARN del receptor de serotonina utilizando sondas de oligonucleótidos en tejido cerebral de rata afectado por el síndrome de serotonina. El protocolo incluye pretratamiento de tejidos, hibridación de sondas y detección enzimática para visualizar y cuantificar la expresión del ARN del receptor de serotonina bajo un microscopio.

Hibridación in situ mediante sondas de oligonucleótidos para estudiar la expresión de ARN en secciones de cerebro de rata

El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en Drosophila melanogaster

El aislamiento de las neuronas de dopamina individuales o el área tegmental ventral con inmunohistoquímica directa o indirecta se demuestra utilizando láser captura microdissection. Se discuten los parámetros para el aislamiento de tejido de un portaobjetos de vidrio usando un láser de infrarrojos y a partir de diapositivas membrana utilizando la combinación de un láser infrarrojo y ultravioleta.

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situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

En la enfermedad de Parkinson (EP), Sustancia negra (SNC) se degeneran las neuronas dopaminérgicas, que conduce a la disfunción motora. Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón expresan EGFP impulsada por una secuencia promotora tirosina hidroxilasa (TH), cosechando las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma utilizando ARN-ss.

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

Aquí, presentamos un protocolo para la visualización, detección, análisis y seguimiento del tráfico endógeno de ARNm en cámara de óvulos Drosophila melanogaster en vivo utilizando balizas moleculares, microscopía confocal de disco giratorio y análisis de código abierto Software.

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Aquí presentamos un método automatizado para la determinación semicuantita cuantitativa del número de neuronas dopaminérgicas en el compacta de las igualdades del nigra del substantia de la rata.

Determinación Semicuantita cuantitativa de la densidad de la neurona dopaminérgica en la sustancia negra de modelos de roedores utilizando el análisis automatizado de imágenes

Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

Este estudio presenta un método robusto para aislar ARNm axonales utilizando inserciones de membrana porosas, permitiendo la separación total de neuronas frente a neuritas y la purificación de ARN. Combinado con RTddPCR, el enfoque permite la cuantificación absoluta de transcritos de baja copia, facilitando estudios sobre el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad, reproducibilidad y amplia aplicabilidad experimental.

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

Aprende una técnica innovadora de hibridación in situ de ARN para visualizar moléculas individuales de Drd1alpha en el núcleo accumbens de ratas. Este método revela diferencias sexuales en la expresión del receptor de dopamina D1-alfa.

Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección (Video) | JoVE Journal

Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

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